林业科学  2014, Vol. 50 Issue (1): 76-81   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140112
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文章信息

杨梅, 张敏, 师守国, 康永祥, 刘建军
Yang Mei, Zhang Min, Shi Shouguo, Kang Yongxiang, Liu Jianjun
武当木兰种群遗传结构的ISSR分析
Analysis of Genetic Structure of Magnolia sprengeri Populations Based on ISSR Markers
林业科学, 2014, 50(1): 76-81
Scientia Silvae Sinicae, 2014, 50(1): 76-81.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140112

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收稿日期：2013-03-27
修回日期：2013-06-09

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刘建军

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杨梅, 张敏, 师守国, 康永祥, 刘建军. 2014. 武当木兰种群遗传结构的ISSR分析[J]. 林业科学, 50(1): 76-81.
Yang Mei, Zhang Min, Shi Shouguo, Kang Yongxiang, Liu Jianjun. 2014. Analysis of Genetic Structure of Magnolia sprengeri Populations Based on ISSR Markers. Scientia Silvae Sinicae, 50(1): 76-81.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140112
武当木兰种群遗传结构的ISSR分析
杨梅1, 张敏1, 师守国2, 康永祥1, 刘建军1    
1. 西北农林科技大学 杨凌 712100；
2. 运城学院 运城 044000
收稿日期：2013-03-27；修回日期：2013-06-09
基金项目：国家林业局公益性行业科研专项（200904004）。
通讯作者：刘建军
摘要：采用ISSR分子标记对湖北、陕西及重庆等地区9个典型武当木兰种群的遗传多样性和遗传结构进行研究。用8条引物共检测到207个有效位点，其中多态性位点195个。在物种水平上，多态位点百分率（PPB）为94.20%，Nei遗传多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）分别为0.171 9和0.288 2；种群水平的PPB，H和I分别为43.64%，0.128 4和0.198 8。分子变异分析（AMOVA）显示，武当木兰种群内变异占总变异的68.10%（P<0.001），种群间的占31.90%（P<0.001），种群间的基因分化系数（GST）为0.257 0，说明武当木兰种群内和种群间均存在着显著的遗传分化，但种群内变异对总变异的贡献较大。种群间的基因流（Nm）为1.445 6，9个种群的平均遗传距离为0.040 0。算术加权平均数法（UPGMA）将9个武当木兰种群分为3大类群，聚类结果与大多数种群的地理分布及花部特征的划分大致吻合。
关键词： 武当木兰    ISSR    遗传多样性    遗传结构    
Analysis of Genetic Structure of Magnolia sprengeri Populations Based on ISSR Markers
Yang Mei1, Zhang Min1, Shi Shouguo2, Kang Yongxiang1, Liu Jianjun1     
1. Northwest A & F University Yangling 712100;
2. Yuncheng University Yuncheng 044000
Abstract: Magnolia sprengeri is an important ornamental plant species. In this study 8 ISSR primers were used to examine the genetic diversity and genetic structure of 9 natural M.sprengeri populations which included 71 individuals, collected from Shaanxi, Hubei, Chongqing of China which belong to the main distribution area.A total of 207 valid loci were obtained, of which 195 were exhibited polymorphism. The percentage of polymorphic bands (PPB) were 94.20% at species level and 43.64% at population level, and the mean diversity estimated with Nei's index (H) and Shannon's information index (I) was 0.171 9 and 0.288 2 at species level, and 0.128 4 and 0.198 8 at population level, respectively. Analysis of molecular variance (AMOVA) demonstrated that the proportion of genetic variation was 68.10% (P<0.001) within population, and 31.90% (P<0.001)among populations. The differential index (GST) among the populations was 0.257 0. All these results indicated that there was a significant genetic differentiation both within and among the populations. The gene flow (Nm) among populations was 1.445 6 and the genetic distance among 9 populations was 0.040 0. The UPGMA cluster analysis divided the 9 populations into 3 major groups, which was consistent well with the geographical distribution and floral characters of most of the populations except for some transitional populations.
Key words: Magnolia sprengeri    ISSR    genetic diversity    genetic structure    

