为解决和改善日益严重的全球性能源危机及温室效应问题，世界各国已开始重视发展可持续再生新能源。有研究表明，通过将生物质能源，尤其是含量最为丰富的木质纤维素转化为乙醇替代石油等化工原料的途径有望解决上述危机(Demirbas，2005)。此外，纸张消费的增长及现代造纸工业的迅猛发展导致木质纤维原料缺乏，而木材中纤维素的含量直接影响到乙醇的转化率和制浆造纸过程中纸浆的得率，并和造纸所产生的环境污染有密切关系(Chiang et al.，1988 ; Sassner et al.，2005)。因此，对木材纤维素生物合成机制的深入研究，特别是对木材纤维素的生物合成过程及对参与其中的关键基因进行遗传学研究，将对林木种质的分子遗传改良具有深远的意义。为此，先前的研究者利用分子生物学与分子遗传学手段发现并解析了部分基因的功能，显著提高了林木分子遗传改良的进程(Déjardin et al.，2010 ; Ingvarsson et al.，2011 ; Li et al.，2006)。

S-腺苷高半胱氨酸水解酶(S-adenosy-L-homocysteine hydrolase，SAHH)是生物体内广泛存在的调节细胞内甲基化反应的一个关键酶。其可逆的催化 S-腺苷-L-高半胱氨酸(SAH)水解生成腺苷(Ado)和高半胱氨酸(Hcy)，是真核生物中水解AdoHcy 代谢的唯一途径(Lloyd et al.，1993)。通过该途径，将甲基供体 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)转甲基之后产生的 SAH 代谢掉。 SAHH 的催化活性受 SAM 与 SAH 含量的比率调节，SAH 含量过高会抑制 SAHH 的催化活性，从而降低基因甲基化的程度，进而调控基因的表达(Kloor et al.，2004 ; Li et al.，2008)。自1954年，Cantoni和Scarano(1954)首次发现 S-腺苷高半胱氨酸以来，已经从人类及多种微生物如酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、枯氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、南极冰藻(Chlamydomonas sp． ICE-L)等生物体内克隆得到了 SAHH 基因的全长序列(Parker et al.，2003 ; Tehlivets et al.，2004 ; 王金慧等，2011)。此外，在植物中已获得陆地棉(Gossypium hirsutum)、黄瓜(Cucumis sativus)等作物的 SAHH 基因全长(佘义斌等，2008 ; 金晓霞等，2012)。目前，关于该基因的研究多集中在介导DNA 甲基化机制方面，尤其是人类医学领域中对各种病毒及肿瘤的新疗法探究以及以 SAHH 基因作为靶位点设计药物的研究(Turner et al.，2000 ; Clercq，2002 ; Ji et al.，2005)。S-腺苷高半胱氨酸水解酶广泛存在于生物体内，其在植物次生微管组织木质部发育过程中具有重要的调控作用(Rocha et al.，2005 ; 佘义斌等，2008)。鉴于树木纤维素对林产工业经济价值的重要性，分离 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因并对其进行分析，对于探究纤维素的合成过程以及木材纤维品质的研究具有重要意义。特别是近几年，基于分子标记辅助育种策略的提出，为研究基因功能及其遗传变异位点的遗传效应提供了新方向。基于候选基因内单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，简称 SNPs)的遗传学研究已成为研究林木育种的一种有效的手段(Zhang et al.，2005); 大量研究表明该方法在挖掘与表型性状显著关联的功能标记位点，并用于探索候选基因分子遗传机制方面具有重要意义(Andersen et al.，2005 ; Gonzalez-Martinez et al.，2007 ; Tian et al.，2012)。但在树体高大、生长周期较长且在生态环境建设中占有重要地位的用材树种中还未见关于该基因克隆与功能分析的报道。为此，本文以我国北方地区重要的用材树种毛白杨(Populus tomentosa)为材料，从该树种的成熟木质部中成功分离出一个SAHH 基因，并对该基因进行组织特异性分析及单核苷酸多态性分型。在此基础上，运用连锁不平衡分析手段研究了该基因内的 SNP 标记位点与木材品质性状的关系，为选择优良用材种质为目标的毛白杨 SNP 标记辅助育种奠定了理论基础，具有重要的应用价值。

