林业科学  2014, Vol. 50 Issue (10): 164-172   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141023
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文章信息

夏宏义, 杨勇, 杨婷婷, 夏乐晗, 王仁梓
Xia Hongyi, Yang Yong, Yang Tingting, Xia Lehan, Wang Renzi
柿果实单宁细胞特征与总酚和缩合单宁含量的关系
Correlation between Characteristics of Tannin Cells and Total Phenolics and Condensed Tannins Contents in Persimmon Fruits
林业科学, 2014, 50(10): 164-172
Scientia Silvae Sinicae, 2014, 50(10): 164-172.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20141023

文章历史

收稿日期:2013-12-10
修回日期:2014-05-24

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夏宏义
杨勇
杨婷婷
夏乐晗
王仁梓

柿果实单宁细胞特征与总酚和缩合单宁含量的关系
夏宏义, 杨勇 , 杨婷婷, 夏乐晗, 王仁梓    
西北农林科技大学园艺学院 杨凌 712100
关键词    单宁细胞    单宁细胞体积    总酚    缩合单宁    
Correlation between Characteristics of Tannin Cells and Total Phenolics and Condensed Tannins Contents in Persimmon Fruits
Xia Hongyi, Yang Yong, Yang Tingting, Xia Lehan, Wang Renzi    
College of Horticulture, Northwest A & F University Yangling 712100
Abstract: In this study, 51 accessions of mature persimmon fruits were used as materials to investigate the correlation between characteristics of tannin cells, and total phenolics and condensed tannins contents. The sizes and quantities of the tannin cells were observed with direct extrusion of soft persimmon fruits. A calculating method for determining the volume of tannin cells was explored in unit mass of mature fruits flesh. The total phenolics and condensed tannins contents were measured. The results showed that 1) The size and quantity of tannin cells in PCA (pollination constant astringent) cultivars were larger, while those of Chinese PCNA (pollination constant nonastringent) and Japanese PCNA cultivars except for ‘Suruga’ were smaller. Part of the PCA cultivars was similar to PVA (pollination variant astringent) and PVNA (pollination variant nonastringent) cultivars. 2) There was extreme significant (P<0.01) correlations between the volume of tannin cells and total phenolics content as well as condensed tannins contents of mature persimmon fruit, respectively. 3) Cluster results showed that the volume of tannin cells was able tobe used as an index for classification of different types of persimmon cultivars.
Key words: persimmon    tannin cell    the volume of tannin cell    total phenols    condensed tannins    

自1981年以来,Haslam等学者认为植物单宁属于多酚类化合物,即存在于柿(Diospyros kaki)果实使其呈涩味的酚类物质称为柿单宁(张宝善等,2008),并将植物单宁改称为植物总酚。植物总酚已经广泛应用于医学、食品工业、日化工业、制革工业、冶金工业、环境污染治理等领域(张宝善等,2008;石闪闪等,2012)。 缩合单宁又称原花青素(Akagi et al.,2009),是羟基黄烷类单体组成的缩合物,具有防治糖尿病(Hussain et al.,2013)、预防心脑血管疾病(Cos et al.,2004)、抗肿瘤促进免疫(Bawadi et al.,2005)、抑制蛇毒(Xu et al.,2012)等多种生物活性。故可将总酚和缩合单宁作为柿单宁开发利用中的2项重要指标。柿单宁在一种大型特殊细胞中积累,这种特殊细胞被称为单宁细胞(Taira,1995)。单宁细胞的大小、形态、多酚类物质随果实的发育不断地发生着变化(杨勇等,2003;Yonemori et al.,1987a;周舟等,2011)。国内外学者曾对柿单宁细胞形态的动态变化进行了观察(Yonemori et al.,1985;张宝善等,2000;张永卓等,2006),但选取的品种数量少、类型不全或未进行分类,且多采用组织切片法观察剖面上的单宁细胞。然而,柿果实生长发育后期和成熟时单宁细胞体积较大及空间排列不规则性导致组织切片法可能将单宁细胞纵切、横切或斜向切分,无法准确对单宁细胞数目及形态进行观测,不能全面反映出单宁细胞的形态特征。杨勇等(20032007)曾采用软柿压涂过滤澄清法及软柿果肉直接压涂法对不同类型柿品种进行研究,较为全面、清楚地观察了单宁细胞发育过程中形态特征的变化,但尚未对单位质量(或体积)柿果肉中单宁细胞数目、单宁总体积与多酚和缩合单宁含量之间关系进行观测和研究。依据果实能否自然脱涩及其与种子数目和果肉褐斑形成的关系,通常将柿果实分为完全甜柿(pollination constant nonastringent,PCNA)、不完全甜柿(pollination variant nonastringent,PVNA)、不完全涩柿(pollination variant astringent,PVA)和完全涩柿(pollination constant astringent,PCA)4大类,前2种类型成熟前可在树上自然脱涩,后2种必须经过采后人工脱涩处理才能达到可食状态,4种类型柿果的单宁在生长成熟过程中变化不尽相同(张宝善等,2008)。Ikagami等(2004)江丽萍(2009)研究表明,中国完全甜柿(Chinese-pollination constant nonastringent,C-PCNA,常简称‘中国甜柿’)与日本完全甜柿(Japanese-pollination constant nonastringent,J-PCNA)是相对独立分化的2个居群,本文拟将其作为2种不同类型进行探讨。本研究采用软柿果肉直接压涂法,以国家柿种质资源圃中保存较为齐全的不同类型柿品种为材料,尽可能多地选取不同类型柿品种,对成熟果实中单宁细胞的大小和数目进行观测,对单位质量果肉单宁细胞总体积的计算方法进行探索,并通过Folin-Ciocaiteu法和优化的香草醛-盐酸法对其中部分柿果果肉组织进行总酚和缩合单宁含量的测定,对不同类型柿成熟果实单宁细胞大小、总体积与总酚和缩合单宁含量之间的关系进行研究。