武当木兰(Magnolia sprengeri)为木兰科(Magnoliaceae)木兰属(Magnolia)落叶乔木，主产我国湖北、四川、陕西、甘肃以及河南等省区(刘玉壶等，1996)，以其生长迅速、适应性强、分布广、寿命长等优势，加之树姿雄伟、花色鲜艳、芳香四溢、材质优良等特点，成为城市绿化的重要树种(申俊林，2007)。在西方园林育种中，武当木兰始终是理想的育种材料，特别是其深红花色栽培种(M.sprengeri var. diva)被广泛种植，并以其为亲本培育了诸多知名的杂交品种。在我国的部分产区，武当木兰还被作为辛夷(M. liliflora)和厚朴(M.officinalis)的替代品入药，具有一定的药用价值。

不同产区的武当木兰在分类学特征上存在着较大差异，这些变异不仅是研究武当木兰系统进化发育的主要依据，也为其遗传育种提供了丰富的遗传信息。多年来，国内外学者围绕武当木兰做了大量的研究，在武当木兰系统分类学和育种学方面取得了一定的成绩(Pampanini，1915;Rehder et al.，1913;Stapf，1927;Johnstone，1955;Spongberg，1976;Chen et al.，1993;Kang et al.，2011)。然而，对其遗传多样性和居群遗传结构等方面的研究却鲜有报道，特别是缺少运用现代分子生物学技术解决类似问题的尝试。近年来，随着武当木兰资源的过度开发，其种群遭到了不同程度的破坏，遗传多样性优势受到了极大的威胁(廉永善等，2005;汪松等，2004)。开展武当木兰遗传多样性及遗传结构的研究，对其选种、育种以及野生资源的保护均具有十分重要的意义。本文在之前形态变异研究(Kang et al.，2011)的基础上，通过ISSR(inter simple sequence repeat)分子标记技术对武当木兰遗传资源进行评估，对其自然居群的遗传多样性和遗传结构进行探讨，为武当木兰资源的保护和合理开发利用提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

试验材料为武当木兰盛花期的花瓣，于2012年春采自陕西、湖北和重庆等武当木兰主要分布区。共采集试验材料71份，分属9个典型种群(表 1)。各种群在参照Kang等(2011)研究的基础上结合花色等形态特征进行划分。相邻2个种群间的距离均在50 km以上，单株间距离不少于50 m。花瓣采集后立即用锡泊纸包好，做好标记，放液氮中保存并带回实验室，之后将材料分样并转入-70 ℃超低温冰箱中保存备用。

表 1 武当木兰种群采样信息 Tab.1 Collecting data of M. sprengeri populations included in this study
1.2 试验方法 1.2.1 基因组DNA的提取与检测

采用改良的CTAB法(Allen et al.，2006)提取武当木兰基因组DNA，并利用紫外分光光度计检测DNA的纯度和浓度，1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，最后将每一样本DNA稀释到50 ng·μL-1，于-20 ℃保存备用。

1.2.2 ISSR引物的筛选

ISSR引物参照2006年加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的序列，由北京三博远志生物技术有限公司合成。用优化的反应体系，从100条引物中筛选出8条扩增条带清晰、多态性高、重复性好的引物用于武当木兰种群遗传多样性及其结构的分析(表 2)。

表 2 8条用于ISSR分析的引物及引物扩增产物的多态性① Tab.2 8 primers using for ISSR analysis and their polymorphism of amplified bands
1.2.3 PCR反应体系的构建

通过单因素和正交试验确定ISSR-PCR反应体系为: 20 μL反应体系，包括2×PCR缓冲液、50 ng基因组DNA、0.2 mmol·L-1 dNTP、0.5 mmol· L-1 Mg2+、0.5mmol·L-1引物和1 U Taq DNA聚合酶。反应在MyCycler Thermal Cycler #170-9701EDU型PCR仪上进行。反应程序为: 94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s，52～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸3 min，4 ℃保存备用。

