全面、系统地了解植物开花授粉生物学特性，既是进行植物生活史研究的前提，也是开展种质资源保存、利用及育种等相关研究的基础(Momose et al，1998; 关文灵等，2009)。锥栗(Castanea henryi)是我国南方重要的木本粮食树种，因其耐贮藏、果肉香甜可口、营养成分高而深受大家喜爱(范晓明等，2014)。锥栗主要分布于我国长江以南的丘陵与山地，长期以来处于野生或半野生状态。20世纪90年代，学者们开始对锥栗开展研究，但仅见雄花序形态、花粉萌发特性(唐静等，2013a； 杨斐翔等，2014； 田寿乐等，2013)等相关报道，而关于系统的授粉生物学特性方面的研究还未见报道。

本文以锥栗主栽品种之一的‘长芒子’为研究对象，从雌雄花(序)开放过程、花粉活力、柱头可授性、风媒传粉特性及繁育系统等方面开展锥栗开花授粉生物学特性研究，一方面旨在揭示锥栗开花物候、传粉机制及繁育系统，另一方面通过花粉活力和柱头可授性试验判断锥栗最佳授粉时间，为今后授粉树配置及杂交育种提供理论依据。

共设2个样地。 样地1位于湖南郴州汝城县土桥镇宽量村锥栗实验基地。试验地平均日照1 713 h，年均气温16.6 ℃，月均最高气温出现在7月，为25.6 ℃，年均无霜期273天，年均降水量1 547.1 mm。该样地土壤类型为红壤，四周开阔，主要用于锥栗风媒传粉特性及人工控制授粉试验研究。样地2位于湖南株洲田心区中南林业科技大学(株洲校区)锥栗实验基地。试验地属亚热带季风气候，四季分明，雨量充沛，年均气温18 ℃，年均无霜期286天。该样地主要进行石蜡切片、柱头可授性检测及花粉活力测定等室内试验的采样工作，同时进行人工控制授粉等室外观察试验。

供试材料为树龄7～9年生的锥栗‘长芒子’，其树形为开心形，树体生长良好、树势相对一致。

自混合花序萌动开始至雌花花期结束，2013年4月每隔3～4天取样1次，每次取结果枝上混合花序10个，用FAA固定液固定后于体视显微镜(MOTIC SMZ-168)下观察花部微形态结构，同时每个时期分别制成纵、横切面的连续石蜡切片，苏木精-曙红染色，Olympus数码生物显微镜(BX-51)观察摄影。自然条件下对即将开放的40个雌花挂牌，以柱头出现为开花第1天，连续数天定位观察记录，采用过氧化氢-联苯胺法(Dafni，1992)检测不同开花时期柱头的可授性。若柱头周围的反应液呈蓝色且产生气泡，说明柱头具有可授性，根据反应的剧烈程度判断柱头的可授性强弱。另外，每天用Canon G10数码相机对柱头拍照并记录发育情况。

随机选择即将开放的雄花序100个进行观察及标记，以雄蕊伸出萼片为开花第1天，直至雄花序脱落，观察记录其开放过程，并采用离体萌发法(Hee et al，2007)检测不同开花天数花粉的活力。于每天上午10:00 — 11:00采集相应天数的雄花序20根，用镊子轻轻取下雄蕊上的花药(避免花簇中的花药混入样品而影响试验结果)，并盛于培养皿中放在60 W白炽灯下烘烤12 h，然后装入小的广口瓶中备用。将花粉接种在琼脂1% +蔗糖10% + H₃BO₃ 0.05 g·L^-1培养基上35 ℃培养24 h，每份样品3次重复，每次重复观察6个视野，以花粉管长度大于花粉粒直径视为花粉萌发，生长出花粉管的花粉与总花粉数的比值为该时期下花粉的萌发率。

为研究锥栗的传粉全历程，采用重力玻片法，从锥栗雄花进入盛花期开始，把涂有凡士林的载玻片按东、南、西、北4个方位放置，每个位置布3片(下同)，由于样地1仅2014年5月12，13日未下雨，其余时间基本为上午天晴，下午13:00—19:00阵雨，因此以未下雨的18 h取样； 为研究锥栗传粉日进程，于5月12—13日，把涂有凡士林的玻片在4个方位接收花粉，采样间隔为2 h(夜间12 h)，同时实时用风速仪4300(Kestrel，美国)测定风速、温度、空气湿度的变化； 为研究锥栗花粉的空间分布特点，按2，5，10，15，20，30 m不同距离布片，花粉收集时间为24 h。所有载玻片取回后均在目镜为10×和物镜为20×的显微镜(Olympus CX-31)下检查花粉粒数。

