漆酶是一类含铜的多酚氧化还原酶，广泛存在于多种生物体内(Giardina et al.，2010)。漆酶能催化降解水中有机污染物，如酚类、芳胺类、羧酸及其衍生物等，亦可降解木素，因而，漆酶在纸浆漂白、竹木板材生产、处理纸浆废水等林产化工领域具有巨大的应用潜力(赵敏等，2008;王炎等，2008)。但游离漆酶在溶液中容易变性和失活、反应后难以分离回收、无法重复使用、污染产物等缺点，限制了漆酶的应用(Krajewska，2009)。而漆酶经过固定化处理后稳定性增加，易从反应系统中分离，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于规模化生产(杨宇翔等，2011)。固定化技术极大拓宽了漆酶的应用范围，已成为当前研究的前沿领域。通过固定化技术获得性能优越的固载酶，固载基质材料的制备是关键。氧化纤维素是具有高反应活性基团的纤维素衍生物分子，具有良好的生物相容性，是一种潜在的理想载体材料(Sirvio et al.，2011)。但是由于纤维素的高度结晶性和难溶性，氧化纤维素的制备反应都在多相介质中进行，反应多在纤维素的表面进行，这种局部区域的不可及性，妨碍了反应的均匀进行，因此依靠传统方法制备的氧化纤维素载体材料往往不尽如人意(Noriyuki et al.，2011)。

本工作将无机晶体材料制备等领域的水热合成法引入氧化纤维素制备工艺中，将新方法制备的固载材料应用于漆酶的固定化(王炎等，2008;Qiu et al.，2010)，对比分析新型氧化纤维素基固载漆酶与交联壳聚糖、双醛淀粉固载漆酶的酶学性能，尝试建立固载漆酶的酶学性能理论方程。

微晶纤维素(层析级，Acros organics公司)，壳聚糖(脱乙酰度≥90%，国药集团化学试剂有限公司)，双醛淀粉(醛基含量﹥ 80%，北京鑫鼎有限公司)，高碘酸钠(AR，阿法埃莎公司)，2，2'-连氮-双(3-乙基并噻-6-磺酸)(ABTS，AR，Sigma)，漆酶(Laccase，≥20 U·mg^-1，Sigma-aldrich上海贸易有限公司)。其他试剂均为分析纯，试验用水为双蒸水。

在传统方法制备氧化纤维素的基础上，引入水热合成反应(Tavolaro et al.，2012):微晶纤维素经简单蒸爆处理后置于浓度14%的NaOH溶液中活化24 h后，蒸馏水洗至中性。活化微晶纤维素与1:2倍质量的NaIO4置于水热合成反应釜(25 mL，不锈钢外套，聚四氟乙烯内衬)内胆中，蒸馏水填充系数0.6～0.9，130 ℃密闭水热合成反应8 h，洗涤固体，抽滤干燥。

醛基含量测定(Sirvio et al.，2011):定量样品加入100 mL锥形瓶中，0.20 mol·L^-1 NaOH 10.0mL溶解样品，70 ℃水浴加热2 min，取出冷却后加入0.10 mol·L^-1 H₂SO₄ 15.0 mL和蒸馏水30.0 mL，酚酞为指示剂，0.20 mol·L^-1 NaOH滴定至终点。产物醛基含量按式(1)计算:

式中: H(醛基含量)为100个葡萄糖单元所含醛基数;m为样品质量;C₁为NaOH浓度;V₁为消耗NaOH体积;C₂为H₂SO₄浓度;V2为加入H₂SO₄体积。

IRPrestige-21型傅里叶红外光谱仪(Shimadzu，日本)测定样品的红外光谱，KBr压片法，扫描范围500～4 000 cm^-1(Oh et al.，2005)。AVANCE II/400 MHz(Bruker，瑞士)核磁共振仪测定产物的CP/MAS¹³C NMR固体核磁谱，频率¹³C 75 MHz，魔角自旋速度3.8 MHz，分辨率4.88 Hz;内参考物:氨基乙酸(Princi et al.，2004)。XRD6000型粉末衍射仪(Shimadzu，日本)分析各样品的结晶度，扫描方式:定性，步进扫描;扫描范围: 2θ: 5°～50°;扫速:10°· min^-1;步长: 0.02°;电压/电流: 35 kV/30mA;Cu靶(Alemdar et al.，2008)。SS-550型扫描电子显微镜(Shimadzu，日本)观察分析各样品的表观形貌。

