林业科学  2014, Vol. 50 Issue (1): 63-68   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140110
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文章信息

贾小明, 张焕玲, 唐明
Jia Xiaoming, Zhang Huanling, Tang Ming
HSP::FT转基因杨树热激开花的影响因素
Factors Influencing the Heat Shock Flowering of HSP::FT Transgenic Poplar
林业科学, 2014, 50(1): 63-68
Scientia Silvae Sinicae, 2014, 50(1): 63-68.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20140110

文章历史

收稿日期:2013-06-07
修回日期:2013-10-22

作者相关文章

贾小明
张焕玲
唐明

HSP::FT转基因杨树热激开花的影响因素
贾小明, 张焕玲, 唐明    
西北农林科技大学林学院西部环境与生态教育部重点实验室 杨凌 712100
摘要:以转 HSP::FT 1基因的白杨派杂种无性系(欧洲山杨×美洲山杨)为试材,系统研究影响FT基因热激表达诱导杨树早期开花的各种因素,为 HSP::FT基因在木本植物中有效诱导正常开花提供基础数据。结果表明:不同转基因株系、同一株系的不同单株、转基因材料的株高及年龄(热激前温室生长时间)、热激温度及热激时间、环境温度等因素均影响转基因植株的热激开花。同一基因型的不同转基因株系以及同一株系不同单株热激诱导开花存在显著差异。开花率随热激材料株高的增加呈上升趋势,株高小于30 cm的转基因植株不能诱导开花。转基因植株在温室培养的时间越长,热激后开花越早,开花率越高。热激温度影响热激材料的初始开花时间、开花率及正常花序得率,最佳热激温度为40℃。转基因植株的热激诱导开花,在早期主要受每天热激时间的影响,在后期主要受持续热激天数的影响,持续热激3周以上可有效提高开花率及正常花序得率。热激前转基因材料在较低的环境温度下生长,有利于热激诱导开花及获得正常花序。
关键词FT基因    杨树    热激诱导    早期开花    影响因素    
Factors Influencing the Heat Shock Flowering of HSP::FT Transgenic Poplar
Jia Xiaoming, Zhang Huanling, Tang Ming     
Key Laboratory of Environment and Ecology in Western China of Ministry of Education College of Forestry, Northwest A & F University Yangling 712100
Abstract: In order to understand the underline mechanism for inducing normal flowering efficiently by HSP::FT construct on forest trees, transgenic poplar plants (Populus tremula × P. tremuloides) containing HSP::FT 1 were used as the experimental material to investigate factors affecting FT gene expression to induce precociously flowering of poplar by heat shock treatment in this paper. The results showed that the factors, such as transgenic lines and ramets, plant size and age, heat shock temperature, heat induction duration, and environment temperature, all affected FT gene expression to induce flowering of transgenic plants. Different transgenic lines and different ramets in the same line varied significantly in the induced flowering. Plants with a height lower than 30 cm failed to flower. Flowering frequency increased with increasing height of plants. Heat shock temperature affected initial flowering time, flowering frequency and normal catkin yields. The optimum temperature was 40℃. Flowering of transgenic plants by heat shock was mainly influenced by daily heat induction hours at early stages and by heat induction duration at later stages. The continue heat treatment for more than 3 weeks was efficient to induce flowering. It was beneficial to flowering induction and normal catkin development if transgenic plants grew at lower environment temperature before heat treatment.
Key words: FT gene    poplar    heat shock induction    precociously flowering    influence factors    

FT(Flowering Locus T)基因是在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆得到的开花基因,其表达产物就是成花素的主要成分,控制着拟南芥等植物的季节性开花(Corbesier et al.,2007)。目前已经在小麦(Triticum aestivum)(Yan et al.,2006)、南瓜(Cucurbita)(Lin et al.,2007)、番茄(Solanumlycopersicon)(Lifschitz et al.,2006)、杨树(Populus)(Böhlenius et al.,2006;Hsu et al.,2006;Shen et al.,2012)等多种植物中克隆出了FT的同源基因,并对部分植物进行了遗传转化,FT类基因的过量表达均不同程度地引起了转基因植株的早期开花。