1.2.4 扩增产物的检测

扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TBE，稳压(5 V·cm-1)，电泳2.5 h，以100 bp DNA marker作为对照，电泳结束后，在1 μg·mL-1 EB中染色5 ～10 min，之后于紫外凝胶成像系统MolecularImager® Gel DocTM XR(美国Bio-RAD公司)下检测、记录、拍照。

1.2.5 数据分析

对获取的凝胶电泳图先通过Quantity One软件进行泳道校正，在Photoshop中手动记录数据。清晰可见的条带全部用于统计分析。相同迁移位置条带的有无分别记为“1”和“0”，构建“0，1”二元数据矩阵。之后，采用POPGENE1.32软件(Yeh et al.，1999)，假设数据处于Hardy-Weinberg平衡，计算多态位点百分比(PPB)、观察等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei遗传多样性(H)(Nei，1973)和Shannon多态信息指数(I)(Lewontin，1972);同时利用该软件计算物种种群总的基因多样性(Ht)(陈少瑜等，2001)、种群内的基因多样性(Hs)(庞广昌等，1995)、基因分化系数(GST)(陈少瑜等，2001)及Nei遗传距离(GD)(Nei，1972)。基于公式Nm=0.5(1-GST)/GST估算种群间的基因流(McDermott et al.，1993)。

采用ARLEQUIN3.1(Excoffier et al.，2005)软件对种群间和种群内的遗传变异进行分子变异分析(AMOVA)。通过Mega(version 4.0)(Tamura et al.，2007)软件对Nei遗传距离进行UPGMA聚类分析。

2 结果与分析 2.1 ISSR-PCR扩增片段的多态性

8条ISSR引物对9个武当木兰种群71个个体进行分析，共检测出207个位点，每个引物检测出16 ～33个位点，平均为25.9个位点，片段长度介于150 ～2 000 bp之间，其中195个为多态性位点，即物种水平上多态位点百分比(PPB)为94.20%。引物UBC847和UBC848扩增位点的多态性最高，多态位点百分比(PPB)达100%，而引物UBC864扩增位点的多态性最低，多态位点百分比(PPB)为87.50%。

2.2 武当木兰种群遗传多样性

武当木兰种群间各遗传多样性指标的变化趋势基本一致(表 3)。不同种群之间的多样性水平存在差异，其中，种群Pop9，Pop6和Pop8的多样性水平较高，种群Pop4和Pop5的多样性水平则相对偏低。相关指标中，多态位点百分比(PPB)的最小值为26.09%，最大为84.54%;Nei遗传多样性指数(H)和Shannon多态性信息指数(I)分别处于0.105 4 ～0.167 3和0.157 8～0.276 5的范围内;观察等位基因数(Na)和有效等位基因数(Ne)则分别介于1.260 9～1.845 4和1.173 1～1.254 7之间。

表 3 武当木兰9 个种群遗传多样性① Tab.3 Genetic diversity of 9 M. sprengeri populations
2.3 武当木兰种群的遗传分化

POPGENE分析表明，9个种群总的基因多样性(Ht)为0.172 8，其中种群内的基因多样性(Hs)为0.128 4，说明武当木兰的遗传分化主要存在于种群内;AMOVA分析结果显示，种群间的遗传变异占总遗传变异的31.90%(P ＜0.001)，种群内遗传变异占总遗传变异的68.10%(P ＜ 0.001)(表 4);种群间基因分化系数GST=0.257 0，表明种群内和种群间均存在显著的遗传分化，但是种内变异对整体变异的贡献较大。基于公式Nm=0.5(1-GST)/GST估算得种群间基因流为1.445 6。

表 4 武当木兰种群AMOVA分析 Tab.4 AMOVA analysis for populations of M. sprengeri
2.4 武当木兰种群的遗传距离及聚类分析

由表 5可以看出，9个种群间遗传距离从0.012 1到0.092 9，平均为0.040 0。其中，种群Pop8和种群Pop9遗传距离最近(0.012 1)，种群Pop4和种群Pop5遗传距离最远(0.092 9)。根据武当木兰种群间的遗传距离，采用UPGMA进行聚类分析，结果显示，9个武当木兰种群被分为3大类群(图 1)。其中，种群Pop8，Pop9，Pop2，Pop6和Pop7优先聚为一类;之后种群Pop1，Pop3和Pop4聚为一类;种群Pop5与其他各种群的遗传距离均较远，最后才与其他种群聚类。