20世纪80年代初，全国毛白杨协作组从毛白杨天然分布区100多万km²的范围内选取了1 047株优良的毛白杨基因型个体，在山东省冠县建立了毛白杨种质资源基因库。 Huang(1992)依据光、热、水等16个气象因子，运用主分量分析，将毛白杨分布区划分为3个气候区。在上述毛白杨种质资源基因库中选取能够最大程度反映毛白杨天然分布范围的45株基因型个体用于 SNP 的发现; 用于 SNP 与木材品质性状关联分析的群体为选自于该基因库的426株基因型个体。提取 RNA 的材料为1年生的毛白杨无性系‘鲁毛50 ’。

植物材料总 DNA 的提取按照 DNeasy PlantMini Kits(Qiagen，Inc．，Valencia，CA，USA)描述的方法进行。

毛白杨不同组织材料(顶端分生组织、嫩叶、成熟叶、韧皮部、形成层、未成熟木质部、成熟木质部及根部组织)总 RNA 的提取及 cDNA 的合成按照 RNeasy Plant Mini Kits(Qiagen)和Clonetech 试剂盒描述的方法进行。

利用 Affymetrix 表达谱芯片技术构建了插入片段为1.0~4.0 kb、大小为5.06 × 10⁶ pfu 的毛白杨木质部 cDNA 转录组数据库，随机选择5 000条 EST片段进行测序，与所有的拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtSAHH 基因比对，最终在毛白杨中确定了一个与AtSAHH 序列相似度达83 % 的 EST 片段，在毛白杨 EST 序列两端设计1对寡聚核苷酸引物:

PtSAHHAF: 5 '-CCATGTACACTCCACCAACTCCCTGAAA-3 ';

PtSAHHAR: 5 '-GAGAAAACTCATTCTACTAGCCGTTACAA-3 '(T_m= 65 ℃)。

以毛白杨成熟木质部 cDNA 为模板，采用25 μLDNA 聚合酶链式反应(PCR)体系，反应体系按照潘炜等(2011)描述的方法进行。最终扩增出长约2 000 bp的 cDNA 片段。

回收 PCR 扩增后得到目的基因片段，将其与 PMD-18 T 载体连接。连接产物转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 α并筛选阳性克隆进行 PCR扩增，将扩增后的阳性克隆进行测序，获取该基因的 cDNA 序列。应用 DNAMAN6.0软件推导出该基因所编码的氨基酸序列，分别估算该蛋白的分子质量和等电点并进行跨膜结构分析; 同时，对其同源蛋白序列进行 NCBI 检索，并利用 MAGE5软件对不同物种间同源蛋白序列的系统进化进行分析。

利用 ABI Primer Express3.0软件设计2条Realtime PCR 的扩增引物，引物序列如下:

PtSAHHARTF: 5 '-ATGATCTGCGATCTCGGA GAA-3 ';

PtSAHHARTR: 5 '-CACCCCCATCCAAAACCTTATTA-3 '(T_m= 58 ℃)。

以在杨树不同组织与器官中表达相对稳定的肌动蛋白基因Actin 作为内参，引物序列为:

ActRTF:5 '-CTCCATGAAATGCGATG-3 ';

ActRTR:5 '-TTGGGGCTAGTGCTGAGATT-3 '(T_m= 58 ℃)。

定量 PCR 反应操作按照 SYBR^© Premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒描述的方法进行。每个样品和对照分别重复3次。反应总体系为: cDNA 2 μL，SYBR^© Premix Ex TaqTM 12.5 μL(2 ×)，定量PCR 上游和下游引物各0.5 μL(10 μmol·L^-1)，加水补足25 μL。轻微离心，将反应体系收集到管底。在 MJ Research Opticon 2荧光检测系统上进行 Real-time PCR 反应，扩增程序为: 94 ℃，5 min →(94 ℃，30 s→58 ℃，30 s→72 ℃，1 min)，40个循环→ 72 ℃，10 min。扩增完成后用MJ Research Opticon 2 SYSTEM 软件对结果进行分析。