根据锥栗雌花柱头可授性检测试验，在柱头自然授粉之前套袋，用10 cm × 6 cm羊皮纸将混合花枝的前段套住，套袋前用锋利的枝剪将花枝顶端及部分叶片截顶，留1～2个雌花不套袋用于观察雌花的发育状态。收集花粉后分6个处理进行人工控制授粉试验，收集的花粉均在授粉试验前测定其萌发率(唐静等，2013b)，授粉后半个月将纸袋拆除，8月底(种仁充实期)统计坐果率。

锥栗雌花形态分化过程随着春梢的抽生、伸长而完成，分化时期短而集中，仅需40天，单花分化约22天。根据对雌花的立体解剖及石蜡切片的观察，锥栗雌花大多为单花，偶见2或3朵形成的雌花簇，其分化过程可划分为4个时期，即: 雌花分化始期(原基分化期)、雌雄蕊发育期、柱头伸长期、开花期(图 1)。

图 1 锥栗雌花分化过程 Fig. 1 The female flower differentiation process of C. henryi 标尺Bars A, B, C: 200 μm; D: 500 μm; E, F, G: 50 μm; H: 100 μm.A-D: 雌花分化过程[A．雌雄蕊原基分化始期(PP．雌蕊原基； SCP．刺苞原基； SP．雄蕊原基)； B．雌雄蕊发育期；C．柱头伸长期； D．开花期]； E-H: 雌花分化过程中的雄蕊发育情况[E．雄蕊原基； F．雄蕊； G．成熟花粉囊(EN．药室内壁； EP．表皮层； ML．中层； MMC．花粉母细胞； T. 绒毡层)； H．小孢子单核期]； I - L: 雌花分化过程对应的外观形态图(I．雌雄蕊原基分化始期； J．雌雄蕊发育期； K．柱头伸长期； L．开花期)。 A-D: The female flower differentiation process [A. Initiation stage of stamen and pistil primordium differentiation (PP. Pistil primordia; SCP. Spiny cupula primordia; SP. Stamen primordia); B. Development period of stamen and pistil; C. Elongating stage of stigma; D. Anthesis]. E-H: Development of stamen in the female flower differentiation process [E. Stamen primordia; F. Stamen; G. Anther showing microspore mother cell (EN. Endothecium; EP. Epidermis; ML. Middle layers; MMC. Microspore mother cell; T. Tapetum); H. Anthers showing at the microspore stage]. I - L: The female flower morphology in the differentiation process (I. Initiation stage of stamen and pistil primordium differentiation; J. Development period of stamen and pistil; K. Elongating stage of stigma; L. Anthesis).

雌花分化始期(原基分化期): 随着完全混合花芽的萌发及花枝的伸长、展叶，雌花的分化开始出现。当雄花序出现9 ～ 11个、混合花序长度为0.5 ～ 0.7 cm时(4月上旬)，在混合花序轴基部发生1 ～ 3个突起，且苞片大，而其他部位的突起尖而突出(图 1I)，即为雌花簇分化始期。该时期可清晰见雌、雄蕊及刺苞原基(图 1A，E)，持续7天左右。

雌雄蕊发育期: 随着花序轴的生长，基部突起明显增大，呈半球形(图 1J)，并逐渐分化形成雌雄蕊(图 1B，F)，此期出现的高峰期为4月中旬。

柱头伸长期: 雌雄蕊形成后，雌花体积迅速增大(图 1K)，雌蕊中花柱与柱头生长迅速，花丝长度低于柱头(图 1C)，此时雄蕊中花药为花粉母细胞时期，可清晰见成熟花药四壁结构(图 1G)，该时期的集中分化点为4月底。

开花期: 以柱头伸出花朵生长点表面为雌花开花(图 1L，图 2A)，该时期最早出现在4月30日，分化盛期在5月初。雌花开放后，柱头发育迅速，花丝停止伸长生长(图 1D)，小孢子发育为单核期(图 1H)。