氧化双醛纤维素、戊二醛交联壳聚糖(3%戊二醛37 ℃交联1.5 h)、双醛淀粉均匀分散于0.1 mol·L^-1醋酸盐缓冲溶液(pH=4.6)中，加入漆酶，28 ℃反应6 h后取出，蒸馏水洗去游离漆酶。紫外法测定游离漆酶与固定化漆酶的活力。凯氏定氮法测定载体上固载酶的氮含量W(N)(Noriyuki et al.，2011)，根据式(2)计算固定化酶含量(%):

固定化酶和游离酶在不同温度和不同pH条件下进行酶促反应，按1.4.1节方法测定酶活力。

固定化漆酶与底物(ABTS)在32 ℃下连续反应10次，过滤取出固定化酶，蒸馏水洗净，按1.4.1节方法测定酶活力并比较分析。测定游离漆酶与固定化漆酶催化分解0.1～0.5 mol·L^-1底物溶液(0.1 mol·L^-1 HAC-NaAC缓冲液，pH=4.6)的反应速率，用底物浓度的倒数和反应速率的倒数作图，线性拟合获得米氏常数Km值(Duron et al.，2002)。

法制备氧化纤维素的方程式如下:

碱消耗法测定水热合成制备的氧化纤维素(DAC-A)以及传统方法制备的氧化纤维素(DACB)的醛基含量，DAC-A的醛基含量为82.1%，而DAC-B的醛基含量为63.4%，可见，水热合成法明显提高了氧化纤维素的醛基含量。

MCC水热合成制备的氧化纤维素(DAC-A)及传统方法制备的氧化纤维素(DAC-B)的IR谱如图 1所示。DAC的特征峰出现在1 732和880 cm^-1左右。1 732 cm^-1是羰基特征吸收峰;DAC中醛基多以半缩醛形式存在，故在880 cm^-1出现半缩醛振动吸收峰。3 300 cm^-1是—OH伸缩振动吸收峰，1 025 cm^-1是C—O弯曲振动吸收峰，对比IR谱发现，DAC在这2处的吸收峰强度较MCC有明显减弱，进一步说明MCC被氧化成DAC。DAC-A在1 732 cm^-1吸收峰强度明显高于DAC-B，1 022 cm^-1吸收峰强度低于DAC-B，说明DAC-A的氧化度高于DAC-B(Alemdar et al.，2008;Oh et al.，2005)。

	图 1 MCC，DAC-A以及DAC-B的红外光谱 Fig. 1 IR spectra of MCC，DAC-A and DAC-B

CP/MAS¹³C-NMR分析DAC与MCC的结构，结果见图 2。

	图 2 MCC和DAC的CP/MAS13C-NMR光谱 Fig. 2 CP /MAS13C-NMR spectroscopy of MCC and DAC

从图 2可见，MCC的C₁，C₄和C₆谱线分裂为2部分:尖窄的低场和宽阔的高场，分别对应纤维素的结晶区和非结晶区组分。_δ=105.12，103.69，88.86，83.75，65.23和63.08 ppm分别对应结晶区C₁、非结晶区C₁、结晶区C₄、非结晶区C₄、结晶区C₆和非结晶区C₆。_δ=70.99～74.61 ppm重叠的强吸收信号来自于结晶区和非结晶区的C₂，C₃和C₅(Princi et al.，2004)。

传统方法制备的氧化纤维素DAC-B与MCC相比，信号峰的位置没有明显偏移，C₁，C₄和C₆分裂峰处的高场信号有所加强(对应非结晶区)，由此可判断DAC-B中的非结晶区组分少量增加。氧化纤维素的CP/MAS¹³C-NMR谱在200 ppm左右并没有出现羰基吸收信号(理论上存在)，这可能是由于DAC中醛基多以半缩醛形式存在造成的。

DAC-A与MCC相比，信号峰的位置发生微小偏移，在C¹，C⁴和C⁶位置处未出现明显的尖窄结晶峰。由于本研究采用的新方法反应条件比较剧烈，随着反应进行，MCC的大量结晶区组分转变为非结晶区组分。