1 材料与方法 1.1 材料、试剂与仪器

柿种质资源5个不同类型51个品种成熟柿果实均采自于国家柿种质资源圃,包括日本完全甜柿(J-PCNA)11个、中国甜柿(C-PCNA)3个、不完全甜柿(PVNA)7个、不完全涩柿(PVA)3个、完全涩柿(PCA)27个。

试剂葡萄籽原花青素标准品购自天津尖峰公司,原花青素含量≥95.0%,低聚原花青素≥60.0%; 其他试剂均为国产分析纯。

仪器与设备包括Olympus BH-2光学显微镜、Sartorius BSA223S电子天平、 TIANFU-6246电子天平、 旋转蒸发仪、 UV-2600A紫外可见分光光度计。

1.2 试验方法

1)单宁细胞大小及数目 分别选取5个不同类型(J-PCNA,C-PCNA,PVNA,PVA,PCA)的51个柿品种的成熟果实,待果实完全软化后,采用果肉直接压涂法进行制片观察。对比阳丰(Youhou)成熟果实采摘后放置自然软化和用一定浓度乙烯利处理软化后单宁细胞的大小及数量的差异,发现二者单宁细胞大小及数量的差异不明显,故对阳丰、小果甜柿(Xiaoguotianshi)、次郎(Jiro)等少数几个成熟后不易软化的柿品种,将其果实放入质量浓度300 mg·L-1的乙烯利溶液中浸泡0.5 min(刘文燕等,1980),室温(16~20 ℃)放置,待完全软化后再进行观察。果肉压涂法具体操作为: 用圆形耳勺取果实表皮细胞层至最大横切面半径3/4处的果肉组织(石细胞层除外)1平勺(0.020±0.002)g,用解剖针全部转移至载玻片上,加蒸馏水一滴,盖上盖玻片,橡皮头轻轻敲击盖玻片,使果肉组织分散均匀。在Olympus BH-2光学显微镜下测量单宁细胞纵横径(目镜测微尺随机测量30个单宁细胞的纵横径,以均值表示)及计数单宁细胞个数,每个果实同一部位取样观测2次,以均值表示,并记录2次观测的60个单宁细胞的纵横径,用于单宁细胞总体积的计算。每个品种4次重复(随机选取无病虫害的成熟果实4个观测果肉组织单宁细胞纵横径及数量)。