分析已得到的 PtSAHHA 基因核苷酸序列，在其两端设计基因特异的引物，以45株毛白杨个体的总 DNA 为模板分别进行扩增。将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离、回收、纯化后与 pMD-18 T 载体进行连接、转化，选取阳性克隆送公司测序。运用MEGA5软件对45株基因型个体 PtSAHHA 基因片段的核苷酸序列进行比对，标出 SNP 位点; 在此基础上，运用 Dnasp5软件计算 SNP 频率及多样性指数，对其中存在的同义突变、错义突变和无义突变情况进行分析，并对 SNP 位点进行连锁不平衡分析。

对于 SNP 位点基因型分析，以能够最大程度地反映毛白杨天然分布范围的426株基因型个体作为关联作图群体，利用锁核酸技术(Koshkin et al.，1998)对1.7中确定的频率大于5 % 的常见 SNP 标记进行 PCR 扩增、基因型分型，建立 SNP 基因型数据库; 对于木材纤维品质性状，利用 Near Infrared Reflectance Spectroscopy(NIRS)仪器(MPA 傅里叶型)测定每个基因型个体的木材化学成分如木质素含量、综纤维素含量及α-纤维素含量; 采用纤维测定仪测定木材物理性质如纤维长和纤维宽，利用 X-衍射仪测定微纤丝角; 数量性状指标的具体测定方法见 Du等(2013 b)。

利用 TASSEL2.1软件将 SNP 位点基因型分别与木材物理及化学性状进行混合线性模型(MLM)分析(Yu et al.，2006 ; Stich et al.，2009)。其中，该模型以群体结构系数(Q)和亲缘关系系数(K)作为协变量，其中 Q 矩阵数据来自于 Du等(2012)，K 矩阵则由 SPAGeDi 软件计算获得(Ritland，1996)。获取 P≤ 0.05的关联结果，随后利用 Q-value 软件进行 Fasle Discovery Rate(FDR)假阳性检验(Q <0.01)(Storey et al.，2003)，最终确定与木材品质性状显著关联的 PtSAHHA 基因内 SNP 位点。

在毛白杨木质部 cDNA 转录组数据库中随机选取5 000条 EST 片段进行测序并与拟南芥 AtSAHH 基因进行比对，最终获得一个与 AtSAHH 高度相似的EST 片段(83%)。以毛白杨成熟木质部的 cDNA 第1链作为模板进行 PCR 扩增，产物经0.8% 琼脂糖凝胶电泳后，在大约2 000 bp 处显示出1条清晰明亮的特异性条带(图 1)。将该目标片段经回收、纯化后与pMD-18T 载体进行连接，选取阳性克隆测序。测序结果表明，克隆得到的 PtSAHHA 基因的 cDNA 克隆总长为1 935 bp，分别包含长度为248 bp和229 bp 的3'UTR(3' un-translated region)和5'UTR(5' un-translated region); 分析结果表明，PtSAHHA 基因内含有大小为1 458 bp 的完整开放阅读框架，可编码含有485个氨基酸残基的蛋白质。将该序列提交 GenBank 数据库，接收序列号为 KF293294。运用 DNAMAN6.0软件估算得到 PtSAHHA 蛋白质的分子质量约为53 171.4 Da，其等电点为5.79。

	图 1 PtSAHHA 基因的 cDNA 片段 Fig. 1 The cDNA fragment of PtSAHHA M: 1 kb DNA 分子量标准 ; 1 : PtSAHHA 的 cDNA 片段。 M: 1 kb DNA ladder marker; 1: The cDNA fragment of PtSAHHA．

为分析该基因的结构，以毛白杨基因组总 DNA为模板进行了 PCR 扩增和测序，获得了长度为2 445 bp的 PtSAHHA 基因组 DNA 序列。并与 cDNA比较显示，该基因内仅含有1个内含子，长度为510 bp。将PtSAHHA 基因序列进行 NCBI 检索，结果初步表明 SAHHA 在毛白杨中的克隆尚属首次。将其与之前从模式植物及农作物中克隆的SAHH基因的蛋白质序列进行同源性比较(图 2)。结果显示，PtSAHHA 与模式植物如拟南芥、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、烟草(Nicotiana tabacum)及主要农作物如玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)的 SAHH 核苷酸序列及氨基酸序列具有很高的相似性，同源性在91.75%~98.14% 之间，其中与毛果杨 PtrSAHHA 蛋白的同源性最高，因此将本研究克隆得到的这一毛白杨 SAHH 基因命名为 PtSAHHA 是合理的。Rocha等(2005)的研究也证明，植物 SAHH 基因编码的蛋白质高度保守，都具有长度相同的485个氨基酸且同源性高于87% 。