图 2 锥栗雌花、雄花序的开花动态 Fig. 2 Flowering dynamics of female flower and staminate catkin in C. henryi A - J: 雌花的开花动态(花后1～10天) A．开花后第1天，柱头聚拢，嫩绿色； B．开花后第2天，柱头聚拢，嫩绿色； C．开花后第3天，柱头聚拢，黄色； D．开花后第4天，柱头与花的中轴线呈15°，浅黄色； E．开花第5天，柱头与花的中轴线呈30°夹角，浅黄色； F．开花后第6天，柱头与花的中轴线呈30° ～ 40°夹角，白色； G．开花第7天，柱头与中轴线呈45°夹角，白色； H - J．开花后第8，9，10天，柱头与花的中轴线夹角>45°，乳白色，刺苞膨大。 K - T: 雄花序的开花动态(花后1～10天) K．开花后第1天，5%～20%花簇开放，雄蕊淡黄色，花序绿色； L．开花第2天， 20%～ 40%花簇开放，雄蕊淡黄色，花序绿色； M．开花后第3天，50%～80%花簇开放，雄蕊淡黄色，花序绿色； N．开花第4天，90%以上的花簇开花后，雄蕊黄色，花序黄绿色； O．开花第5天，花簇全部开放，雄蕊开始变黄褐色，花序开始变黄； P．开花后第6天，雄蕊开始脱落，整个花序变黄； Q．开花第7天，5%～10%雄蕊脱落，花序开始褐化； R．开花后第8天，10%～30%雄蕊脱落，整个花序褐化； S．开花第9天，30%～50%雄蕊脱落，整个花序褐化； T．开花后第10天，50%以上的雄蕊脱落，花序开始整体脱落。 A - J: Flowering dynamics of female flower (1 - 10 days after blooming) A. The first day after flowering, stigma combined, peak green; B. The second day after flowering, stigma combined, peak green; C. The third day after flowering, stigma combined, yellow; D. The fourth day after flowering, 15°between stigma and medial axis of flower, light yellow; E. The fifth day after flowering, 30°between stigma and medial axis of flower, light yellow; F. The sixth day after flowering, 30°-40°between stigma and medial axis of flower, white; G. The seventh day after flowering, 45°between stigma and medial axis of flower, white; H - J. The eighth, ninth and tenth day after flowering, more than 45° between stigma and medial axis of flower, milkiness, spiny cupula inflated. K - T: Flowering dynamics of staminate catkins (1 - 10 days after blooming) K. The first day after flowering, 5% - 20% flower cluster open, light yellow stamen, green inflorescence; L. The second day after flowering, 20% - 40% flower cluster open, light yellow stamen, green inflorescence; M. The third day after flowering, 50% - 80% flower cluster open, light yellow stamen, green inflorescence; N. The fourth day after flowering, more than 90% flower cluster open, yellow stamen, yellowish green inflorescence; O. The fifth day after flowering, all flower cluster open, slight brown stamen, yellow inflorescence; P. The sixth day after flowering, stamen began to wither, yellow inflorescence; Q. The seventh day after flowering, 5%-10% stamen shedding, inflorescence browning; R. The eighth day after flowering, 10% - 30% stamen shedding, inflorescence browning; S. The ninth day after flowering, 30% - 50% stamen shedding, inflorescence browning; T. The tenth day after flowering, more than 50% stamen shedding, inflorescence shedding.

锥栗雌花开放过程形态特征观察见图 2A-J。在开花后第3天开始柱头具可授性，开花后4 ～ 6天柱头具有较强可授性，其中以第5天可授性最强，此时柱头与花的中轴线大致呈30°夹角，柱头呈现淡黄色(图 2E)。从开花第7天起，柱头可授性减弱，至开花后第10天时，刺苞明显增大，柱头呈现乳白色，不再具有可授性。因此，柱头可授性持续的时间为7天。

雄花序的生长随着芽的萌动及枝条伸长而生长，下端花序比上端花序发育快。锥栗雄花花期为4月底—5月下旬，群体花期23 ～ 26天，群体盛花期13 ～ 15天，单株花期15 ～ 20天，单个花序的开花时间为10 ～ 12天，其花序形态特征见图 2K-T。以花粉离体萌发率代表花粉活力(图 3)，锥栗雄花花粉活力开花6天内保持较高活力，以花后第4天活力最高，此时，90%以上的花簇开花，雄蕊黄色，花序黄绿色(图 2N)。之后，随着花序的褐化，花粉活力显著降低，雄蕊脱落，直至整个花序从树体上脱落。

	图 3 锥栗的花粉活力 Fig. 3 Pollen viability of C. henryi 不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下同。 The different lowercase letters indicate the significant difference at the level of P < 0.05. The same below.