2)单宁细胞体积计算方法 参考杨勇等(2003)对柿单宁细胞形态特征的分类方法,将显微观测的柿单宁细胞进行分类。单宁细胞的外形按纵横径之比及几何形状不同大致可分为6类,即细长形、长形、短形、近圆形、多角形、尖头形。以禅寺丸(Zenjimaru)为例,细长形、长形和短形单宁细胞约占总单宁细胞数量的86%,近圆形约占2%,多角形和尖头形约占12%,其中,多角形和尖头形分别为有3个以上明显的棱角、细胞有1端或2端明显的尖细,棱角和尖端对单宁细胞体积的影响相对较小,忽略不计,对于其体积的计算直接按纵横径之比分别归类于细长形、长形、短形或近圆形,参照各自体积的计算方法进行计算,其他柿品种单宁细胞体积的计算同理。

单宁细胞的表面形态有棘刺状、瘤状、凹陷状、自然平滑之分,以禅寺丸为例,4次重复单宁细胞总数分别为138,145,131,120个。根据单宁细胞表面形态不同基本可以分为3种类型: 1)表面基本平整光滑呈褐黄色,所占比例分别为82/138,87/145,79/131,73/120; 2)凹陷微皱缩呈褐棕色,所占比例分别为48/138,51/145,46/131,40/120; 3)细胞表面皱缩程度深呈褐红色,所占比例分别为8/138,7/145,6/131,7/120。单宁细胞表面刺状、瘤状、气泡状凸起及不同程度的凹陷、皱缩对于单宁细胞体积的影响相对较小,可忽略不计,参考自然平滑状单宁细胞进行其体积的计算,其他柿品种单宁细胞体积的计算同理。

采用软柿果肉直接压涂制片,显微观测到的单宁细胞具有三维的立体结构,可以在载玻片上滚动,表面自然平滑状的细长形、长形和短形单宁细胞近似看作圆柱体,近圆形近似看作圆球体,将观测的每个柿果实的60个单宁细胞按纵横径之比分别归类于细长形或长形或短形、近圆形两大类,所占的比例分别记作a、1-a,单位质量(体积)柿果肉单宁细胞总体积参照下式进行计算:

$$ \begin{array}{l} {V_{总}} = \frac{1}{{0.020}}\left[ {\sum\limits_0^{60a} {a\pi {{({d_i}/2)}^2}{h_i}n + } } \right.\\ {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} \left. {\sum\limits_0^{60(1 - a)} {(1 - a)\frac{4}{3}\pi {{({d_j}/2)}^3}n} } \right],\\ (0 \le i \le 60a,i \in Z;0 \le j \le 60(1 - a),j \in Z)。 \end{array} $$ 式中:V为单宁细胞总体积; a 为细长形、长形和短形单宁细胞的总数占60个单宁细胞的比例;d为单宁细胞横径; h为单宁细胞纵径; n每勺单宁细胞总个数; i为第i个细长形、长形或短形单宁细胞; j为第j个近圆形单宁细胞,Z为整数。

3)总酚和缩合单宁含量的测定 样品处理: 选取5个不同类型的51个柿品种中部分品种进行总酚和缩合单宁含量的测定,分别为6,3,3,3,9个,合计24个品种(表 2)。参考顾海峰等(2007)的方法对杮样品进行处理,稍作改进。具体流程为: 取30 g成熟柿果实表皮细胞层至最大横切面半径3/4处的果肉组织,加30 mL体积分数为1%盐酸甲醇的提取液,匀浆捣碎,取7 g匀浆(相当于4 g果肉组织)转到蒸馏瓶中,加40 mL提取液(料液比1∶10),80 ℃加热回流40 min,过滤,将残渣转入蒸馏瓶中,加40 mL提取液,加热回流30 min,过滤至同一容量瓶,2次混合滤液定容至100 mL,备用。

表 2 成熟柿果实总酚和缩合单宁的含量 Tab.2 The total phenols and condensed tannins of different varieties of persimmon mature fruitsmg·g-1

总酚含量测定: 参考吴晓青等(2011)对芙蓉李(Prunus salicina cv.furong)中总多酚含量测定方法优选中的Folin-Ciocaiteu法,稍作改进,1 mL样品溶液,加1 mL Folin Ciocaiteu's酚试剂,混匀,放置5 min,加3 mL 7.5%碳酸钠溶液、5 mL ddH2O,充分混匀,显色60 min,以1%盐酸甲醇为对照,测定A765nm。以没食子酸作为标准品代替样品溶液制作标准曲线,得到回归方程y=10.148x-0.000 2,R2=0.999 8。样品中的总酚以没食子酸含量(mg·g-1)表示。

