重大检疫性害虫枣实蝇(Carpomyia vesuviana)于2007年在吐鲁番地区发现，对该地区枣产业造成了毁灭性损失，且疫情有向其他地区扩散的趋势(张润志等，2007; 阿地力·沙塔尔等，2008; 2012)。随着中国经济的高速发展，无论是国内地区间还是国际间的商业贸易与人员往来都日渐频繁，枣实蝇的扩散风险也越来越高。而一旦枣实蝇入侵新的区域，往往会给入侵地的水果种植业和农业生产带来严重的后果，有的甚至会造成毁灭性的打击。因此，枣实蝇的快速检验检疫在农业安全与植物检疫中愈来愈重要。然而，枣实蝇主要以幼虫蛀食果肉，成虫不危害枣果，通常可造成的产量损失高达20% 以上，发生严重的可以导致全部枣果受到危害，从而严重影响到红枣的产品质量及其整体的商品价值(阿地力·沙塔尔等，2012)。迄今为止，实蝇类害虫的种的鉴定主要依据成虫的形态特征，而卵、幼虫、蛹由于其特征差异小，且有些特征在其不同的发育时期不够稳定，因此依据形态学鉴定方法很难保证鉴定的准确度。即使枣实蝇的幼虫能依据形态学进行鉴定，但很大程度上依赖鉴定人员丰富的鉴定经验，这就制约了不同地区相关工作的进一步开展。在口岸检疫工作中，通常要将幼虫培养到成虫再进行鉴定，整个检疫鉴定过程时间长达数周，无法适应实际工作需要(Nakahara et al.，2002; Naeole et al.，2003; Muraji et al.，2002)。显然，仅仅依靠形态学分析进行实蝇种类鉴定的研究，不能与日益增长的水果蔬菜贸易发展相协调，也不利于建立一个高效快速的检疫性实蝇的检测技术体系，从而使检疫和防控工作具有相当大的困难(余道坚等，2006)。

种特异引物 PCR(species-specific PCR，SS-PCR)扩增技术是与通用引物 PCR(universal-primers PCR，UP-PCR)技术相区别而提出来的，种特异引物常规 PCR 技术的原理与普通 PCR 扩增相似，只是在根据靶序列进行引物设计时，需要充分考虑引物的特异性，用特异性强的引物扩增未知模板，通过检测目标片段的有无，达到把目标种与其他种鉴别开来的目的(邓中平，2004)。余道坚(2005)分别建立了常规 PCR 鉴定辣椒实蝇(Bactrocera latifrons)、地中海实蝇(Ceratitis capitata)、杨桃实蝇(B． carambolae)、番石榴实蝇(B． correcta)、桔小实蝇(B． dorsalis)、芒果实蝇(B． occipitalis)、木瓜实蝇(B． papayae)、菲律宾实蝇(B． philippinensis)、瓜实蝇(B． cucurbitae)和南瓜实蝇(B．tau)的方法。然而，自从枣实蝇发生以来，除了形态学鉴定之外，目前国内外还没有一套枣实蝇特异引物 PCR 鉴定技术。

本研究在通过对枣实蝇 mtDNA 的COI基因片段进行测序，设计了枣实蝇15对引物基础上，应用 SS-PCR和琼脂糖凝胶电泳(AGE)技术，筛选出了1对枣实蝇的特异性引物，并以瓜实蝇等5种我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫(余道坚等，2004)为检验引物特异性的阴性对照，证明在试验涉及到的这些近缘种范围内，本研究设计的引物对枣实蝇的特异性，从而建立了常规 PCR 鉴定枣实蝇的方法，大大缩短了枣实蝇的鉴定周期。采用 SS-PCR 进行快速鉴定枣实蝇技术的研究，旨在有效阻截枣实蝇的进一步传播扩散。

枣实蝇(幼虫、蛹和成虫)采自新疆吐鲁番。桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇(B． zonata)为成虫，由新疆出入境检验检疫局提供。所有实蝇标本均用体视显微镜鉴定，以确定种类。用于分子生物试验的实蝇标本用100 % 酒精浸泡并保存于4 ℃冰箱。鉴于枣实蝇的卵、幼虫、蛹与其他实蝇类害虫形态十分相似而难以区分，然而桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇属于我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫，所以将这些种类作为检验引物特异性的阴性对照。

