金针虫是叩甲(鞘翅目Coleoptera叩甲科Elateridae)幼虫的通称，广布于世界各地，危害农作物、林木及牧草等，是一类极为重要的地下害虫。筛胸梳爪叩甲(Melanotus cribricollis)是浙江笋用林内的优势种群，其幼虫(即金针虫)是笋期主要害虫之一，在湖州地区德清和安吉、杭州地区余杭和临安等重要竹区的早园竹(Phyllostachys praecox)林中，鲜笋带虫率可达62%，种笋受害率更是高达80%以上，严重制约了当地竹产业的健康发展(徐天森，2004)，造成了巨大的经济损失。同时害虫防治中大量使用化学农药又对竹笋的食用安全构成了严重威胁。因此，安全、高效、环境友好的竹林金针虫防治方法的研究尤为重要。平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)菌株wp08是本实验室从筛胸梳爪叩甲幼虫僵虫体上分离到的一株绿僵菌，室内毒力测定结果表明，在10⁷个·g^-1干土孢子浓度下，害虫校正死亡率达到100%，LT₅₀为13.89天(王鹏等，2010； 张亚波等，2012)。该菌株可能成为当前攻克竹林内筛胸梳爪叩甲幼虫无公害防治难题的突破口。

国外应用绿僵菌防治农田金针虫已展开了较多研究(Fox et al.，1958； Filipchuk et al.，1995； Kabaluk et al.，2005； Kabaluk et al.，2007； Kabaluk et al.，2007； Ansari et al.，2008)，国内关于绿僵菌防治金针虫的研究仅限本实验室对竹林金针虫的几篇相关报道(王鹏等，2010； 张亚波等，2012； 吴盼盼等，2013)。以上研究仅围绕菌株筛选、毒力测定以及初步的田间防效试验等方面，目前尚未见到绿僵菌分生孢子对金针虫侵染过程的相关报道。

有研究认为虫生真菌对昆虫的致病力与孢子的大小、萌发速度及其在昆虫体壁的附着能力有关(Altre et al.，1999； Vega et al.，1999)。因此， 不同学者研究了绿僵菌分生孢子在不同昆虫体表附着、萌发和入侵的过程以探求绿僵菌对昆虫的致病力(王音等，2005； 王达等，2010； 李茂业等，2011)。筛胸梳爪叩甲幼虫体壁坚硬而光滑，其独特的体表结构不同于已报道的其他寄主，致死速度较慢，但室内致死率仍可达100%。鉴于绿僵菌侵染筛胸梳爪叩甲幼虫的方式和途径尚不清楚，本研究以平沙绿僵菌wp08菌株为研究材料，通过对筛胸梳爪叩甲幼虫侵染过程的定期取样，利用扫描电镜观察分生孢子在筛胸梳爪叩甲幼虫虫体的附着部位、孢子萌发、侵入时间和侵入方式，为揭示平沙绿僵菌侵染筛胸梳爪叩甲幼虫的途径、过程及机制提供直观的依据。

平沙绿僵菌菌株wp08，由本实验室从筛胸梳爪叩甲幼虫(即金针虫)僵虫上分离，已提交至中国科学院微生物菌种保藏中心专利保存(保藏号CGMCC No.4226)。

筛胸梳爪叩甲于2011年4月在浙江德清早园竹林采集，中国林业科学研究院亚热带林业研究所养虫室内饲养，试验前24 h移至25 ℃ 培养箱(QHX-Ⅲ，上海新苗医疗器械制造有限公司)中黑暗培养，筛选出大小一致、健康活跃的幼虫作为供试虫体。

将平沙绿僵菌菌株wp08在PPDA(Potato peptone dextrose agar)(张永军等，2001)培养基中培养至完全产孢后，刮取分生孢子，用0.1% 吐温80的无菌水润湿，磁力搅拌器搅拌均匀，经血球计数板测定孢子悬浮液浓度，调整至10⁸ 个·mL^-1。