杨树是世界范围内广泛栽培的重要用材、生态树种,研究FT基因促进杨树早期开花,对于缩短杨树幼年期,进而缩短杨树遗传改良周期具有重要意义。目前,FT基因在杨树中的研究主要集中在FT同源基因克隆、遗传转化方面。已经克隆了美洲黑杨(P.deltoides)(Hsu et al.,2006)、毛果杨(P.trichocarpa)(Böhlenius et al.,2006)、小叶杨(P.simonii)(Shen et al.,2012)的FT同源基因,并研究了各种FT基因对拟南芥及杨树的早期促花性能。这些研究中,在构建FT基因植物表达载体时,使用的均是组成型启动子CaMV35S,FT基因的过量表达虽然均可引起转基因植株的早期开花,但诱导的花多为异常花,多数不能产生有育性的配子(Hsu et al.,2006;Böhlenius et al.,2006;Flachowsky et al.,2009)。有研究证明,大豆(Glycine max)热激蛋白启动子HSP(heat shockpromoter)驱动拟南芥FT基因在拟南芥中诱导表达,其花器官变异较小(Crone et al.,2001;Huang et al.,2005)。之前的初步研究也表明,HSP驱动的FT转基因杨树,早期花器正常花序数目比组成型启动子CaMV35S驱动的多(贾小明等,2011a;2011b;Zhang et al.,2010)。

HSP是热激诱导启动子,热激材料的生长发育状态(植株大小与年龄)、热激诱导条件(热激温度与热激时间)等很多因素均会影响其下游目的基因的顺利表达。因此,研究影响HSP::FT基因热激诱导表达的因素,得到大量早期正常花器,是HSP::FT基因在杨树乃至木本植物中成功应用的关键,但至今还未见该方面的系统研究。本研究以转化HSP::FT1基因的白杨派杂种无性系T89(P.tremula×P.tremuloides)为研究材料,系统研究了影响FT1基因表达促进杨树早期开花的因素,旨在为HSP::FT在木本植物中有效诱导正常开花提供基础数据。

1 材料与方法 1.1 HSP::FT1植物表达载体

HSP::FT1表达载体由美国Strauss教授惠赠。该载体为Gateway双元表达载体Pk2GW7,包含大豆热激蛋白启动子HSP及下游的FT1基因(来自毛果杨),选择性标志基因为新霉素磷酸转移酶基因(NPTⅡ)。

1.2 植物材料及其转化和植株再生

供试杨树为白杨派杂种无性系T89试管苗。HSP::FT1转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404参考Holstein等(1978)的方法,T89再生、转化参照Tuominen等(1995)的方法。转基因植株的PCR检测参照Filichkin等(2005)的方法,PCR扩增顺式引物为5’-ACGCACTAGTATGTCAAGGGACA-3’,反式引物为5’-TCAGATATCTTATCGCCTCCTACC-3’。

1.3 转基因植株培养及热激诱导开花

将经PCR检测呈阳性的20个转基因株系试管扩繁、生根,长至8~10 cm高时,从组培瓶中移栽至装有灭菌移栽基质的塑料容器中(口径5 cm),浇水后放在装水的密封塑料袋内炼苗3周后移至温室培养。待苗高至15 cm时,移栽到20 cm×20 cm的塑料培养容器中。温室温度春夏季(27±2)℃,秋冬季(23±2)℃,光照时间每天16 h,光照强度120μmol·m-2 s-1。每天浇水1次,每周施液体肥料1次(N,P,K体积比为20:20:20)。

当转基因植株温室生长2~9个月后,选取不同温室培养时间、不同株高的转基因植株,移至智能人工气候箱(BP1500GS-B1500L,光强为110μmol·m-2 s-1)中,在不同条件下进行系统的热激诱导开花试验。热激处理时间以气候箱内部温度稳定在所需温度时开始计时。