锥栗种群散粉期为14 ～ 16天，其中集中传粉(传粉盛期)仅4天(图 4)。锥栗种群传粉第1天，空气中花粉数量较少，第3天花粉数量显著增多，第4天开始进入传粉盛期，连续4天接收到较大量的花粉，至第8天以后空气中花粉数量显著减少。

	图 4 锥栗盛花期花粉散出量的变化 Fig. 4 The change of amount of pollen grain scatteration of C. henryi in full-bloom stage

锥栗24 h内不同时间段接收到的花粉数量存在差异(图 5)。13:00以前，样地1的风速低(或无风)，随着空气温度的升高、空气湿度的降低，花粉通量逐渐增大； 13:00以后起风，花粉通量随着风速的增加而显著增加，至19:00时，虽然空气温度相对较低，然风速较高，花粉通量仍持续较高； 可能由于风吹的作用，19:00至次日7:00花粉通量保持一个较高水平。因此，影响锥栗传粉的主要气象因子是风速，温度和空气湿度对锥栗的传粉也有较大影响。

	图 5 锥栗传粉日进程 Fig. 5 Daily change of pollination of C. henryi

锥栗花粉的传播距离受风速和风向的影响极大，4个方向的传播距离和花粉通量差异显著(图 6)。在传粉盛期，样地1几乎每天15:00左右刮东风，因此顺风方向(西方)最远可传播到距花粉源30 m以外的地方，且各距离接收到的花粉数量显著大于其余3个方向，其中以距花粉源5 m处花粉通量最大(78.67粒·cm^-2)； 而逆风方向(东方)花粉的传播距离为距花粉源10 m以内，且空气中的花粉数量较少。南、北2个方向上的花粉通量随着距花粉源距离的增加而显著降低，传播距离为20 ～ 25 m。

	图 6 距花粉源不同距离4个方位上分别接收到的平均花粉量 Fig. 6 Average pollen quantity for four directions at different distance from pollen source

授粉10天后所有刺苞均开始膨大，2个月后未坐果的果实刺苞开始呈现出浅黄绿色，逐渐萎蔫脱落，8月底(种仁刚形成)统计各处理的坐果率(表 1)。结果表明，虽然2个样地同一处理条件下坐果率数值有差异，但其规律一致: 去雄套袋后不进行人工授粉的处理未坐果，即锥栗不存在无融合生殖； 异交坐果率均显著高于自交，但自交也可结实； 同一品种对不同花粉来源的亲和力有所差异。以上结果表明，异花授粉能显著提高其坐果率，生产中应考虑配置授粉树。

表 1 锥栗人工控制套袋授粉结果^① Tab.1 Tests of emasculation, bagging and artificial pollination for C. henryi

表 1 锥栗人工控制套袋授粉结果① Tab.1 Tests of emasculation, bagging and artificial pollination for C. henryi 处理 Treatment 坐果率(郴州) Fruit set (Chenzhou)(%) 坐果率(株洲) Fruit set (Zhuzhou)(%) 自然授粉 Open pollination 64.44 ± 2.01 C 77.28 ± 4.50 B 去雄，套袋，不授粉 Emasculated, bagged, no pollination 0 E 0 D 去雄，套袋，人工自花授粉 Emasculated, bagged, artificial self-pollination 55.97 ± 1.53 D 62.31 ± 3.72 C 去雄，套袋，人工异花授粉(父本为‘黄榛’) Emasculated, bagged, artificial cross-pollination (pollen from ‘Huangzhen’) 85.60 ± 1.03 A 92.15 ± 1.63 A 去雄，套袋，人工异花授粉(父本为‘处暑红’) Emasculated, bagged, artificial cross-pollination (pollen from ‘Chushuhong’) 80.33 ± 4.67 AB 93.59 ± 2.12 A 去雄，套袋，人工异花授粉(父本为‘蔓榛’) Emasculated, bagged, artificial cross-pollination (pollen from ‘Manzhen’) 73.81 ± 2.33 B 88.78 ± 5.36 A ①每列不同的大写字母代表不同处理间差异极显著( P < 0.01)。The different capital letters indicate the significant difference at the level of P < 0.01.

板栗(Castanea mollissima)雌花(簇)由冬季休眠后新分化的混合花序上发生，着生在混合花枝上混合花序的基部，平均每个花序着生2 ～ 3个； 被刺苞包围的雌花簇由1 ～ 3朵花组成，偶见4 ～ 5朵(李中涛等，1964； Botta et al，1995)。中川昌一(1973)首次指出板栗雌花中有雄蕊，此后大量中外学者对这一现象进行了研究，然而有关锥栗雌花结构鲜见报道。本研究对锥栗‘长芒子’雌花的分化过程进行了详细的解剖研究，发现锥栗雌花大多为单花，雌花中雌、雄蕊原基同时形成并同时开始发育(图 1A，B)，当雌花柱头伸出萼片时(雌花开花时)每个萼片底部均具2枚雄蕊，其花药结构完整，花粉发育为单核靠边期(图 1H)，由完整结构的花粉囊发育而来(图 1G)，即锥栗的雌花结构为两性花，这与张林平等(1999)对板栗的研究结果一致； 然而雌花发育过程中柱头的伸长速度显著快于花丝(图 1C)，因此雌花开花时，雄蕊长度显著低于雌蕊柱头(图 1D)，且花药深藏于萼片中无法散粉，这种结构避免了自花授粉(任立中等，1981)。