采用虫体直接浸蘸法，将大小一致的竹林筛胸梳爪叩甲幼虫放于盛有平沙绿僵菌孢子悬浮液中浸蘸5 s，待虫体晾干后，放入灭菌的蛭石中，喂养新鲜的玉米幼嫩根茎，在人工气候箱中25 ℃、RH85％条件下培养。每隔6 h取样1次，直至菌丝穿出筛胸梳爪叩甲幼虫体壁。

样品用2.5％的戊二醛和1％锇酸固定，0.1 mol·L^-1、pH7.0的磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。50％，70％，80％，95％，100％酒精逐级脱水，每级30 min。乙醇与乙酸异戊酯混合液(V/V=1/1)处理30 min，乙酸异戊酯处理1~2 h，临界点干燥(Hitachi HCP-2 critical point dryer)，真空喷镀仪(Eiko IB5 ion coater)喷金镀膜。日立TM-1000型扫描电镜观察、拍照。

筛胸梳爪叩甲幼虫不同部位的体壁外形结构差别较大，因此平沙绿僵菌在体壁的附着情况也不同。分生孢子分布密度最大的部位是胸足的节间膜、足末端等处(图 1A，B，C)； 其次为腹部的节间膜、褶皱处，该处组织相对柔软，利于孢子的附着和侵染(图 1D)； 毛孔、沟、缝等角质层相对薄弱的部位较少(图 1E，F，G)； 虫体的光滑坚硬部位孢子的分布量最少(图 1H，I)。

	图 1 寄主体表不同结构区绿僵菌孢子的附着情况 Fig. 1 Adherence of the spores of M.pingshaense on different parts of the host surface A，B，C： 胸足的节间膜、足末端The sections between the conjunctiva of thoracic leg and the end of leg； D： 腹部区域The abdomen area； E，F，G： 毛孔、沟缝处The alveoluses and groove joints； H，I： 虫体光滑区域The smooth parts of the surface.

从扫描电镜观察，平沙绿僵菌侵染筛胸梳爪叩甲幼虫，可由分生孢子萌发的芽管直接侵入体壁，也可以产生附着胞后再侵入。接种后12 h，平沙绿僵菌的孢子大量附着于虫体表面，极个别孢子已经萌发，在孢子一端出现芽状突起(图 2A)； 接种后18 h，小部分孢子已经萌发，多数以芽管形式直接穿透体壁，部分产生附着胞结构，紧贴着体壁上，末端侵入体表(图 2B，C)； 24 h后，芽管继续伸长，寻找适宜侵入点，末端膨大形成附着胞(图 2D)。30~36 h时，在未找到侵入点时芽管可以形成菌丝在体表横向生长，在褶皱处可见附着胞穿透筛胸梳爪叩甲幼虫体壁(图 2E，F)，观察中发现在附着胞或芽管周围有粘液状物质产生，使得菌体表面凹凸不平； 36~96 h，侵入筛胸梳爪叩甲幼虫体腔的菌丝，吸收虫体内的营养物质，大量繁殖菌丝，直至体腔内完全被菌丝充满，最后突破体壁，最先在足窝处长出白色菌丝(图 2G)； 120 h时，菌丝上已经开始萌生分生孢子梗和新的分生孢子，虫体表面逐渐布满墨绿色分生孢子(图 2H，I)。平沙绿僵菌分生孢子侵染筛胸梳爪叩甲幼虫过程包括分生孢子附着、孢子萌发、穿透体壁、寄主体内短菌丝(虫菌体)增殖、入侵组织器官、菌丝穿出体壁、产生分生孢子，侵染循环完成。平沙绿僵菌在筛胸梳爪叩甲幼虫体表产生的分 生孢子成熟后扩散并继续侵染其他寄主，形成再侵染；而对照处理的虫体完整，未见菌丝。