热激试验中每个处理重复热激3次,每次每个转基因株系重复5株,不同转基因株系的热激材料在培养箱中随机摆放。

热激试验设2个对照(CK),用来检测在正常培养条件下HSP::FT1表达框架是否会诱导转基因材料的早期开花。其中,CK1为T89杨非转基因无性系,同转基因株系一同进行热激处理;CK2为T89杨转基因株系,不进行热激处理,温室生长。

热激处理后从植株上出现第1个可见花芽开始至开花结束,每天统计每个转基因株系的初始开花时间、开花个体数以及每个植株上的花芽数、正常花序数目等指标。

1.4 试验数据的统计分析

试验数据使用统计软件SPSS 19.0进行统计分析,开花率用χ2检验,平均花朵数目用F检验。

2 结果与分析 2.1 不存在非诱导开花

在热激试验中,设置了2个对照,试验结果既未发现非转基因杨树材料在热激条件下开花,也未发现转基因杨树材料在非热激条件下开花,这与Zhang等(2010)的研究结果一致。这表明,在正常培养条件下,HSP::FT1表达框架不会诱导转基因杨树的提早开花,保证了热激试验数据的可靠性。

2.2 不同转基因株系及同一株系不同个体热激诱导开花存在差异

供试材料总共有20个经检测的转基因株系,但只有40%的转基因株系(8个株系)中部分植株开花,超过半数以上的株系以及开花株系中40%~80%的植株未能诱导开花(图 1,温室生长6个月、株高在60 cm以上、37 ℃每天热激1 h持续热激3周条件下的试验数据)。开花株系间的开花率差异显著(χ2检验,P=0.038 5),在20%~60%之间。

图 1 8个诱导开花的转基因株系的开花率!--中文标题--> Fig. 1 Flowering frequency of 8 transgenic events induced to flower
2.3 转基因植株热激前的株高影响热激诱导开花

选取开花率中等、温室生长3个月的55号转基因株系为试材,对转基因植株热激前的株高进行分级,在37 ℃每天热激1 h持续热激2周条件下,研究转基因植株热激前的株高对FT诱导开花的影响。χ2检验表明,热激时的株高对FT诱导开花的影响达显著水平(P=0.025 6)。株高小于30 cm的植株均未开花;株高大于30 cm的转基因植株,诱导开花率随株高增加呈上升趋势(图 2)。

图 2 转基因植株初始高度与热激开花率 Fig. 2 Flowering frequency in relation to initial height of transgenic plants
2.4 转基因植株热激前温室培养时间影响热激诱导开花

供试材料是来自开花率高于40%的5个转基因株系(2号、17号、98号、41号、55号株系),选择移至温室生长不同时间、株高大于60 cm的植株,热激处理温度为37 ℃,每天热激处理1 h持续热激3周。结果显示,转基因植株热激前的温室培养时间影响其热激诱导后初始开花时间与开花率(图 3)。热激前温室培养时间越长,初始开花时间越早,热激开花率越高。大于6个月龄的植株,开花时间比3月龄的植株提前了3~4天,开花率提高了16%~20%。尽管6月龄与9月龄植株的初始开花时间与终开花率没有明显差异,但9月龄植株集中开花时间比6月龄的提前了约9天时间。这说明年龄越大的植株,热激后的植株越容易被诱导开花。

图 3 转基因植株年龄对热激开花的影响 Fig. 3 Effects of transgenic plants age on flowering by heat shock
2.5 热激条件对诱导开花的影响 2.5.1 热激温度的影响

以2号转基因株系中温室生长6个月、株高大于60 cm的植株为试材,在不同温度下每天热激1 h持续热激3周条件下,研究热激温度对诱导开花的影响。结果表明,热激温度影响转基因植株的初始开花时间、开花率(图 4A)以及正常花序得率(图 4B)。

图 4 热激温度对转基因植株热激诱导开花的影响 Fig. 4 Effects of heat shock temperature on induced flower of transgenic plants A. 热激温度对开花率及初始开花时间的影响;B. 热激温度对正常花序得率的影响。A. Effects of heat shock temperature on flowering frequency and initial flower time; B. Effects of heat shock temperature on frequency of normal flowers.

