林业科学  2013, Vol. 49 Issue (12): 97-100   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20131214
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文章信息

郭涛, 戴景程, 朱敏
Guo Tao, Dai Jingcheng, Zhu Min
钾胁迫条件下Ca2+信号抑制剂对外生菌根真菌分泌H+的影响
Effects of Ca2+ Signal Inhibitors on H+ Effluxes by Ectomycorrhizal Fungi under Potassium Stress
林业科学, 2013, 49(12): 97-100
Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(12): 97-100.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20131214

文章历史

收稿日期:2012-11-01
修回日期:2013-10-05

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郭涛
戴景程
朱敏

钾胁迫条件下Ca2+信号抑制剂对外生菌根真菌分泌H+的影响
郭涛1, 2, 戴景程1, 朱敏1    
1. 西南大学资源环境学院 重庆 400716;
2. 国家紫色土土壤肥力与肥料效益监测基地 重庆 400716
摘要:为了研究钾胁迫条件下外生菌根真菌分泌H+的调控机制,以从强酸性森林土壤中分离获得的菌株褐环乳牛肝菌(Sl01)、牛肝菌(Bo08)以及土生空团菌(CgSIV)为材料,采用液体培养方法,研究低钾胁迫下外生菌根真菌的生长与H+分泌的关系,以及Ca2+信号抑制剂对H+分泌的影响。结果表明:在正常供钾条件下,3种菌株的生长与H+的分泌未受到Ca2+信号抑制剂的显著影响;而在低钾条件下,Ca2+信号抑制剂三氟拉嗪(TFP)和钙离子螯合剂EGTA都显著减少菌株Bo08和Sl01的H+分泌,即在此试验条件下,Bo15和Sl08的H+分泌均受到Ca2+信号转导的调控,说明在低钾胁迫条件下,Ca2+信号是介导外生菌根真菌分泌H+的信号因子。
关键词    钙调蛋白抑制剂    外生菌根真菌    
Effects of Ca2+ Signal Inhibitors on H+ Effluxes by Ectomycorrhizal Fungi under Potassium Stress
Guo Tao1, 2, Dai Jingcheng1, Zhu Min1     
1. College of Resources and Environment, Southwest University Chongqing 400716;
2. National Monitoring Base for Purple Soil Fertility and Fertilizer Efficiency Chongqing 400716
Abstract: In this study, Suillus luteus (Sl01) and Boletus sp. (Bo08), isolated from the acidic forest soil, and Cenococcum geophilum (CgSIV) were cultured in liquid media with various potassium concentrations and Ca2+ signal inhibitors to investigate mechanism of H+ effluxes by ectomycorrhizal fungi (ECMF) under low potassium stress. The results showed that in normal potassium concentration, H+ effluxes by ectomycorrhizal fungi of the three isolates were not inhibited by trifluoperazine (TFP) and ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA). In low potassium concentration, the H+ efflux by Bo08 and Sl01 was decreased significantly in the presence of TFP and EGTA. The results suggested that Ca2+ would be a signal factor that could regulate H+ efflux by Bo08 and Sl01 in this experiment conditions of low potassium stress on the fungi.
Key words: potassium    Ca2+ signal inhibitors    ECMF    

钾是树木需要量最多的必需营养元素之一。森林通常不施肥,主要依靠树木的根系吸收土壤环境中的钾来满足自身营养的生理需要。外生菌根真菌(ECMF)感染树木根系后形成共生体-外生菌根(ECM),分泌H+(Yuan et al.,2005)不仅能够吸收土壤中的有效钾,也能利用土壤中的无效钾,如非膨胀性2 : 1型矿物的层间钾和晶格钾(Yuan et al.,2004),从而改善宿主植物生长的钾营养状况,促进林木的生长。

Ca2+作为重要的第二信使,调控细胞生命活动,几乎所有的胞外刺激都能引起细胞内游离Ca2+浓度的改变(Reddy et al.,2004)。小麦(Triticum aestivum)和玉米(Zea mays)等根系通过根尖细胞质膜上的阴离子通道分泌有机酸,位于质膜的信号转导串联体参与阴离子通道的激活与抑制(Ma et al.,2001;Ryan et al.,1997)。唐新莲等(2008)研究表明:在黑麦草(Secale cereale)根尖胞质中,游离Ca2+可能是铝诱导根系分泌柠檬酸和苹果酸的胞内信号因子。在欧洲强酸性土壤中,在ECMF共生的树木根际土壤中可检测到高达1 000 μmol·L-1的有机酸(van Heesa et al.,2003)。在纯培养条件下,缺钾刺激ECMF分泌H+,分泌量是对照的13~28倍(袁玲等,2001)。