	图 2 PtSAHHA 与其他物种 SAHH 蛋白质序列比较 Fig. 2 The protein sequences alignment of SAHH from different species Ptr: 毛果杨 Populus trichocarpa; Rc: 蓖麻 Ricinus communis; Nt: 烟草 Nicotiana tabacum; Os: 水稻 Oryza sativa; Zm: 玉米 Zea mays; At: 拟南芥 Arabidopsis thaliana。黑色方框表示2个跨膜蛋白结构域。下划线表示 AdoHcyase_NAD 结构域。 The two black boxes show the transmembrane domains，and the underline shows AdoHcyase_NAD domain．

蛋白质一级结构分析表明，PtSAHHA 编码的蛋白与其他植物的 SAHH 蛋白都具有典型的 AdoHcyase_NAD 结构域，表明 SAH 水解酶是一种十分保守的蛋白质。运用 DNAMAN6.0软件对氨基酸序列进行跨膜结构分析显示，这7个物种的 SAHH基因编码的蛋白两端分别具有1个跨膜蛋白结构域，位于氨基酸序列63 —86和251 —271处。运用在线软件 ExPASy-PROSITE(http:∥www.expasy.org/prosite/)预测到在这2个跨膜区域附近分别具有1个 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶信号，分别位于85 —99和262 —279氨基酸序列处，推测其具有催化水解 SAH 的功能。

为了检测杨树不同组织与器官中 PtSAHHA 基因的表达模式，以 Actin 基因为内参进行 Realtime-PCR 扩增，获得该基因在杨树不同组织器官内的相对表达量(图 3)。由图 3可见，PtSAHHA 基因在杨树的根、茎、叶等组织中均有表达，但相对表达水平差异较大。PtSAHHA 基因主要在木质部中表达，其在成熟木质部中具有最高的表达水平(13.51)，而未成熟木质部中表达丰度次之(9.97)。此外，在形成层和成熟叶片中也有中等丰度的表达，而在根、韧皮部、顶端分生组织中表达量较低，在未成熟叶片中的表达量极低，仅为0.114 3。从 PtSAHHA 表达模式可以看出，该基因主要在杨树的木质部中表达，且成熟木质部的表达量远远高于其他组织器官。佘义斌等(2008)在陆地棉中克隆得到的GhSAHH 基因在根、下胚轴和纤维早期发育时期较高丰度的表达也证明了该基因具有组织特异性表达。结合本研究结果，初步推断 PtSAHHA 基因参与了次生木质部细胞壁的加厚过程，并通过影响 DNA 甲基化水平来调控木材纤维的合成，对木材的形成过程具有重要的调控作用。

	图 3 PtSAHHA 基因在不同组织中的特异性表达水平 Fig. 3 Relative transcript abundance level of PtSAHHAin different tissues R: 根 ; P: 树干韧皮部 ; C: 树干形成层 ; DX: 树干未成熟木质部 ; MX: 树干成熟木质部 ; YL: 嫩叶 ; ML: 成熟叶 ; A: 顶端分生组织。 R: Root; P: Phloem of stem; C: Cambium ofstem; DX: Developing xylem of stem; MX: Mature xylem ofstem; YL: Young leaf; ML: Mature leaf; A: Apical meristem．