缩合单宁含量测定: 采用优化的香草醛-盐酸法,具体参考杨勇等(2014)对柿果实缩合单宁含量测定方法进行。2 mL样品溶液,加4%香草醛的甲醇液与30%盐酸甲醇液等体积混匀的溶液10 mL,摇匀,避光,30 ℃恒温水浴显色30 min后测定A500 nm。以葡萄籽原花青素作为标准品代替样品溶液制作标准曲线,得到回归方程y=1.672 8x-0.001 4,R2=0.988 0。样品中的缩合单宁以葡萄籽原花青素的含量(mg·g-1)表示。

1.3 统计分析

以柿单宁细胞横径为横坐标,纵径为纵坐标,绘制柿单宁细胞纵横径大小坐标图;单宁总体积、总酚和缩合单宁含量之间的相关分析采相关系数法; 数据处理采用SPSS19统计分析。

2 结果与分析 2.1 单宁细胞纵横径、数量及单宁细胞总体积与品种间的关系

不同类型品种的单宁细胞大小见图 1。大秋(Taishu)、阳丰、骏河(Suruga)、夕红(Yubeni)、次郎、新秋(Shinsyuu)、晚御所(Okugosho)、爱知早生(Aichiwasefuyuu)、前川次郎(Maekawajirou)、富有(Fuyu)、若杉系次郎(Wakasugikeijirou)等日本完全甜柿和甜宝盖(Tianbaogai)、小果甜柿、秋艳(Qiuyan)等中国甜柿品种的单宁细胞纵横径相对较小,禅寺丸、西村早生(Nishimurawase)、海库曼(Hyakume)、甘百目(Amahyakume)、加州圆(Californiamaru)、东阳一(Touyouichi)、正月(Shougatsu)等不完全甜柿品种有较大的长形单宁细胞,兰田水柿(Lantianshuishi)、华县帽盔(Huaxianmaokui)、黑柿(Heishi)等完全涩柿单宁细胞的纵横径均比完全甜柿大,但与不完全甜柿及不完全涩柿没有明显的界限。总体来看,涩柿的单宁细胞比较宽大,甜柿的单宁细胞较小或细长。各柿品种单位质量果肉组织中单宁细胞总个数和单宁细胞总体积见表 1

表 1 单位质量柿果肉组织单宁细胞总个数和单宁细胞总体积 Tab.1 The total number and volume of tannin cells in per gram fruit flesh of different persimmon varieties

结合表 1图 1可知: 柿各品种中,骏河单位质量(体积)单宁细胞个数最多,夕红最少,刀根早生(Tonewase)单个单宁细胞体积最大,次郎最小。日本完全甜柿品种,以骏河单宁细胞个数最多,夕红和大秋最少; 单个单宁细胞体积以阳丰最大,次郎最小。中国甜柿、不完全甜柿、不完全涩柿分别以小果甜柿、海库曼和大和百目(Yamatohyakume)的单宁细胞个数最多,单个细胞体积最小; 以秋艳、正月、刀根早生单宁细胞数目最少,单个细胞体积最大。完全涩柿以小面糊(Xiaomianhu)单宁细胞个数最多,临潼方柿(Lintongfangshi)最少; 莲花柿(Lianhuashi)单个单宁细胞体积最大,包馍柿(Baomoshi)最小。总体来看,完全涩柿单宁细胞数目和体积较大,完全甜柿单宁细胞数目(除骏河外)和体积较小。

图 1 柿品种单宁细胞纵横径 Fig. 1 The width and length of tannin cells of different persimmon accessions 1-11.日本完全甜柿; 12-14.中国甜柿; 15-21.不完全甜柿; 22-24.不完全涩柿; 25-51.完全涩柿。下同。1-11.J-PCNA;12-14.C-PCNA;15-21.PVNA;22-24.PVA;25-51.PCA.The same below.