在低钾胁迫条件下,外生菌根真菌分泌H+的速率提高,从信号转导的角度出发Ca2+是否参与了低钾诱导的H+分泌,目前尚无这方面的报道。本试验设置了不同的钾处理条件,利用Ca2+螯合剂和钙调蛋白抑制剂等研究ECMF分泌H+的信号转导,旨在探明低钾胁迫条件下ECMF胞内Ca2+信号对H+分泌的调控作用。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

从重庆市金佛山国家级自然保护区马尾松(Pinus massoniana)强酸性森林土壤(pH≤4.5)中分离获得褐环乳牛肝菌(Suillus luteus)(Sl01)、牛肝菌(Boletus sp.)(Bo08),以及采自西班牙火炬松(Pinus teada)森林土壤的土生空团菌(Cenococcum geophilum)(CgSIV)为供试菌种。

1.2 试验设计

取上述菌种原始菌株,接种于Pachlewski固体培养基上。培养基的组成为: 0.5 g·L-1酒石酸铵、1.0 g·L-1磷酸二氢钾、 0.5 g·L-1硫酸镁、 20 g·L-1葡萄糖、 0.1 g·L-1维生素B1、 20 g·L-1琼脂和1mL·L-1微量元素混合液[内含8.45 mg H3BO3,5 mgMnSO4,6 mg FeSO4,0.625 mg CuSO4,2.77 mg ZnCl2和0.27 mg(NH4)2MoO4]。用1.0 g·L-1磷酸二氢钠代替Pachlewski液体培养基中的磷酸二氢钾,分别加入0.13 g·L-1(低钾)、 0.65 g·L-1(高钾)形成低钾和正常钾2种处理(袁玲等,2001),培养21天后加入0.1 mol·L-1 CaCl2溶液1 mL预处理24 h。过滤收集菌丝后重新培养于含有不同类型、不同浓度Ca2+信号抑制剂的Pachlewski液体培养基中,其中,Ca2+信号抑制剂的种类和浓度选择依据文献(王明霞等,2012;唐新莲等,2008),具体设置如下: 1)钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪(TFP): 0,25,100μmol·L-1;2)Ca2+螯合剂乙二醇双(2-氨基乙基)四乙酸(EGTA): 0,0.25,1.0 mmol·L-1。培养48 h后测定其生物量、氮磷钾含量和草酸分泌量。每个设置5次重复。

1.3 测定项目与方法

采用80 ℃烘干称重法测定菌根真菌的生物量;外生菌根真菌经H2SO4 -H2O2消化后得到消化液,并分别采用纳氏试剂比色法、钒钼黄比色法、火焰光度法测定外生菌根真菌菌丝的氮、磷、钾含量(鲍士旦,2000)。用pH电位计测定培养液中的H+浓度。

2 结果与分析 2.1 低钾条件下钙调蛋白TFP对外生菌根真菌生长的影响

同一钾浓度条件下不同菌种之间的生物量差异显著,表现为Bo08 > Sl01 > CgSIV。培养液中钾离子浓度明显影响了菌丝真菌的生长状况(表 1),低钾处理时3种菌株的生物量都明显低于正常钾时的生物量,例如未添加TFP时,菌株CgSIV的生物量减少了49.93%,Bo08的菌丝生物量减少了40.48%,表现为前者的耐低钾胁迫能力要低于后者。但不同浓度的TFP对真菌的生物量没有明显的影响。

表 1 不同钾条件下TFP对外生菌根真菌生物量的影响 Tab.1 The dry weight of ectomycorrhizal hyphae under different potassium and TFP treatments
2.2 低钾条件下TFP对外生菌根真菌氮、磷、钾含量的影响 2.2.1 氮含量

不同菌株之间的菌丝氮含量差异较大(表 2),表现为菌株CgSIV显著低于其他2个菌株。低钾胁迫显著影响菌丝真菌的含氮量,菌株Bo08和CgSIV在正常钾时显著高于低钾时的氮含量,说明钾可以提高部分菌丝真菌的氮含量,促进氮素的吸收,而菌株Sl01在不同钾离子浓度下菌丝真菌氮含量差异不显著。而对于不同浓度TFP处理,在正常供钾处理时,每一个菌种的氮含量差异不显著,但是对于低钾培养的CgSIV而言,在高浓度TFP处理后,其菌丝氮含量明显降低。

表 2 不同钾条件下不同浓度TFP处理对外生菌根真菌菌丝氮、磷、钾含量的影响 Tab.2 The content of nitrogen,phosphorus and potassium in ectomycorrhizal fungi under different potassium and TFP treatments
2.2.2磷含量

不同菌株之间的菌丝磷含量差异较大(表 2),表现为菌株CgSIV显著低于其他2个菌株,但TFP阻断剂处理未显著影响菌丝的磷含量。

2.2.3 钾含量

Bo08的钾含量明显高于其他2个菌株(表 2),即钾含量的大小顺序为Bo08 > Sl01 >CgSIV。Bo08和Sl01在正常钾处理时钾含量显著高于低钾处理时,而TFP处理整体上对菌丝真菌钾含量的影响差异不显著。