为检测 PtSAHHA 基因在毛白杨自然群体内SNP 多样性水平，获知该基因在种内演化过程中的分子进化特点，在全国毛白杨基因库内选取能够最大范围反映毛白杨生长分布区域的45株基因型个体为试验材料，对全长为2 445 bp 的 PtSAHHA 基因组序列的不同区域进行了序列克隆、比对及其SNP 多态性分析(表 1)。这45株毛白杨个体的 SAHHA 序列已上传至 NCBI，其 GenBank 登录号为 KF467170 —KF467214 。经序列比对分析，共检测到166个SNPs，出现频率为1 /15 bp。在该基因的5 'UTR、3 ' UTR、外显子及内含子中分别检测到18，15，88及45个 SNPs，其出现频率分别为1 /13 bp，1 /17 bp，1 /17 bp和1 /11 bp(表 1)。其中在内含子区域 SNP 出现的频率最高，而在外显子及3 ' UTR 区域 SNP 出现的频率最低(表 1)。经 Dnasp5软件推算得出 PtSAHHA 内具有8个相对保守的 DNA 区域，其中7个位于外显子区域，1个位于3 ' UTR 区域。这表明在进化过程中，PtSAHHA 基因的编码区域受到了较强的选择压力(Suh et al.，2005)。此外，5 'UTR和3 'UTR 也显示出较低的变异程度，推测是由于5 'UTR 区域内存在一些调控基因表达的位点(赵谨等，2005)，且3 ' UTR 区域具有转录水平上调节细胞的发育和分化的功能(Moor et al.，2005)。因此这些区域的保守性有利于维持基因的表达水平，进而保证个体的生存和种群的繁衍。

表 1 PtSAHHA 内不同区域的 SNP 多态性 ^① Tab.1 Nucleotide polymorphisms at the PtSAHHA locus

表 1 PtSAHHA 内不同区域的 SNP 多态性 ① Tab.1 Nucleotide polymorphisms at the PtSAHHA locus 区域 Region 序列长度Sequence length / bp SNP 数量SNP number SNP 频率SNP frequency/ bp-1 核苷酸多样性 Nucleotide diversity π θW ① π 和 θW 为核苷酸多样性指数。 π and θW value mean the nucleotide diversity． 5 '非编码区5 'UTR 229 18 13 0.017 66 0.017 98 外显子1 Exon 1 711 44 16 0.007 10 0.014 47 外显子2 Exon 2 747 44 17 0.007 58 0.013 47 内含子 Intron 510 45 11 0.014 01 0.019 87 3 '非编码区3 'UTR 248 15 17 0.016 20 0.014 75 同义突变 Synonymous mutation — 34 — 0.024 91 0.021 54 非同义突变 Nonsynonymous mutation — 54 — 0.002 33 0.012 04 总计 Total 2 445 166 15 0.010 58 0.015 62

运用 Dnasp5软件对核苷酸多样性指数 π 分析(表 1)显示，外显子区域的核苷酸多样性指数(π_{Exon 1} = 0.007 10和π_{Exon 2} = 0.007 58)明显低于其他区域，其次是内含子区域(π_Intron = 0.014 01)、3'UTR(π_{3 'UTR} = 0.016 20)，且在5' UTR 区域表现出最高的核苷酸多样性指数(π_{5 'UTR}= 0.017 66)(Tajima，1989; Watterson，1975)。编码区域内，同义突变的核苷酸多样性指数(π_Synonymous = 0.024 91)是非同义突变核苷酸多样性指数(π_{Nonsynonymous} = 0.002 33)的10倍，说明纯化选择对基因编码区域的非同义位点起了重要作用(Fu et al.，1993)。对 PtSAHHA 基因内166个 SNP 位点进行突变类型分析显示，135个 SNP 位点发生转换，31个位点发生颠换，转换与颠换的比值约为4.35 > 0.5，且其中大部分为 C 突变为 T。该模式与毛白杨、小叶杨(Populus simonii)部分候选基因的研究结果一致(潘炜等，2011; 卫尊征等，2009)。

在编码区域检测到的88个 SNPs 中包含同义突变34个、错义突变53个以及无义突变1个。对其编码的氨基酸变异情况进一步分析发现，外显子1中含有29个错义突变，其中罕见的 SNP 的密码子由原来的 TGC 突变为 AGC，导致对应的半胱氨酸(Cys)突变为丝氨酸(Ser); 外显子2中突变的密码子由原来的 ACC 突变为 ATC，导致编码的相应氨基酸由苏氨酸(Thr)突变为异亮氨酸(Ile)。中性检测结果(表 2)显示，这3个毛白杨群体在进化的过程中都受到了相似的选择压力，且均存在过剩的罕见 SNP 位点。在3个群体中均显示出非同义突变单核苷酸多样性指数(π_n)与同义突变单核苷酸多样性指数(π_s)的比率 < 1，说明在毛白杨演化过程中，主要是纯化选择驱动了 PtSAHHA 基因内非同义 SNP位点的变异。