单位质量柿果肉单宁细胞总体积完全涩柿和不完全涩柿较大,不完全甜柿次之,中国甜柿和日本完全甜柿最小。用排水法求得成熟柿果肉组织的密度约为1 g·cm-3,若按此密度计算,完全涩柿中,包馍柿、急柿(Jishi)、元宵柿(Yuanxiaoshi)、地藏柿(Izougaki)、镜面柿(Jingmianshi)单宁细胞总体积相对较小,占果肉体积的13%~15%,兰田水柿、海安小方柿(Hianxiaofangshi)和广州牛心柿(Guangzhouniuxinshi)单宁细胞总体积占果肉体积的17%,其他涩柿品种均处于18%~37%之间; 不完全涩柿单宁细胞总体积占果肉体积的16%~17%; 不完全甜柿单宁细胞总体积占果肉体积9%~13%; 完全甜柿单宁细胞总体积占果肉体积的0.4%~4%,其中,日本完全甜柿夕红、大秋、次郎、新秋、晚御所占1%或低于1%,阳丰占2%,中国甜柿小果甜柿和日本完全甜柿骏河相当,3%左右,中国甜柿甜宝盖和秋艳与参试的其他日本完全甜柿相近,约占4%。

参试的柿品种之间果肉单宁细胞总体积的变异系数为64%。不同类型柿果肉单宁细胞总体积变异系数以日本完全甜柿最大,达66%; 不完全甜柿和完全涩柿变异系数相同,为27%; 中国甜柿变异系数为16%; 不完全涩柿变异系数仅3%。

2.2 24份柿品种单位质量果肉中单宁细胞总体积与总酚和缩合单宁含量的相关性分析

选取5个不同类型的51份柿品种中24份进行总酚和缩合单宁含量测定,结果见表 2

不同类型柿果实中总酚和缩合单宁含量的变化趋势相似,都以完全涩柿和不完全涩柿处于较高水平,不完全甜柿次之,中国甜柿和日本完全甜柿水平相当或略高于其部分品种。不同柿品种成熟果实总酚和缩合单宁的总体变幅分别为1.42~9.84,1.16~7.43 mg·g-1; 变异系数较大,高达58%,56%。完全涩柿总酚和缩合单宁的变幅分别为7.16~9.84,5.43~7.43 mg·g-1,变异系数均为11%; 不完全涩柿总酚和缩合单宁的变幅分别为6.25~8.32,5.47~7.16 mg·g-1,变异系数为14%,13%; 不完全甜柿总酚和缩合单宁的变幅分别为3.18~3.82,2.43~3.21 mg·g-1,变异系数为10%,15%; 中国甜柿总酚和缩合单宁的变幅分别为2.41~2.87,1.99~2.25 mg·g-1,变异系数较低,为9%,6%; 日本完全甜柿总酚和缩合单宁的变幅与中国甜柿相近,然而,变异系数较大,分别达到22%,25%。

分别分析24份柿品种间单宁细胞总体积与总酚和缩合单宁含量之间的关系,结果见图 23

图 2 柿果肉组织单宁细胞总体积与总酚含量之间的关系 Fig. 2 The correlation between the volume of tannin cells and total phenolics contents in fresh fruit of different persimmon varieties
图 3 柿果肉组织单宁细胞总体积与缩合单宁含量之间的关系 Fig. 3 The correlation between the volume of tannin cells and condensed tannins contents in fresh fruit of different persimmon varieties

图 23可知,柿单宁细胞总体积与总酚和缩合单宁含量之间存在显著正相关性,线性方程分别为: y=28.892x-31.274,r=0.946; y=37.252x-34.954,r=0.936。相关系数均达到了极显著水平(P<0.01),表明柿果肉组织总酚和缩合单宁含量与单宁细胞总体积大小有关,柿多酚类物质基本全部分布于单宁细胞中,可以通过测定单位质量柿果肉中单宁细胞总体积大小来预测总酚及缩合单宁含量的高低。