图 2 绿僵菌侵染筛胸梳爪叩甲幼虫体表过程 Fig. 2 Infection process of M.pingshaense on the wireworm A： 12 h 孢子出现芽状突起 Bud protrusions of the spores showed 12 h after inoculation； B，C： 18 h 牙状突起增大Bud protrusions increased further 12 h after inoculation； D： 24 h 附着胞形成Appressoriums formed 24 h after inoculation； E，F： 30~36 h 菌丝侵入虫体The mycelium began to invade the wireworms 30~36 h after inoculation； G： 96 h 菌丝突破虫体体壁 The cuticle was breakthroughed 96 h after inoculation; H，I： 120 h 虫体表面布满菌丝和孢子The surface of the worms was covered with white mycelia and conidia 120 h after inoculation

真菌的分生孢子与寄主昆虫建立寄生关系的前提是能成功附着于寄主昆虫的体壁，分生孢子附着于寄主昆虫表皮后不一定能建立寄生关系，还必须识别体壁营养是否适合其寄生及寄主体表细菌等物质的抑制作用(Smith et al.，1981； Lord et al.，2004； Maketon et al.，2007)，这是病原真菌能否成功地侵染寄主和完成生活史的关键。平沙绿僵菌分生孢子接种筛胸梳爪叩甲幼虫后12 h即有极个别孢子已经萌发出现芽状突起，直至120 h虫体表面逐渐布满墨绿色分生孢子，其在筛胸梳爪叩甲幼虫体壁上完成了一个生活史，但电镜观察显示绿僵菌分生孢子侵染筛胸梳爪叩甲幼虫各个过程并不十分统一，有的孢子萌发快，大部分几天后仍未萌发，通常在孢子聚集较多的地方，只有贴近体壁的分生孢子萌发，聚集成堆的萌发较少，这可能与孢子所处的位置有关。

绿僵菌对不同寄主或寄主昆虫的不同部位侵染能力有很大差别，Butt等(1995)通过研究比较绿僵菌对蚜虫和跳甲的入侵行为发现，寄主体壁对绿僵菌的萌发行为和为寄主的致病力有重要影响。王音等(2005)用绿僵菌侵染小菜蛾 7 h时孢子可见萌发迹象，10 h大量孢子萌发伸出芽管，向体壁穿透。本研究中平沙绿僵菌孢子接种后12 h个别孢子才出现萌发迹象，18 h小部分孢子萌发侵入虫体，萌发侵入时间相对较长，且在观察中发现附着在体表的孢子只有少部分萌发，大多数孢子一直没有萌发。这与该菌株对筛胸梳爪叩甲幼虫的致死中时较长也相符(王鹏等，2010)，说明筛胸梳爪叩甲幼虫体表结构坚硬光滑不利于孢子的萌发侵入，在绿僵菌与筛胸梳爪叩甲幼虫相互作用过程中，只有少数孢子在节间膜等相对较软的部位成功侵入。

昆虫病原真菌在入侵昆虫体壁的过程中，会分泌蛋白酶(proteinases)、几丁质酶(chitinase)、脂酶(lipase)等多种胞外水解酶类(Charnley et al.，1991)。通过诱导分泌的孢外蛋白酶类作用，分生孢子牢固地附着在昆虫体壁上。Wang等(2007)研究发现金龟子绿僵菌孢子表面的粘着蛋白(adhesin)MAD1基因，伴随孢子萌发，该基因表达水平逐渐增强。笔者在观察中发现孢子表面分泌一层粘状物质，可能是孢子在侵入过程中分泌的活性物质。

另外笔者发现，气门虽然作为筛胸梳爪叩甲幼虫体内与体外气体交换的重要通道，但是绿僵菌的分生孢子却不能附着于筛胸梳爪叩甲幼虫的气门上，也不能以此为侵入途径。王晓红等(2009)在研究白僵菌感染桑天牛时也观察到该现象，这可能与气门的结构及质地有关，气门密布刚毛且骨化而不利于孢子的侵入，也可能与筛胸梳爪叩甲幼虫在遇到外界侵染时的自我保护机制有关。