表 2 PtSAHHA 在毛白杨3个群体内的核苷酸变异水平 ^① Tab.2 Summary of nucleotide variation in 3 populations for PtSAHHA

表 2 PtSAHHA 在毛白杨3个群体内的核苷酸变异水平 ① Tab.2 Summary of nucleotide variation in 3 populations for PtSAHHA 群体 Population 个体数 n 位点数 s π tol π sil π s π n Tajima’s D * Fu and Li’s D * ① n: 测序样本数 The number of sequenced samples; s: 分离位点数The number of segregating sites; π tol : 整个基因区域单核苷酸多样性Average nucleotide diversity in full gene; π sil : 非编码区和内含子区域的单核苷酸多样性 Average nucleotide diversity in untranslated regions andintrons; π s : 编码区同义突变单核苷酸多样性 Average nucleotide diversity of synonymous mutation in coding region; π n : 编码区内非同义突变单核苷酸多样性 Average nucleotide diversity of non-synonymous mutation in coding region． 东北 Northeastern region 15 82 0.010 37 0.017 21 0.023 15 0.002 36 -0.057 43 -0.971 62 南部 Southern region 15 91 0.010 73 0.017 67 0.022 29 0.002 62 -0.298 63 -1.079 51 西北 Northwestern region 15 83 0.009 47 0.015 83 0.021 94 0.002 02 -0.430 50 -1.033 71 总和 Total 45 166 0.010 58 0.017 63 0. 024 19 0. 002 33 -1. 206 60 -4. 153 76

为了解毛白杨自然群体中PtSAHHA 基因内SNP 位点间的连锁不平衡的延伸长度及程度，运用 DnaSP5软件中的 LD 程序分析了 PtSAHHA 基因内79个常见SNP 位点连锁不平衡水平(图 4)。 图 4表明，LD 并没有延伸至 PtSAHHA 基因的整个区域，其基因内部的 SNPs 连锁不平衡程度随着核苷酸序列长度的增加而迅速降低，随着核苷酸序列长度增加至800 bp，即 r² < 0.1，PtSAHHA 基因内 SNPs 的连锁不平衡水平已衰退至不明显。计算 PtSAHHA 基因内常见SNPs 位点间的 LD 值(平均 r² = 0.134 5)表明，PtSAHHA 基因内的 LD 衰减极为迅速。这一结果表明，在候选基因 PtSAHHA 内进行 SNP 标记位点与表型变异的关联分析是可行的。

	图 4 PtSAHHA 基因内 SNP 的连锁不平衡衰退水平 Fig. 4 Linkage disequilibrium of SNPs in PtSAHHA r2:PtSAHHA 基因内SNP 间连锁不平衡程度 Degree of LD between SNPs within PtSAHHA．

在植物中，LD 延伸范围变异很大。比如，在异交物种玉米中，LD 水平急剧衰退，在1 kb 之内已衰退至不明显(Remington et al.，2001)。但在自交物种拟南芥中，LD 可延伸至250 kb(Nordborg et al.，2002)。在杨属近缘树种间，LD 的延伸长度也有所差异。 Ingvarsson等(2005)在对欧洲山杨(Populus tremula)的多个基因的研究中发现，LD 的衰退非常迅速，在500 bp 以内 LD 就已经衰退消失;Chu等(2009)在欧洲黑杨(Populus nigra)中的研究则显示，不同基因内 LD 的衰减速度差异很大，延伸长度20~1 300 bp(r² < 0.1)。最近对毛果杨基因组范围内广泛LD 的研究表明，LD 的延伸可以达到3~6 kb(Slavov et al.，2012)，打破了先前研究认为的林木具有较低的连锁不平衡水平，为进行林木全基因组水平的关联分析提供了重要的理论依据。