3 讨论 3.1 直接压涂法测量单位质量柿果肉中单宁细胞纵横径、数目和总体积

国内外学者(张继澍等,1993;陈文军等,1993;Yonemori et al.,1987b)常采用柿果实横断面及纵断面切片观察单宁细胞分布密度(数目/视野数),以其分布密度来代表单宁细胞的大小作为单宁细胞生长发育规律研究的一项重要指标。柿子房发育期和果实生长发育早期,单宁细胞较小,组织切片法易观察、保存和便于比较; 柿果生长后期与成熟时,单宁细胞并非同一个平面的排列和不规则性,使单宁细胞纵切、横切、斜切,观测的单宁细胞数目和形态不能完全地反映单宁细胞的特征。再者,单宁细胞被切碎后,内含总酚类物质外流,影响染色后的观察效果。张青林等(2013)采用倾析法通过IPP5.0 统计软件随机测定20个单宁细胞面积大小,可直接观察单宁细胞的形状和大小,为单宁细胞形态与生长变化规律的研究提供了新的思路。本研究采用软果果肉直接压涂法,单宁细胞和果肉细胞特征明显,容易区分,无需进行染色即可观察。如何定量取得少许果肉细胞测量单宁细胞大小并统计单宁细胞个数成为本试验的难点。经笔者探索发现,如果每次用圆形耳勺取一平勺软柿果肉组织进行观测,经万分之一电子天平称量,每平勺质量为(0.020±0.002)g,不同柿品种间每勺果肉组织质量差异较小,重复性较好,不仅可相对准确地定量研究单位质量果肉细胞中完整的单宁细胞大小及总个数,还可进行单宁细胞形态观测。

单宁细胞在外形、大小、表面特征、质地上均表现出多样性,不仅在种和品种间有所不同,而且同一果实内的单宁细胞也有区别,给单宁细胞的体积研究带来了较大的困难,目前尚未见到有关单宁细胞体积研究方法的报道。本文采用杨勇等(2003)对柿单宁细胞形态特征的分类方法,将显微观测的柿单宁细胞进行分类,分别按照各类细胞的特征进行单宁细胞体积的计算。然而,进行显微观测时发现,定量取得的少许柿果肉组织中单宁细胞数量仍较多,如日本完全甜柿骏河、不完全涩柿及大部分完全涩柿品种。再者,部分柿品种单宁细胞成束状排列或分布较为密集,只能对单宁细胞数目进行计数,无法对每一个单宁细胞的纵横径都一一进行测量,如中国甜柿秋艳单宁细胞成串状排列并聚集在一起形成长片层,甜宝盖单宁细胞成束状较为紧凑地结合并形成片层状。故本研究对每个柿品种果实表皮细胞层至最大横切面半径3/4处(石细胞层除外)的果肉随机观测60个单宁细胞,并根据单宁细胞纵横径之比进行分类,计算出各类细胞所占的比例,结合计数的单宁细胞总数目,即可近似算出定量取得的柿果肉中各类单宁细胞所占的比例,按照各自方法计算单宁细胞总面积。该单宁细胞体积的计算方法存在着以下3点不足之处: 1)有少许单宁细胞的形状呈多角形、尖头形及其他不规则形,未能找到有效的具有可操作性的处理方法,加之对单宁细胞体积的影响相对较小,故忽略其对单宁细胞体积的影响; 2)单宁细胞的表面形态具有多样性,有棘刺状、瘤状、凹陷状、自然平滑及皱缩状之分,且各自程度不同,考虑到相对于单宁细胞体积影响较小,忽略了对单宁细胞体积的影响; 3)软柿压涂法制片显微观测的单宁细胞具有三维立体结构,可以在载玻片上滚动,再根据纵横径之比进行分类,依照其对应的圆柱体或圆球体进行体积计算,具有一定的合理性,但所得的计算结果较实际情况依然偏大。总体而言,通过测量单宁细胞纵横径、计数单宁细胞数目并计算单宁细胞总体积,每个柿品种4次重复,所得结果误差相对较小,基本能反映出各柿品种间单宁细胞大小、数量及占果肉组织的体积之比的差异。