花粉、柱头和传粉媒介是植物传粉系统的3个组成部分(Edlund et al，2004； Johnson et al，2004)。在植物有性生殖过程中，大量的花粉、有效的传媒和处于可授期的柱头是有效传粉的前提条件(黄双全等，2000)。锥栗雄花为葇荑花序，花粉量大，轻而不易结团，便于随风飘散，具有典型的与风媒传粉相适应的性状(Hamrick，1982)； 锥栗雌花结构简单，由萼片和雌蕊组成，开花时，8 ～ 12个柱头充分发育后伸出萼筒，并向各个方向弯曲，具黏液质，便于捕获各个方向花粉，增加了风媒传粉的成功率。风媒传粉的效率不仅与植物自身适应风媒传粉花部结构特征有关，同时也受散粉期间气象因子、开花特性等因素的影响(张玉娜等，2009)。对锥栗传粉空间分布特点的观察发现，顺风方向载玻片上接收到的花粉数量在各个距离上的花粉密度显著高于其余3个方向，且传粉距离也显著大于其余3个方向，由此可见风是锥栗花粉散布量和传粉距离的一个重要决定因素。另外，传粉期若遇连续降雨，则传粉效率显著降低。

被子植物传粉系统在进化上是不稳定的，即使是一些典型风媒传粉的植物在不同环境下也会依赖于昆虫传粉(Faegri et al，1979)。Shi等(2005)研究了板栗生殖生物学特征，发现雌花簇具有特殊的针状柱头结构，只有顶端很小面积的部位能接受花粉； 夏立等(2007)对板栗的授粉特性进行了研究，发现与对照样株自然授粉相比，隔离虫媒传粉的处理样株，其柱头上平均花粉数量、球苞质量及坚果数量明显减少，空苞率显著上升，说明板栗仅靠风媒传粉很难使其充分受精，虫媒传粉可能在授粉过程中有着重要的地位。本研究观察发现，在锥栗雄花盛花期捕捉访花昆虫于解剖镜下检测，丝光绿蝇(Lucilia sericata)和食蚜蝇(Scaeva pyrastri)背部、腿部，尤其是翅部均携带锥栗花粉粒。丝光绿蝇和食蚜蝇访花时，头背部可以接触到花药，成熟的花粉粒自动降落黏附在昆虫头背部及腿部，在访问下一个雄花序前它们会在空中以一定高度飞翔数秒，在这个过程中它们可能将花粉散播。然而，这2种昆虫是否访问雌花、访花频率和传粉距离如何等问题有待进一步研究。另外，锥栗散粉期间雄花序散发出浓郁的腥香味可能是吸引传粉者的原因之一。

生殖成功是植物适应环境条件的重要组成部分，由于植物性别系统的不同，因此常出现多样化的繁育系统类型(刘芬等，2013)。近交衰退迫使近交便利减小，而远交代价很高，受外界条件影响大(Barrett，2002; 白伟宁等，2005)。生物进化以权衡近交和远交利弊的折中方式即混合交配系统进行，因此自然界大多数植物类群为混合交配模式，绝对自交或杂交的很少(Reinartz et al，1994)。

本研究人工控制授粉试验的结果显示，锥栗去雄套袋后不进行人工授粉的处理未坐果，即锥栗不存在无融合生殖； 2个试验样地连续2年的人工自交坐果率均显著低于异交，说明锥栗可自交结实，但是异花授粉能显著提高其坐果率。王倩(2012)以燕山板栗的5个品种为试材，通过授粉试验分别对其结实情况和品质进行了研究，结果表明5个品种的异交坐果率及果实品质显著高于自交，说明异交能提高栗属植物果实的产量和品质，产生具有杂种优势的后代，栽培中应注意配置授粉树。参照板栗雌雄异熟划分方法(刘国彬等，2011)，可以将锥栗划分为雌先型、雄先型和相遇型3种类型，栽培中可选择任意2种混栽，从而实现花期相遇，提高坐果率。周晶等(2009)授粉试验表明，雌蕊柱头对花粉具有较强的选择性，即使花期相遇，不同品种授粉组合亲和力也存在较大差异。此外，花粉活力、授粉时间也是影响授粉树选择和坐果率的重要因素。因此，生产上在对锥栗进行授粉树配置前要先对其主栽品种及授粉品种间进行试验验证。