图 3为MCC，DAC-A，DAC-B的X-射线衍射图。

	图 3 MCC，DAC-A和DAC-B的X-射线衍射图谱 Fig. 3 X-ray diffraction spectra of MCC，DAC-A，DAC-B

结晶度按式(3)计算:

式中: X_c为结晶度;S_c为X-射线衍射图谱中晶区部分面积;K为校正因子(K=0.1);S_a为X-射线衍射图谱中非晶区部分面积。由XRD数据计算MCC的结晶度为57.7%，DAC-A的结晶度为32.2%，DAC-B结晶度为46.4%。

从图 3可见，MCC的X-射线衍射图谱中2θ=14.7°，2θ=16.4°和2θ=34.5°为典型的非晶衍射峰，2θ=15.5°和22.6°出现了很窄的独立结晶峰，符合纤维素分子中存在着结晶区和非结晶区的特征。

DAC-B与MCC相比，衍射峰位置都没有发生明显变化，只是衍射峰的强弱发生了改变，说明传统方法制备氧化纤维素的过程中，主要破坏的是微晶纤维素中的无定形区，结晶结构和晶型没有被破坏，因此，DAC-B保持MCC原有的纤维素晶型。

DAC-A在2θ=18.9°处只有一个非晶衍射峰，说明水热氧化反应时，由于反应条件改变，纤维素分子链遭到一定程度破坏，纤维素的晶区遭到破坏，非晶体区更趋于无定形化，而峰型趋于单一化，结晶度降低至32.2%。

采用SS-550型扫描电镜对MCC和DAC进行表观形貌观察，如图 4所示。从图 4可以看出，MCC的表面十分光滑，光泽度较高，DAC-B保留了MCC的主要形态结构，但是其主体结构由于氧化而断裂，粒径变小，长度有减小的趋势，其表面变得褶皱，且有一些微纤维从表面露出。MCC经过水热氧化反应后得到DAC-A，分子大小由原来的长链结构变为较短且小的块状，表面凹凸不平。在一定温度和压力下，水热氧化反应加剧了纤维素结构单元吡喃环C₂和C₃位点的断裂，羟基变为醛基，使得其外观由平滑的线条状变得凹凸不平，并有小分子基团从纤维素分子主链上脱落，造成产物DAC-A与DAC-B相比，聚合度更低，粒径更短，形态由链状变为不规则的颗粒状。

	图 4 MCC，DAC-A和DAC-B的扫描电镜图 Fig. 4 SEM of MCC，DAC-A and DAC-B

醛基含量是衡量固定化酶载体性质一个主要参数，新型方法制备的氧化纤维素载体(DAC-A)的醛基含量较传统方法制备产物(DAC-B)明显提高。由于前人已有的研究及考虑工作量原因，以DAC-B为载体制备固定化酶的酶学性质不在此处讨论。本工作以DAC-A为载体固载漆酶，并与交联壳聚糖(CCTS)、双醛淀粉(DAS)固定化漆酶的酶学性质进行比较分析。

以水热合成制备的氧化纤维素(DAC-A)、交联壳聚糖(CCTS)、双醛淀粉(DAS)分别作为载体固定化漆酶，测定3种载体上携带的酶蛋白含量，结果列于表 1。

表 1 DAC-A，CCTS和DAS 3种载体性质对比 Tab.1 Comparison of properties among DAC-A，CCTS and DAS

表 1 DAC-A，CCTS和DAS 3种载体性质对比 Tab.1 Comparison of properties among DAC-A，CCTS and DAS 样品Sample 醛基含量Aldehyde content(%) 氮含量Nitrogen content(%) 酶量Laccase content(%) DAC 82.1 2.67 16.69 CCTS 84.3 2.31 14.44 DAS 81.2 2.78 17.38

从表 1可见，3种载体材料的醛基含量均在80%以上。新方法制备的DAC携带的酶量高于载体交联壳聚糖，与双醛淀粉接近，分析原因可能是因为水热合成方法得到的氧化纤维素材料粒径短、表面粗糙、比表面积大，酶与载体接触的空间位阻小，不但可以化学键连，而且可以物理吸附酶分子，整体达到化学交联-物理吸附酶效果。