动物组织基因组DNA提取试剂盒、PCR 反应体系试剂(Mg²⁺和dNTP、10 × buffer)、Taq 酶、EB、DL2000DNAMarker、琼脂糖均购自庄盟生物有限公司(阿地力·沙塔尔等，2012)。

Biometra 定量梯度 PCR 仪(华粤)、TGL ^-1613台式高速离心机(上海)、DYY － 12 C 多功能电泳仪(北京市六一仪器厂)、D56 － 26 M 型数字图像分析仪(北京市六一仪器厂)、Thermo Nanodrop2000超微量紫外分光光度计(北京科誉兴业科技发展有限公司)、XMTD － 4000水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂)、MDF － 382 E(N)SANYO 超低温冰箱(上海中庸检验设备有限公司)、SANYOMLS － 3750全自动高压灭菌仪(上海中庸检验设备有限公司)。

本研究应用北京庄盟国际生物基因科技有限公司研发的动物组织基因组DNA提取试剂盒推荐的方法来提取基因组 DNA，提取方法按操作技术指南的步骤进行(阿地力·沙塔尔等，2012)。

以目标枣实蝇线粒体 DNA(mtDNA)中COI基因序列(该序列为笔者在 GenBank 提交的序列，序列号 HQ687210)为目标序列(阿地力·沙塔尔等，2012)，借助 Mega4软件(DNASTAR 公司，美国)中 CLUSTAL 方法，与己知其他种类的实蝇的COI基因序列(包括本研究和其他公开报道的序列)进行比较分析，人工设计引物，引物用 Primer5软件检查引物错配、二聚体和发夹结构，并用 GenBank 中提供的 Blast 程序检查同源序列(Muraji et al.，2002)。本研究共设计了15对引物，通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的引物1对，引物筛选的原则是所有引物在标准的 SS-PCR 的反应体系和反应条件下能特异地鉴定出枣实蝇。引物由北京华大中生科技发展有限公司负责合成。

枣实蝇DNA提取质量用引物对 can-F / can-R 来检查。该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，定量梯度 PCR 仪反应体系包括10 × Buffer(不含 Mg²⁺)2.5μL，25 mmol·L ^-1 Mg²⁺ 2.5 μL，2.5 mmol·L ^-1 dNTP2.5 μL，10 μmol·L ^-1上下游引物各1 μL，1 UTaq酶，模板DNA1 μL，加水至总体积25 μL，反应条件为94 ℃ /5 min，95 ℃ /40 s，55 ℃ /30 s，72 ℃ / 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。 PCR 反应结束后，分别提取 PCR 产物5 μL 在含溴化乙锭的1.5 % 琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30 min(90 V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定(余道坚等，2004 ; 吴佳教等，2005 ; Jamnonglik et al.，2003 ; 阿地力·沙塔尔等，2012)。

分别以单头桔小实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、桃果实蝇的DNA为模板，枣实蝇为阳性对照，检验枣实蝇特异片段扩增引物Car-F / Car-R 的种特异性。

SS-PCR 在定量梯度 PCR 仪(Biometra)上进行，反应体系: 0.25 mmol·L ^-1 Mg²⁺，0.25mmol·L ^-1dNTP，10 mmol·L ^-1 10 × Buffer，1 UTaq 酶(Takara)，上下游引物各0.1 μmol·L ^-1，模板DNA 1 μL，加水至总体积25 μL。反应条件为94 ℃ /5 min，95 ℃ /40 s，57 ℃ /30 s，72 ℃ / 1 min，33个循环，最后72℃延伸5 min。分别提取 PCR 产物5 μL 在多功能电泳仪上用含溴化乙锭的1.5 % 琼脂凝胶电泳30min(90 V)，用数字图像分析仪检测结果，观察扩增带的大小和宽度(余道坚等，2004 ; 阿地力·沙塔尔等，2012)。

分别以提取的不同虫态(幼虫、蛹和成虫)的枣实蝇DNA为模板，进行靶标片段扩增效果检验，每种虫态分别检测10头。此外，取不同浓度的成虫DNA 模板即40，20，10，1，0.1，0.01，0.001 ng·μL ^-1进行最低检出阈值的测定，每个浓度共计检测10头(张桂芬等，2012)。