2.3 不同供钾条件下TFP对外生菌根真菌分泌H+作用的影响

总体上不同菌株H+分泌的作用差异显著,Sl01> Bo08 > cgSIV表 3。相对于正常供钾水平,低钾处理都显著促进了各个菌株的H+的产生,其中菌株cgSIV在没有添加TFP时,H+增加了99.11%。

表 3 不同钾条件下TFP对外生菌根真菌分泌H+作用的影响 Tab.3 The effect of different potassium and TFP on H+ efflux by ectomycorrhizal fungi

在正常供钾条件下,TFP处理对3种菌株产生H+的影响差异不显著;而在低钾条件下,菌株Sl01和菌株Bo08的H+的分泌随着TFP浓度的增加而显著降低,与不添加TFP的处理相比,在25,100μmol·L-1处理时Bo08分泌的H+分别减少了22%和30%,Sl01分别减少了10%和17%,但CgSIV未受到显著影响。

2.4 不同供钾条件下EGTA对外生菌根真菌分泌H+作用的影响

表 4所示,不同菌株分泌H+作用对EGTA处理的响应与对TFP的响应类似。在正常供钾条件下,EGTA处理对3种菌株产生H+的影响差异不显著;而在低钾条件下,菌株Sl01和菌株Bo08的H+的分泌随着TFP浓度的增加而显著降低,与不添加TFP的处理相比,在25,100 μmol·L-1处理时Bo08分泌的H+分别减少了13%和31%,Sl01分别减少了11%和16%,但CgSIV未受到显著影响。

表 4 不同钾条件下EGTA对外生菌根真菌分泌H+作用的影响 Tab.4 The effect of different potassium and EGTA on H+ efflux by ectomycorrhizal fungi
3 结论与讨论

为了适应自然条件下的低钾环境,生物体一方面直接分泌H+,另一方面通过分泌有机酸再形成H+,都可有效活化环境中的钾源;前者的分泌量是后者的6~30倍,因此理论上直接分泌H+在这方面具有更重要的作用(袁玲等,2001)。

H+和K+均属一价阳离子,但H+的离子半径小于K+,H+对层间钾具有较强的取代作用。对植物来说,膨胀性2: 1型黏粒矿物的部分层间钾属于缓效钾,非膨胀性2: 1型黏粒矿物的层间钾则更难被吸收利用(Menge et al.,1993)。在无钾和低钾条件下,菌根真菌能分泌较多的H+,可能有利于黏粒矿物层间钾的释放,这是外生菌根真菌和外生菌根活化土壤无效钾的机制之一(Yuan et al.,2004),从而提高钾的营养水平进而促进生长,在本研究中得到了进一步的证实。

胞内游离Ca2+作为第二信使,直接或间接调节多种生物学过程,包括细胞对逆境胁迫的响应,引发与提高抗性有关的级联反应(Reddy et al.,2004)。用铝处理小麦和黑麦根尖,胞质内的游离Ca2+浓度增加,胞质Ca2+的增加部分来源于细胞外和细胞内,进而激活小麦根尖细胞的阴离子通道使苹果酸分泌量增加(Zhang et al.,2001)。胞内Ca2+介导铝诱导黑麦根系分泌有机酸的胞内信号因子,而质膜上的阴离子通道可能是铝诱导的Ca2+信号转导途径中的下游效应器(唐新莲等,2008)。目前,关于ECMF分泌草酸的调控机制已有部分研究(王明霞等,2012;唐新莲等,2008),但是作为在低钾环境下生物适应中具有更重要作用的分泌H+的调控机制研究甚少。本研究发现,在正常供钾条件下,3株供试ECMF的分泌作用均未响应Ca+信号抑制剂,说明在此试验条件下,ECMF分泌H+在钾正常供给时,未启动钙参与诱导H+分泌的信号转导,但在低钾胁迫条件下,2种Ca2+信号抑制剂都不同程度地显著减少了H+的产生量,说明Ca2+信号参与调控了低钾诱导的H+分泌,这与铝胁迫下外生菌根真菌分泌草酸(Wang et al.,2012)有相似的机制。

值得注意的是,供试菌株分泌H+对不同Ca+信号抑制剂的敏感性不同,Bo08和Sl01对钙调蛋白抑制剂TFP和Ca2+螯合剂EGTA敏感,H+分泌降低;但EGTA处理时菌株的H+分泌的减少量少于TFP处理时,说明胞内Ca2+信号的形成与胞内钙库关系密切(Wang et al.,2012)。而菌株CgSIV生长较差,H+分泌量一直较少,且未受到钙调蛋白抑制剂的显著抑制作用,这一方面说明了不同菌种之间的生物多样性,另一方面需要选择适宜的菌种,促进林木生长。

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