运用混合线性模型(MLM)共检测到6个SNP位点与6个木材品质性状显著连锁(P < 0.05)，经 Fasle Discovery Rate(FDR)多重检测筛选后，最终获得3个 SNPs 位点分别与3个木材性状显著连锁，每一位点可解释表型遗传变异的2.83 %~16.4 %(表 3)。本研究获得的3个SNPs 位点分别位于 PtSAHHA 基因内的不同区域，并与不同木材品质性状显著关联。SNP1位于 PtSAHHA 基因的5 ' UTR 区域，与纤维长度性状极显著关联，遗传贡献率为16.4 % ; Guerra等(2012)的研究发现，5 ' UTR 区域的 SNP 标记与木材化学性状存在关联。有研究表明，5 'UTR 区域虽然不直接编码氨基酸序列，但对基因的表达调控尤其是转录过程具有重要调控作用(Miyamoto et al.，2007 ; 赵谨等，2005 ; Lin et al.，2012)。mRNA 是指导蛋白质翻译的重要信使，mRNA 的形成过程有多重因子参与，而5 ' UTR 区域含有内部核糖体进入的位点，因此具有介导内部翻译起始的功能并影响基因的表达(Cullen，2000)。在毛白杨 PtSAHHA 基因5 'UTR 区域发现的 SNP1位点，可能调控了 PtSAHH 基因的表达，进而影响了纤维长度的变异。位于 PtSAHHA 基因内含子区域的 SNP15位点，分别与纤维长度及微纤丝角显著连锁，分别可解释表型遗传变异的3.86 % 与15.47 %(表 3)。内含子区域虽然不参与蛋白质的翻译过程，但基因组 DNA 转录 mRNA 过程中需将内含子剪切，从而形成成熟的mRNA。因此，内含子序列变异会影响 RNA 翻译前的剪接过程，从而影响蛋白的表达(Sontheimer et al.，1999 ; Chalamcharla et al.，2010)。SNP32标记位于 PtSAHHA 基因的第2个外显子区域，并与α-纤维素含量显著关联，遗传贡献率为2.83 % 。该位点为同义突变位点，虽然没有导致氨基酸序列的改变，但与纤维素含量显著关联。在 Thumma等(2009)的研究中也发现同义突变的 SNP 位点与纤维素含量及纸浆得率存在显著关联，并可顺式作用调控基因的表达。

表 3 SNP 位点基因型分型与表型性状的关联结果 Tab.3 The SNPs locus associated with phenotypic traits

表 3 SNP 位点基因型分型与表型性状的关联结果 Tab.3 The SNPs locus associated with phenotypic traits 性状Trait SNP 位点SNP locus 定位Position P 遗传贡献率 r2 Q 基因型效应Genotypic effect 最小等位基因频率Minor allele frequency 纤维长 Fiber length SASNP1 5'非编码区5'UTR 1.02 E-15 16.4 % 1.428 E-13 CC: 1.166 mmCT: 1.170 mmTT: 1.276 mm T: 0.496 5 SASNP15 内含子 Intron 4.92 E-4 3.86 % 0.022 96 AA: 0.884 mm AT: 1.170 mm TT: 1.218 mm A: 0.491 8 微纤丝角 Microfibril angle SASNP15 内含子 Intron 3.12 E-14 15.47 % 2.184 E-12 AA: 51.78 °AT: 17.76 °TT: 16.02 ° G: 0.449 5 α－纤维素α-cellulose SASNP32 外显子2 Exon 2 0.001 7 2.83 % 0.048 0 CC: 41.22 % CG: 39.74 % T: 0.496 5