不同温度下分别对游离酶和3种固定化酶的活力进行测定，结果见图 5。

		图 5 温度对酶活力的影响 Fig. 5 Effect of temperature on the enzymatic activity

从图 5可知，游离漆酶的最适反应温度为25℃，随着温度升高，游离酶活力先升后降，温度达到45 ℃游离酶即处于失活边缘，酶活力为37.8%。以DAC，CCTS，DAS为载体制备的固定化漆酶的最适反应温度分别为31，27，34 ℃，最适反应温度较游离酶均有提高，并且在测定温度范围(15～45 ℃)内，3种固定化酶较游离酶均能保持较高的酶活，表现出一定的热稳定性;而氧化纤维素固定化漆酶的热稳定性能最佳，在测定的温度范围内相对酶活力均保持在65%以上。对测定数据进行非线性拟合(Shi et al.，2011)，拟合方程列于表 2。

表 2 温度对酶活力影响数据的拟合方程^① Tab.2 Equation of the effect of temperature on enzyme activity

表 2 温度对酶活力影响数据的拟合方程① Tab.2 Equation of the effect of temperature on enzyme activity 酶系Enzymatic system 方程Equation 相关系数R ①y: 活动力Enzymatic activity; x: 温度Temperature． Lacccase $y = 37.480{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 1 - \frac{{846.193{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 3}}{{11.883{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 1 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 25.745{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 1} \right)}^2}}}{{11.883{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {1^2}}}}}$ 0.982 1 DAC $y = 70.593{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 1 - \frac{{594.844{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 6}}{{14.605{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 2 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 27.901{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 9} \right)}^2}}}{{14.605{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {2^2}}}}}$ 0.990 3 CCTS $y = - 75.996{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 8 + \frac{{292.813{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 0}}{{10.474{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 4 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 26.544} \right)}^2}}}{{10.474{\kern 1pt} {\kern 1pt} {4^2}}}}}$ 0.990 1 DAS $y = - 32.057{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 6 + \frac{{7{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 605.939{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 3}}{{47.051{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 8 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 32.554{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 1} \right)}^2}}}{{47.051{\kern 1pt} {\kern 1pt} {8^2}}}}}$ 0.977 2

游离漆酶和固定化漆酶的最适反应pH值测定结果如图 6所示。从图 6可见，游离漆酶的最适反应pH值为4.6，DAC，CCTS，DAS为载体制备的固定化漆酶的最适反应pH值分别为4.2，4.3，4.4。漆酶经固定化处理后最适反应pH值均有不同程度的改变，并且由于载体对酶蛋白的保护，使得酶蛋白周围的微环境改变有了一定的减缓，其表现为固定化酶在较宽pH值范围保持较高的酶活力。在pH值2～8范围内，氧化纤维素固定化漆酶的相对酶活力均保持在70%以上，表现出良好的pH值耐受性。所得数据进行非线性拟合，结果如表 3所示。

	图 6 pH值对酶活力的影响 Fig. 6 Effect of pH value on the enzymatic activity

表 3 pH值对酶活力影响数据的拟合方程^① Tab.3 Equation of the effect of pH value on the enzymatic activity

表 3 pH值对酶活力影响数据的拟合方程① Tab.3 Equation of the effect of pH value on the enzymatic activity 酶系Enzymatic system 方程Equation 相关系数R ①y: 酶活力Enzymeatic activity; x: pH． Lacccase $ y = 54.506{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 3 + \frac{{219.186{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 9}}{{4.023{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 7 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 4.583{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 7} \right)}^2}}}{{4.023{\kern 1pt} {\kern 1pt} {7^2}}}}} $ 0.995 6 DAC $ y = 85.101{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 1 + \frac{{43.841{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 06}}{{2.475{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 5 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 4.425{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 3} \right)}^2}}}{{2.475{\kern 1pt} {\kern 1pt} {5^2}}}}} $ 0.981 5 CCTS $ y = 83.197{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 8 + \frac{{64.647{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 7}}{{3.303{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 9 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 4.991{\kern 1pt} {\kern 1pt} 8} \right)}^2}}}{{3.303{\kern 1pt} {\kern 1pt} {9^2}}}}} $ 0.955 9 DAS $ y = 82.070{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 8 + \frac{{54.438{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 6}}{{2.734{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 4 \times \sqrt {\pi /2} }}{{\rm{e}}^{ - 2\frac{{{{\left( {x - 4.527{\kern 1pt} {\kern 1pt} 7} \right)}^2}}}{{2.734{\kern 1pt} {\kern 1pt} {4^2}}}}} $ 0.980 8