3.2 单宁细胞纵横径、数量及单宁细胞总体积与品种间的关系

不同类型、品种的单宁细胞大小(以纵横径为指标)、数量及单宁细胞总体积均存在着较大的差异。日本完全甜柿和中国甜柿单宁细胞较小、数量较少(除日本完全甜柿骏河外); 不完全甜柿单宁细胞呈长形较大,其中,海库曼单宁细胞数目较多; 不完全涩柿和完全涩柿的单宁细胞较宽、单宁细胞数目较多。单位质量果肉中单宁细胞总体积完全涩柿和不完全涩柿较大,不完全甜柿次之,中国甜柿和日本完全甜柿最小。张继澍等(1993)研究表明,甜柿密度较小,涩柿密度较大,各品种间表现不尽相同,本研究与其结果一致。柿果实单宁细胞大小、数量、单位质量单宁细胞的总体积不同类型、品种间表现出的差异可能与柿的起源演化有关。日本学者远藤融郎(1988)提出甜柿是由完全涩柿突变为不完全涩柿,再变异为不完全甜柿,再经过芽变、杂交育种或长期人工选择得到完全甜柿品种。完全涩柿和不完全涩柿相对于不完全甜柿和完全甜柿在进化上较为原始,为了更好抵抗昆虫、鸟兽的采食,保护种子,单宁细胞较大、数目多,单宁细胞总体积占果肉细胞体积的比例较大,单宁细胞中的内含物较多,起到较好的保护作用; 随着人们对柿品种的开发利用程度加深,长期的人工选择和较为完善的保护措施诱使单宁细胞的体积、数目及占果肉组织的比例不断减小,单宁细胞的内含物质减少,向着育种的目标方向进化。

不同柿品种间单宁总体积的变幅和变异系数差异较大,以日本甜柿变异最大,达66%,可能与日本甜柿品种特性有关。一般认为,甜柿是涩柿的突变,在与其他品种的反复自然杂交过程中,逐渐形成现有的甜柿品种群(罗正荣等,1999)。如阳丰通过富有×次郎杂交而育成,骏河由花御所(Hanagosho)和晚御所杂交选育得到,前川次郎和若杉系次郎均为次郎的芽变品种,爱知早生为富有的芽变,大秋由富有×ⅡiG-16杂交得到,夕红通过品种选育得到(赵献民等,2011;罗正荣等,1996)。不定向的突变、芽变及不同的育种途径致使日本甜柿品种遗传物质差异较大。通过显微观察发现,日本完全甜柿与中国甜柿单宁细胞形态特征差异也较大,前者存在着较为分散的凝固型褐变的单宁细胞和少数深红棕色凝聚型的单宁细胞,后者也存在着凝固型单宁细胞,但未见到凝聚型单宁细胞的存在。杨勇等(2007)对中国甜柿进行观察,也未发现棕红色的凝聚型细胞的存在。甜宝盖凝固型单宁细胞小而密集结合成片层分布,发现少部分褐变呈棕红色; 小果甜柿单宁细胞分布密集呈束状,有呈粉红色和褐红色皱缩细胞,还存在少许单宁细胞呈褐色平滑状; 秋艳凝固型单宁细胞成串状排列并聚集在一起形成长片层,无褐变的凝固型细胞。

3.3 单位质量果肉中单宁细胞总体积大小与总酚和缩合单宁含量的相关性

根据5种不同类型成熟柿果实单宁细胞大小、数量、单位质量单宁细胞总体积的差异及进化的规律,提出一个推测: 一方面,较为原始类型的柿品种的果实单宁细胞较大、数量较多、单宁细胞总体积占果肉细胞体积的比例较大、单宁细胞中的内含物较多,能对采食者起到防御作用,具有自我保护效果的物质较多,保护种子,有利于种族的延续; 另一方面,柿子作为一类水果,最终成熟时要达到可食状态或通过某项措施可以促使其达到可食状态,才能被人们保留或长期地通过人工选择向着可食的方向进化。Taira(1995)Gu等(2008)研究发现,柿单宁细胞中的物质主要以缩合单宁占绝大部分的总酚类物质为主。不同类型的柿果实从幼果到果实成熟的发育进程中,有如下2条规律: 1)较为原始类型较进化程度高的柿果实总酚和缩合单宁含量高;2)从幼果至果实成熟时,单位质量果实总酚和缩合单宁的含量逐渐降低,直至达到可食用状态时的水平。这2点通过对不同类型柿果成熟过程中总酚和缩合单宁含量变化进行研究(杨勇等,2014),得到了进一步的验证。成熟自然软化或经过一定处理措施软化的柿果实可直接采用软柿压涂法对完整的单宁细胞大小、数目、单宁细胞总体积占果肉组织的比例与总酚和缩合单宁之间的关系进行研究,从一定程度反映出单位质量果肉单宁细胞总体积与总酚和缩合单宁的相关性。结合对5个不同类型24个柿品种成熟果实的总酚和缩合单宁的测定,发现柿单宁细胞总体积与多酚和缩合单宁的含量线性相关,相关系数分别为0.946,0.936,均达到极显著水平(P<0.01),表明成熟柿果肉单位质量总酚和缩合单宁含量的高低与单宁细胞总体积占果肉组织的比例正相关。不同类型的柿果实生长发育不同时期的总酚和缩合单宁含量与单宁细胞总体积占果肉组织的比例是否也符合这一规律,有待进一步验证。