34~40 ℃范围内,随着热激温度的升高,转基因植株初始开花时间提前,37 ℃比34 ℃提前2周,40 ℃比37 ℃提前约1周。温度高于40 ℃,对初始开花时间无显著影响。34~43 ℃范围内,随着温度的升高,开花率始终呈现上升趋势。

为了更深入地了解热激温度对花芽后续发育的影响,对热激停止后的花序发育过程进行2周的跟踪观察。χ2检验表明,热激温度对诱导正常花序的产生差异显著(P=0.025 4)。在34~40 ℃温度范围内,正常花序得率随着热激温度升高而增加,高于40 ℃时,正常花序得率开始下降(图 4B),体现在单朵花及两性花增加、回复营养生长的花序增加等方面。因此,诱导FT基因表达促进开花的最佳有效热激温度是40 ℃。

2.5.2 热激时间的影响

以温室生长6个月、株高大于60 cm的2号转基因株系为试材,在37 ℃条件下研究热激时间对热激诱导开花的影响。结果(图 5)显示:在热激处理的2周内,2 h热激处理比1 h更易于诱导开花,表现在第1周内,2 h热激处理获得了更高的开花率与正常花序得率;第2周内,1 h热激开花率为28.2%,2 h热激开花率为62.3%,但正常花序得率无明显差异。持续热激3周后,热激处理1 h和2 h的开花率无明显差异。这说明每天1 h和2 h热激处理时间对诱导开花的影响仅体现在热激处理的早期,之后影响FT基因热激诱导表达的主要因素是热激持续的时间而非每天热激的时间。

图 5 热激时间对转基因植株热激诱导开花的影响 Fig. 5 Effects of heat shock time on induced flower of transgenic plants

在每天热激时间相同的情况下,随着持续热激时间的增加,开花率增加,但持续热激时间在3周以上时,开花率趋于平稳。尽管3~6周的持续热激时间对转基因株系的开花率影响不大,但正常花序得率却一直呈现上升趋势。在试验中还发现,较长时间的持续热激,可有效抑制花序回复营养生长,即有效抑制花序向营养生长的逆转;而且,在花药数目及成熟度方面,较长的持续热激时间是有利的(数据统计不完整,未提供)。这都说明,在热激过程中,延长热激处理的时间,可以降低花序回复营养生长的频率,增加发育正常的花序数目。

2.6 热激处理时环境温度对热激诱导开花的影响

先后在夏季和冬季做了热激诱导开花试验,转基因植株除了热激处理是在光照培养箱中进行外,其他时间都是在玻璃温室中生长的。玻璃温室的温度控制在25 ℃左右,但由于四季外界温度的变化,温室的温度也会随季节和日照长短发生变化,夏季为(27±2)℃,冬季为(23±2)℃。结果表明,温室温度的变化也会影响FT基因的表达以及转基因植株的花发育。

图 6是开花率较高的5个转基因株系,在不同季节温室生长6个月、株高在60 cm以上、37 ℃每天热激1 h持续热激3周时,统计的株系开花率及开花单株平均诱导花朵数目。

图 6 环境温度对转基因植株热激诱导开花的影响 Fig. 6 Effects of environment temperature on induced flower of transgenic plants

图 6中可看出,较低温室温度条件下生长的转基因株系,无论是开花率还是平均花朵数目,均高于较高温室温度条件下生长的株系。温室温度对转基因株系开花率的影响,除了41号株系差异不显著外,其他4个株系差异均达显著水平(χ2检验,2,17,98,55号株系P值分别为0.023 8,0.014 5,0.024 1,0.013 8)。对平均花朵数目的影响,除了2号、98号差异不显著外,其他3个株系差异均达显著水平(F检验,P < 0.01)。造成这种结果的原因,可能是热激条件下,植株从营养生长向生殖生长转变与植株本身的营养生长状态有关。