连续测定固定化漆酶的活力，得到使用次数与固定化酶活力的关系数据，结果如图 7所示。

	图 7 固定化漆酶的稳定性 Fig. 7 The stability of immobilized laccase

从图 7可见，DAC，CCTS，DAS 3种载体材料固定化漆酶均表现出良好的稳定性。重复使用10次后CCTS固定化漆酶酶活力为64.9%，DAS固定化漆酶酶活力为61.9%，而DAC固定化漆酶的重复使用性最佳，稳定性能曲线下降平稳，重复使用10次后酶活力为74.6%。所得稳定性数据进行非线性拟合，结果如表 4所示。

表 4 固定化漆酶稳定性数据拟合方程^① Tab.4 Equation of the stability of immobilized laccase

表 4 固定化漆酶稳定性数据拟合方程① Tab.4 Equation of the stability of immobilized laccase 酶系Enzymatic system 方程Equation 相关系数R ①y: 酶活力Enzymatic activity; x: 使用次数Using number． DAS $ y = 44.966{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 5 + 66.738{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 3{{\rm{e}}^{\frac{{ - x}}{{1.877{\kern 1pt} {\kern 1pt} 6}}}} $ 0.986 5 CCTS $ y = 65.238{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 9 + 47.165{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 4{{\rm{e}}^{\frac{x}{{2.819{\kern 1pt} {\kern 1pt} 8}}}} $ 0.984 8 DAC $ y = 71.262{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 5 + 38.222{\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} {\kern 1pt} 4{{\rm{e}}^{\frac{x}{{3.729{\kern 1pt} {\kern 1pt} 3}}}} $ 0.997 0

底物浓度C_s的倒数和反应速率V_s的倒数作图结果如图 8。线性拟合结果列于表 5。

	图 8 Lieweaver-Burk曲线 Fig. 8 Lieweaver-Burk curves

表 5 Lieweaver-Burk曲线的线性拟合方程^① Tab.5 Equation of the Lieweaver-Burk

表 5 Lieweaver-Burk曲线的线性拟合方程① Tab.5 Equation of the Lieweaver-Burk 酶系Enzymatic system 方程Equation 相关系数R 米氏常数Km/(mmol·L-1 ) ①y: 酶活力Enzymatic activity; x: 浓度的倒数Reciprocal of concentration． Lacccase y = 0.443 4x + 0.606 5 0.998 5 1.37 DAC y = 0.497 0x + 0.915 8 0.998 9 1.84 CCTS y = 0.396 7x + 0.702 1 0.984 8 1.75 DAS y = 0.405 9x + 0.804 8 0.997 4 1.98

由表 5可知，游离漆酶和固定化漆酶的表观米氏常数分别为1.37，1.84，1.75和1.98 mmol·L^-1。米氏常数K_m是反映酶与底物结合力的参数，K_m越小，酶与底物亲和力越大。固定化后酶的K_m增大，表明酶和底物的亲和力有所降低。多数载体制备的固定化酶对底物的亲和能力较游离酶均有不同程度的减小，这可能是由2方面的原因造成的:一方面是由于活性中心的氨基酸残基、空间结构和电荷状态发生了变化;另一方面是由于在固定化酶的周围形成了能对底物产生立体影响的扩散层及静电相互作用。

固定化酶在保持其高效、专一及温和酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、易分离回收、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点，在林产化工、医学及生命科学等学科领域得到迅速发展，是目前林业工程、生物学等领域的研究前沿。要获得性能优越的固载酶，设计合成性能优异且可控的载体是关键。纤维素作为生物质高分子材料的代表，对其进行改性使之成为具备更高反应活性的固载酶载体是当前研究的热点之一。本研究将水热合成反应用于氧化纤维素的制备中，在一定温度和压力下，纤维素的氧化反应均匀进行，可较好地克服多相介质中反应只发生在表面、反应不均匀的缺点，可制备出高性能氧化纤维素。新型水热氧化方法较传统方法制备的双醛纤维素具有醛基含量高、粒径小、比表面积大的明显优势。

新方法制备氧化纤维素固定化的漆酶与交联壳聚糖和双醛淀粉固定化的漆酶相比，具有很好的稳定性、较高的温度耐受性和pH值耐受能力，对底物亲和能力强，是一种具有应用前景的载体材料。