将特异引物 PCR 扩增产物分别用原 PCR 引物进行序列测定，获得的序列与原模板的序列进行比较分析，检查所得到的 PCR是否为特异性产物(余道坚，2005)。

为了避免假阴性现象的出现，枣实蝇DNA 提取质量用引物 can-F / can-R 来检查(余道坚，2005)，6种实蝇模板DNA扩增结果见图 1。由图可知:COI基因通用引物对6种实蝇的DNA成功扩增，在600~700 bp 之间目标片段的位置有一条扩增带，亮度差异表示模板浓度的差异。DNA确切浓度和纯度通过核酸蛋白检测仪来测定(阿地力·沙塔尔等，2012)。

	图 1 can-F/can-R 引物 PCR 模板 DNA 质量检查 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis analysis (GEA)of the quanlity of DNA template with primer set can-F/can-R 1.桔小实蝇 B． dorsalis; 2.番石榴实蝇 B． correcta; 3.瓜实蝇 B．cucurbitae; 4.南瓜实蝇 B． tau; 5.桃果实蝇 B． zonata; 6.枣实蝇C． vesuviana; 7.阴性对照(模板为水)CK M: DL2000 DNAMarker．下同 The same below．

本研究共设计了15对引物，最后通过筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引物1对。为了检查常规 PCR 方法下该引物的特异性，试验材料中除待鉴定区分的枣实蝇之外，还将桔小实蝇、番石榴实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、桃果实蝇等5种同源性较高的实蝇一起进行试验。经常规 PCR 反应，筛选获得能特异鉴定枣实蝇的特异性引物 CarF / CarR，并进行常规 PCR 扩增，扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳，结果如图 2所示: 除了枣实蝇在205 bp 处有一条特异性扩增的条带外，阴性对照和其他5种实蝇均无特异性目标片段，从而证明该引物在试验涉及到的这些近缘种范围内，能特异性地鉴定枣实蝇。

	图 2 特异性引物 PCR 检测枣实蝇的特异性 Fig. 2 Specificity of primer by SS-PCR

SS-PCR 方法的检测灵敏度分别用40，20，10，1，0.1，0.01和0.001 ng·μL ^-1等7种不同浓度的枣实蝇DNA模板来确定(图 3)。由图可知:当模板浓度为0.001 ng·μL ^-1时，没有扩增出特异性条带，当模板浓度为0.001 ng·μL ^-1时仅出现了微量的目标条带，扩增带0.01 ng·μL^-1十分弱，然而当模板浓度大于0.001 ng·μL ^-1时，均能产生特异性条带，由本试验可知常规 PCR 方法鉴定实蝇的最适模板浓度应该大于0.1 ng·μL ^-1 。

	图 3 枣实蝇成虫不同浓度DNA 模板常规 PCR 电泳结果 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis analysis of SS-PCR products with different template DNA concentrations of C．vesuviana 1.40 ng·μL -1 ; 2.20 ng·μL -1 ; 3.10 ng·μL -1 ; 4.1 ng·μL -1 ;5.0.1 ng·μL -1 ; 6.0.01 ng·μL -1 ; 7.0.001 ng·μL -1 ; 8.阴性对照(模板为水)CK; M． DL2000 DNA Marker．

特异性引物常规PCR 的可靠性分别用枣实蝇幼虫、蛹和成虫3种不同的虫态来验证。试验结果表明常规 PCR 不受虫态限制，不同虫态均能特异性扩增(图 4)，说明特异引物常规 PCR 的特异性由引物的特异性和模板的浓度决定，而与标本的虫态及存活状态无关。

	图 4 枣实蝇不同虫态的常规 PCR 特异性检测 Fig. 4 Specificity of SS-PCR with different stages of C． vesuviana 1.幼虫 Larval; 2.蛹Pupa; 3.成虫 Adult; 4 : 阴性对照(模板为水)CK; M.DL2000 DNAMarker．

除了对 SS-PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查枣实蝇特异引物扩增的特异片段大小是否有预期的一致外，同时分别对特异引物的 SS-PCR 产物进行测序并进行序列分析，将序列与原序列进行比较，进一步确认产物的特异性。试验结果表明，PCR 产物的测序结果与原序列一致，均为:CTCAACTAAATTATTCCCCAGCAATATTATGAGCTTTAGGATTTGTATTTTTATTTACAGTAGGAGGATTAACAGGAGTAGTATTAGCAAATTCATCAGTTG ATATTATTCTTCATGACACTTATTATGTAGTTGCTCA TTTT CATTATGTACTATCAATAGGAGCTGTATTTGC TATTATAGCTGGATTTGTGCATTGATACCC。