在关联分析中发现，SNP1位点和SNP15位点同时与纤维长度相关联，该模式与目前在林木关联研究中证明的木材品质由多个 SNP 位点协同调控的模式相一致(Beaulieu et al.，2011 ; Du et al.，201 a)。然而 SNP1位点和SNP15位点分别对纤维长度和微纤丝角的遗传贡献率(16.4 %和15.47 %)远远高于一些关联研究中获得的遗传贡献率(1.5 %~6.5 %)(Thumma et al.，2009 ; Dillon et al.，2010 ; 2012)。但是，在毛白杨 PtGA20 Ox 基因和UDP-葡萄糖醛酸脱羧酶基因与木材品质的关联研究中同样发现了较高的遗传贡献率(14.47 %和12.37 %)，推测虽然林木性状是由微效多基因控制的，但其中有主效 SNP 位点，对表型性状的遗传贡献率较高(Tian et al.，2012 ; Du et al.，2013 a)。为了研究这3个 SNP 位点的基因型效应，将其与所对应的木材品质性状进行方差分析(表 3)。结果显示，在位于5 ' UTR 区域的 SNP1位点检测到3种基因型 CC，CT和TT，纤维长度平均值分别为1.166，1.170，1.276 mm，但在纤维长度上3种基因型的差异并不显著。而位于内含子区域的 SNP15位点同时与微纤丝角和纤维长度2个性状相关联，在该位点检测到3种基因型 AA，AT和TT，纤维长度平均值分别为0.884，1.170，1.218 mm ; 微纤丝角则分别为51.78 °，17.76 °，16.02 °。在纤维长度和微纤丝角上，该位点的3种基因型差异达到显著水平。 SNP32标记位点位于第2个外显子区域，其密码子上的第3个碱基发生改变，由 CCC 突变为CCG，属于同义突变。该位点检测到2种基因型为 CC和CG，未检测到 GG 基因型。 CC和CG 基因型的α-纤维素含量分别为41.22 %和39.74 %，CC 基因型的α-纤维素含量与 CG 基因型并无显著差异。在对拟南芥突变体的研究中发现SAHH 基因的一个突变导致了拟南芥生长缓慢且生殖力和发芽率都有所降低(Rocha et al.，2005)。从海岸松(Pinus pinaster)发现，参与合成 S-腺苷甲硫胺酸的基因在转录水平的上调会提高木质素的合成量(Villalobos et al.，2012)。以上研究结论进一步表明 PtSAHHA 基因可以通过影响甲基化水平进而影响毛白杨纤维素的形成。本研究在 PtSAHHA 基因中发现的3个与木材品质性状显著关联的SNP 位点，为基于分子标记的毛白杨优良木材品质性状定向选择育种奠定了重要的理论依据。

本研究从毛白杨成熟木质部中分离出 S-腺苷高半胱氨酸水解酶基因 PtSAHHA 的 cDNA 克隆，其内部含有大小为1 458 bp 的完整开放阅读框架，可编码含有485个氨基酸残基的蛋白质。分析 PtSAHHA 蛋白的一级结构表明，PtSAHHA 的蛋白质十分保守，且具有跨膜结构及 S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶信号。组织特异性Realtime-PCR 检测显示，PtSAHHA 基因在杨树不同组织中均有表达，但在木质部中表达丰度最高，在形成层及老叶中有中等丰度表达，而在嫩叶中表达丰度最低。依据其表达模式初步推断 PtSAHHA 基因可能参与次生木质部细胞壁的加厚过程，并通过影响DNA 甲基化水平来调控木材纤维的形成。核苷酸多样性分析表明，PtSAHHA 基因内的不同区域都存在丰富的 SNP 变异位点，且基因内含子区域SNP 出现的频率最高，而在外显子及3 'UTR区域核苷酸的变异程度较低，表明在进化过程中，该基因的编码区存在较强的选择压力，其保守性有利于维持基因的蛋白质特性，进而保证个体的生存和种群的繁衍。基于 PtSAHHA 基因内的 SNPs 连锁不平衡分析推测，在基因内800 bp 左右SNPs 的连锁不平衡水平已衰退至不明显;LD 水平的迅速衰退为开展基于候选基因的关联作图提供了重要的理论依据。在由426株毛白杨基因型个体组成的关联作图群体内，对 SNPs 位点与木材品质性状进行关联分析，共检测到3个 SNPs 位点分别与3个木材性状显著连锁，分别位于 PtSAHHA 基因的5 'UTR、内含子及外显子区域，并与3个木材品质性状如纤维长、微纤丝角及α-纤维素含量显著连锁，每一标记位点可解释表型遗传变异的2.83 %~16.4 %，研究结果为基于分子标记的毛白杨优良木材品质性状定向选择育种提供了重要的理论依据。