表 5 武当木兰种群间Nei遗传距离(对角线下方)和遗传相似度(对角线上方) Tab.5 Genetic distance(below diagonal) and genetic identity ( above diagonal) among M. sprengeri populations
图 1 基于Nei遗传距离的武当木兰种群UPGMA聚类 Fig. 1 UPGMA clustering graph of different M. sprengeri populations based on Nei’s genetic distance
3 结论与讨论 3.1 武当木兰的遗传多样性

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分(王洪新等，1996)，一个物种的遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强，也就越容易扩展其分布范围和开拓新的环境。

物种的遗传多样性受许多因素的影响，包括进化历史、地理分布和物种本身的生物学特征等(谢国文，2007)。研究中发现，武当木兰9个种群在物种水平的遗传多样性(H=0.171 9;I=0.288 2)低于同属红花玉兰(M. wufengensis)6个种群43个样本的AFLP结果(H=0.211 0;I=0.341 6)(贺随超等，2007)，显著低于同属濒危植物厚朴28个种群666个样本的ISSR结果(H=0.342;I=0.496)(Yu et al.，2011)。作为原始被子植物最为原始的类群之一，武当木兰的祖先具有较好的遗传基础和丰富的遗传变异，其自身本应具有较高的遗传多样性，而实际的多样性水平却不及同属的其他植物，说明进化过程可能并不是造成武当木兰遗传多样性水平降低的主要原因。武当木兰物种水平相对较低的遗传多样性应该与其生境发生变化、分布范围萎缩有关。刘玉壶等(1997)对我国14个省区的木兰科植物进行系统调查后发现，大多数木兰科植物的分布区已随生境的破坏而缩小，武当木兰也不例外。由于长期以来武当木兰被作为优质木材和药材进行采伐，其自然种群遭到了极大的破坏，这种现象在本文的研究过程中得到了进一步证实。

与武当木兰物种水平的遗传多样性相比，其种群水平的遗传多样性则更低(H=0.128 4;I=0.198 8)，低于植物种群水平遗传多样性的平均值(HISSR=0.22)(Nybom，2004)，同时也低于玉兰属其他濒危植物，如厚朴(H=0.194;I=0.286)(Yu et al.，2011)和红花玉兰(H=0.170 5;I=0.261 3)(贺随超等，2007)。武当木兰种群水平较低的遗传多样性，可能是由以下几个因素造成的:一是武当木兰种子的种皮较厚，透水透气性差，往往造成种子的萌发率低，再加上落地种子大多被虫蛀或动物啄食，种群内部基本未见更新的幼苗，因而更新换代能力严重不足;再有就是武当木兰作为名贵中药材替代品，曾被大量砍伐，长期的人为破坏，导致诸多种群转为单株式分布甚至消失，种群内部遗传多样性也迅速流失。

不同武当木兰种群遗传多样性存在较大的差异(表 2)，这种现象可能是由人为破坏和地理坏境差异共同造成的。遗传多样性最高的为种群Pop9，该种群地处长江以南湖北西南部地区，这一区域内武当木兰受人为因素干扰较少，野生资源保存较好，种群遗传多样性水平相对较高;遗传多样性较低的为种群Pop4和种群Pop5，这可能是由于种群Pop4个体数量少，而种群Pop5受特殊地理条件限制，个体间的交配局限于种群内，与其他种群缺少基因交流。

3.2 武当木兰种群间遗传结构

AMOVA分析结果显示，武当木兰的种群内部遗传变异占总变异的68.10%，种群间的遗传变异占31.90%;种群间基因分化系数GST为0.257 0，表明种群内和种群间均存在显著的遗传分化(P ＜0.001)。另根据Buso等(1998)的结论，GST值大于0.25就可以认为种群间的分化程度很大。而武当木兰的GST值达0.257 0，说明其种群间已发生了很大程度的分化。