一般情况下实蝇形态鉴定要将不成熟虫态(卵、幼虫、蛹)饲养为成虫，其周期约需20天。由于检测周期较长，这种方法不能满足贸易性果蔬快速通关的需求。然而定性 PCR 检测可解决这一长期困扰口岸检验检疫人员的问题，它不受虫态的限制———成虫、幼虫、蛹、卵均能检测，而且只要获得微量的DNA，即使个体残缺也不影响准确性，同时能大大缩短检测周期。笔者还将 PCR 检测与成虫饲养互相验证，确认了 PCR 检测结果的准确性(余道坚等，2004)。目前，国外利用实蝇的个体残肢也可提取 DNA，并成功地进行 PCR 反应和基因序列分析(余道坚等，2004 ; Muraji et al.，2002)。本研究建立的检测方法，为新入侵的检疫性害虫枣实蝇的快速鉴定提供了新途径，该技术平台同样适用于形态较难区分的近缘种的检疫鉴定(余道坚等，2004)。在实际应用中，枣实蝇幼虫往往随枣果传播，为实现快速分子检疫鉴定的目的，不可能直接应用种特异引物进行种类鉴定，而是要根据实蝇的背景知识(如分布、寄主等)和多年来实蝇检疫积累的经验对实蝇的种类进行初筛，再通过属、亚属和种特异引物等种的特异性引物进行PCR 检测，才能准确鉴定是否为枣实蝇。 SS-PCR 对试验仪器的要求不高，因此，该技术在实际工作中很容易推广应用。

本研究在设计的枣实蝇15对引物中，利用 SS-PCR和琼脂糖凝胶电泳技术筛选出了1对枣实蝇的特异性引物，引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇5种我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫来验证。 SS-PCR 方法的检测灵敏度用40，20，10，1，0.1，0.01，0.001 ng·μL ^-1 7个不同浓度系列的枣实蝇DNA模板来检测。结果表明:SS-PCR 方法的检测限度达0.01 ng·μL^-1以下，最适模板DNA浓度为1~20 ng·μL ^-1 。本研究所设计的引物能对不同虫态能进行特异性扩增，结果准确可靠，表明在试验涉及到的这些近缘种范围内对枣实蝇的特异性，从而建立了常规 PCR 鉴定枣实蝇的方法。SS-PCR 分析技术操作简便快捷，缩短了通关时间，提高了工作效率。因此，该技术体系可以用于枣实蝇的检测鉴定工作，并在检疫性害虫的检疫检验与检测监测中具有重要应用价值。然而，我国检疫性实蝇类害虫种类较多，而且不同地理种群之间的COI 基因序列差异较大(阿地力·沙塔尔等，2012)，从而造成种的特异性引物设计存在较大困难。余道坚(2005)以检疫性实蝇为研究对象设计了亚属持异性引物及种特异性引物，这为以后建立类似形态学的属、亚属和种分级分子检索表提供了新思路，使实蝇鉴定分子检索表甚至是计算自动化鉴定成为可能。但如用单一的COI基因标记全部基因来设计所有果实蝇亚属种特异引物，还有一定难度，因为目前己知的该亚属的COI基因序列只是一些有比较重要经济价值的种类(余道坚，2005 ; Muraji et al.，2002)。因此，种特异性引物的设计要有相当数量的相同片段的基因序列，特别是属内同缘种要足够多。本试验引物设计过程中尽可能考虑到其他的一些近缘种的同源序列，选取桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇、桃果实蝇5种我国口岸检疫中较常见的实蝇类害虫为材料，将这些种类作为检验引物特异性的阴性对照，证明了试验涉及的近缘种范围内本研究设计引物的特异性，从而建立了常规 PCR 鉴定枣实蝇的方法;但因实蝇类害虫多为检疫性害虫，采样困难，因此今后将尽力采集更多的实蝇种类，进一步验证本研究设计的SS-PCR 引物的特异性。

同时，近几年越来越多的分子生物学快速检疫鉴定技术已运用到实蝇类昆虫检疫鉴定中，比如 SYBR Green 实时荧光 PCR，TaqMan、Taq-Man-MGB及分子信标(molecular beacon)探针实时荧光 PCR等。关于枣实蝇实时荧光 PCR 快速检疫鉴定技术有待继续研究。