总体来看,本试验通过对柿果实表皮细胞层至最大横切面半径3/4处的果肉组织(石细胞层除外)进行单宁细胞大小、数量、单位质量单宁细胞的总体积进行观测与计算,并对相应部位果肉组织总酚和缩合单宁含量进行测定,探讨了所取样本部位的单宁细胞大小、数量、单位质量单宁细胞的总体积与总酚和缩合单宁含量的关系,一定程度上反映了不同类型柿品种的特性。然而,张继澍等(1993)研究发现,单宁细胞的密度、大小和比例在果实不同部位之间均存在一定程度或显著差异,同一果实顶部、中部、基部的单宁细胞大小、数目不同,进行品种比较时,以果实中部较有代表性。 就甜柿与涩柿比较,二者在顶部差异不明显,中部和基部差异较大,完全甜柿果肉中部和基部的差异一般较小,而涩柿的较大。章镇等(1997)研究还发现,单宁细胞密度在果实心室外、心室间、心室内不同,且因品种又有差异。下一步拟对柿果实不同部位单宁细胞大小、数量、单位质量单宁细胞的总体积与总酚和缩合单宁含量水平的关系进行研究,并将不同部位软化的部分果肉组织充分混匀后定量取得少许,就单位质量单宁细胞的总体积与总酚和缩合单宁或其他指标的相关性进行研究。软柿压涂法取样时,首先用锋利的刀具将软柿在最大横径处切开,再用解剖针将表皮细胞层至切面约半径3/4处欲取的部分果肉组织捣碎(为排除石细胞层的石细胞的影响,取样尽量临近最大横切面半径3/4处),均匀地取一平耳勺(万分之一电子天平称量检验),经多次练习,确保样本的一致性。本试验的不足之处还在于必须采用软果进行压涂制片观察,对于成熟后不易软化的少数几个品种如阳丰、小果甜柿、次郎等需用一定的措施加速其软化进程。陈文军等(1993)张宝善等(2000)研究指出,不同脱涩方法对柿果单宁细胞形态的变化影响程度不同。张宝善等(2000)认为,在脱涩过程中,单宁由可溶性低聚态单宁聚合生成不溶性高聚合态单宁,导致细胞体积缩小,涩味消失,这种变化过程是可逆的。通过对成熟阳丰果实采摘后放置自然软化和用一定浓度乙烯利处理软化后单宁细胞的大小及数量的差异进行对比,发现二者单宁细胞大小变化及数量的差异不明显,单宁细胞形态趋于一致。可能是由于柿果实自然放置时产生乙烯和脱落酸,促使呼吸作用加强,细胞壁降解,导致硬度下降,果实变软; 乙烯利处理诱发柿果实释放大量乙烯,呼吸高峰提前,加速果实衰老进程,二者机制相近所致。然而,本试验测定乙烯利对阳丰果实单宁细胞大小和数量的影响,至于乙烯利对其他柿品种或其他类型的果实单宁细胞大小、数量及形态的影响有待进一步验证。接下来,可以选用更多柿品种来研究促使果实的快速软化,且对单宁细胞的大小、形态及数量影响较小的方法,以便应用直接压涂法并结合组织切片法、离析法、电子显微镜技术等对柿果整个生育期单宁细胞动态的生长变化规律进行研究。另外,单宁细胞大小、数量还受样品树龄、立地条件等影响(张继澍等,1993),在单宁细胞研究中应加以注意。

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