种群的遗传结构往往会受到生境片断化、基因流、繁育系统、种子散播机制等多种因素的影响(Ge et al.，2005)。武当木兰种群间较高程度的遗传分化应该与其分布范围相对较广、生境复杂多样有关，其分布区跨越了秦岭，在秦岭南北坡不同的气候区均有分布，因此，生境的多样化是导致其遗传分化的一个重要原因。

3.3 武当木兰形态与遗传多样性的关系

原始被子植物在形态结构上往往存在着较大的变异(Endress，1987)。武当木兰作为被子植物中最为原始的类群之一，在形态特征上同样存在着变异的多态性和复杂性，但也不乏规律可循。Kang等(2011)主要依据花部特征(外侧花被片颜色、花被片数等)及地理分布将武当木兰划分为以长江为界的南北2个类群，即: M. sprengeri var. diva(红花类群)和M. sprengeri var. sprengeri(白花类群)。本研究中ISSR聚类结果则将武当木兰种群分为3大类，其中，种群Pop8，Pop9，Pop2，Pop6和Pop7为一类，种群Pop1，Pop3和Pop4为一类，种群Pop5单独为一类。将2个结果进行比较可以发现，大多数种群的ISSR聚类分析结果与Kang等(2011)的结论相一致。

第1大类群中，种群Pop8，Pop9和Pop7均分布于长江以南，花被片外侧颜色以全被片红色或粉色类型为主，属于典型的“红花类群”;种群Pop6花被片外侧呈白色或基部呈深红，在花被片数量上存在8～12片的变异，地理位置虽在长江北侧与种群Pop8，Pop9及Pop7有一江之隔，但距离较近，综合形态和分布特征可以认为是介于“白花类群”和“红花类群”之间的一个过渡类群，因此与上述种群聚为一类;种群Pop2外侧花被片基部呈深红色或呈全红色，应属于“红花类群”，而地理位置却处于秦岭北坡“白花类群”的分布区，之所以聚为一类，可能是因为受人为因素的影响，引入了其他区域的材料，使得原始种群遭到了一定程度的破坏。

第2大类群中，种群Pop1，Pop3和Pop4花被片外侧基本为全白，基部有稍许浅紫或浅粉色，花被片质地偏厚，地理位置在长江以北，属于典型的“白花类群”。

第3大类群中，种群Pop5位于湖北武当山，是武当木兰的模式产区，其花被片颜色和花被片质地与第2大类群极其相似，无论是地理分布和花色特征均应属于北方“白花类群”。但ISSR聚类则将其单独聚为一支，其原因有待于进一步研究。

3.4 武当木兰遗传资源的保护

遗传多样性是物种适应外界环境变化的潜在基础，遗传多样性的丧失不仅会降低个体的适应度也会降低物种应对环境变化的能力(Frankham et al.，2002)。维持植物种群的遗传多样性是野生植物资源得以永续利用的前提。武当木兰虽在我国许多省区均有分布，但在各分布区所占有的面积却十分有限，普遍存在着种群数量少且不完整的现象。以本研究所涉及的9个种群而言，除种群Pop9的规模较大外，其他种群的个体数量明显不足。由于生境的恶化，加上武当木兰自身较低的繁殖能力，靠自然更新扩大其种群数目和分布范围是十分困难的。因此，保护这一珍贵的物种需要做大量的基础工作。依据本文的研究结果，建议采取以下措施: 1)尽可能地保护武当木兰自然种群的原始生境，严禁破坏武当木兰种群的现象发生;2)对于像种群Pop9这样遗传多样性较高的种群开展就地保护，使其遗传多样性优势能够维持在一定的水平;3)对一些遗传多样性较低的种群如种群Pop4和种群Pop5，进行迁地保护，尽可能收集不同种群的遗传材料，以促进遗传信息在各种群间的广泛交流;4)开展武当木兰种群更新机制以及人工育苗技术的相关研究，提高武当木兰天然更新的能力，扩大其栽培的数量和范围。

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