3 讨论

本文研究了影响FT基因热激诱导表达促进转基因杨树早期开花的各种因素,包括转基因株系及热激材料的大小、热激条件及热激环境温度等,研究结果对热激启动子控制的FT基因在木本植物中的有效应用具有指导价值。

研究结果表明,杨树不同转基因株系及同一转基因株系的不同个体是影响FT基因热激表达的内因之一,这与Zhang等(2010)的研究结果一致。事实上,在之前的研究中就发现杨树基因型是影响FT表达的主要内因(贾小明等,2011a;Zhang et al.,2010)。这表明,FT基因的热激表达在受体种内表现在3个层次的差异,即FT基因在不同基因型、同一基因型的不同转基因株系、同一转基因株系的不同个体内表达是有差异的。分析产生差异的原因,在基因型上的差异可能是因为受体遗传基础不同造成的。在转基因株系及个体间的差异可能是由于FT基因插入杨树基因组的不同位点影响的结果,例如插入位点位于正向调节元件周围或位于反向调节元件周围,会导致FT基因不同的表达强度和特异性;或者插入异染色质区而非常染色质区域时,由于其与周边序列碱基组成的差异,都可以引起基因沉默,从而失去表达的能力。这种现象在杨树(Kumar et al.,2001)和其他树种的转基因研究中(Beaujean et al.,1998;Miki et al.,2009;Silicheva et al.,2010)很常见。

植株大小影响林木开花早有报道(Longman et al.,1959;Chalupka et al.,1997)。Zhang等(2010)在对转FT基因的353、717杨树无性系研究中也发现植株大小影响FT诱导转基因材料开花,说明开花基因的表达依赖于植株的大小和发育程度。在本研究中,植株热激前的株高、年龄是影响FT热激表达的又一内因,高度和年龄与热激后的开花能力呈正相关,热激植株的年龄主要影响热激诱导开花时间,说明热激诱导FT基因表达促进植株开花需要一个年龄或者发育时期的底线。年幼的分生组织,要么对开花信号无反应,要么反应比较迟钝。此外,虽然本文没有统计植株大小与花序发育之间的数据,但在试验中发现,越小的植株,保持花序分生组织活力和继续发育的能力越差,常常导致单朵花、花序变短、花器不完整等异常花的产生。

热激温度、热激时间是影响FT表达的主要外因,这主要与所使用的启动子和受体材料有关。虽然较高温度有利于转基因植株早开花、多开花,但温度过高(> 40 ℃),会降低正常花序的比例。对HSP启动子和FT基因而言,热激诱导转基因植株开花,在早期主要受每天热激时间的影响,后期主要受持续热激天数的影响。持续热激天数与开花率及正常花序得率呈正比,这可能是由于增加热激天数可使FT表达产物的剂量超过诱导开花的临界剂量所致。

较低的环境温度有利于转基因植株的热激诱导开花,这种影响可能是间接的,可能是植物季节性休眠的特性所致。自然界杨树开花必须经过低温诱导,在对拟南芥开花的分子生物学研究中也发现,与温度相关的基因是FLC(FLOWERING LOCUS C),FLCFT基因转录的反向调节因子。在叶片中,FLC通过抑制FT基因的表达延迟开花,在茎尖,它通过抑制FDSOC1的表达抑制FT的表达(Searle et al.,2006)。低温强烈抑制FLC的转录,从而增加FT的转录(Michaels et al.,2001)。FT热激诱导开花需要较高的热激温度,热激植株热激前却需要在较低的环境温度下生长,前者是启动子的需要,后者似乎是启动转录后FT过量表达的需要。受此启发,转基因植株在热激诱导开花前经过一个自然越冬休眠过程,可能会提高正常花序的得率,这点非常值得研究。

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