2013, Vol. 49
文章信息
- 徐斌, 张方秋, 潘文, 刘有成
- Xu Bin, Zhang Fangqiu, Pan Wen, Liu Youcheng
- 我国红锥天然群体的遗传多样性和遗传结构
- Genetic Diversity and Genetic Structure in Natural Populations of Castanopsis hystrix from Its Main Distribution in China
- 林业科学, 2013, 49(10): 162-166
- Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(10): 162-166.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20131025
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文章历史
- 收稿日期：2012-12-14
- 修回日期：2013-07-22
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红锥(Castanopsis hystrix)是壳斗科(Fagaceae)锥属(Castanopsis)的常绿乔木，天然分布于我国广东、广西、云南、海南以及福建南部(中国树木志编委，1981;《广东森林》编辑委员会，1990)，是我国华南地区一个重要的生态公益林树种和珍贵用材树种。红锥为二倍体，2n=2x=24(Http://www.tropicos.org/Name/)，单性花、雌雄同株，以风媒传粉为主(中国科学院中国植物志编辑委员会，1998)。红锥生长快，树干通直，心材比例大，是上等的家具、造船、车辆等用材(郑万钧，1983)。
近年来我国对于红锥的研究不断增多，主要集中在红锥的繁殖技术、造林技术、生理生态特征、木材材性和遗传改良等方面(黄永权等，2004;张凤良等，2012)。在红锥种质资源遗传多样性方面，Li等(2007)利用SSR分子标记研究了我国华南地区19个红锥种源的叶绿体DNA的遗传多样性，王鸣刚等(2006)、杨峰等(2012)利用ISSR和RAPD标记技术研究了部分红锥优质品系和优良家系的遗传多样性。本研究利用ISSR方法对我国红锥主要天然分布区的234份红锥种质进行分析，旨在揭示红锥种质资源的遗传多样性水平及其遗传结构，为红锥育种策略的科学制定和种质资源的有效保护及利用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料供试材料包括15个红锥天然群体234个植株的嫩叶样品，均采自红锥基因库。此基因库于2000年根据现存红锥天然林分布状况，从广东、广西、云南、海南和福建收集枝条，通过嫁接在广东省龙眼洞林场营建。枝条收集的原则为:随机选择植株，尽量覆盖整个群体，植株间距在50 m以上，采集其树冠中上部南侧向阳的当年生枝条。各群体的地理位置和样本数量见表 1。在红锥基因库中采集嫩叶，于-20 ℃保存，用于DNA提取。
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DNA提取采用改进的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)法(徐斌等，2008)。将提取的DNA通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计(Eppendorf)检测其浓度和纯度。从加拿大哥伦比亚大学(UBC)设计的100条ISSR引物中筛选出15条谱带清晰、稳定性和重复性好的引物(表 2)用于DNA样品的ISSR分析。PCR扩增采用25 μL的反应体系: 10 mmol·L-1 Tris-HCl(pH9.0)，50 mmol·L-1 KCl，0.1% Triton X-100，2.5 mmol·L-1 MgCl2，0.3 mmol·L-1 dNTPs，1 U Taq DNA聚合酶，25 ng模板DNA，0.4 μmol·L-1引物。PCR扩增程序为: 94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，退火温度1 min，72 ℃ 2 min，35个循环;72 ℃ 10 min;最后4 ℃保存。PCR扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测。
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对ISSR-PCR扩增产物的电泳结果采用“0-1”数据记录谱带位置，在电泳图谱同一位置上以有带记为1，无带记为0，形成0/1数据矩阵。计算各群体的多态位点百分率(PPB，percentage of polymorphic b and s)和Shannon表型多样性指数(H0，Shannon，s phenotypic diversity index)。其中H0=-ΣPi lnPi，式中，Pi为表型频率，即某一扩增条带在第i个群体中出现的频率(Shannon et al.，1949);利用H0计算群体内遗传多样性(Hpop)和物种遗传多样性(Hsp)，群体内遗传多样性所占比率Hpop/Hsp，群体间遗传多样性所占比率(Hsp-Hpop)/Hsp。WINAMOVA1.55分析软件(Excoffier et al.，1992)进行分子方差分析，计算群体间和群体内的方差分量并作显著性检验，以此衡量群体间和群体内遗传变异水平。利用软件GenALEx 6.4(Peakall et al.，2006)计算群体间的Nei’s无偏遗传距离(D)(Nei et al.，1983)。利用IBD3.21(http://ibdws.sdsu.edu/，Jensen et al.，2005)进行Mantel检验，分析地理距离与遗传距离的相关性，其中地理距离是根据采样点的经纬度计算群体间的直线距离(km)(http://jan.ucc.nau.edu/～cvm/latlongdist.html)。
2 结果与分析 2.1 红锥天然群体遗传多样性应用15条引物对15个天然群体的红锥DNA进行ISSR-PCR分析，PCR共扩增出176个位点，多态性位点167个，平均每个引物扩增出10.35个位点和9.82个多态性位点。统计结果(表 3)表明:红锥具有较高的多态位点比率，遗传多样性较为丰富，其多态位点百分率(PPB)为94.89%，Shannon表型多样性指数(H0)为0.387 3。红锥不同群体之间PPB和H0存在一定的差异，15个群体的PPB为38.64%～89.77%，H0为0.154 8～0.358 3，其中，广东高州、广东陆河、广东信宜群体遗传多样性在所有群体中最为丰富，PPB、H0值相对较大，而福建华丰、广东始兴群体的PPB、H0值都较小，遗传多样性较低。
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利用Shannon表型多样性指数对红锥群体遗传变异分析(表 4)得出，红锥群体间的遗传变异为21.29%。群体遗传变异的AMOVA分析结果(表 5)显示，红锥遗传分化系数(ΦST)为0.112 5，说明红锥群体大部分遗传变异发生在群体内(88.75%)，只有11.25%的遗传变异发生在群体间;显著性检验也表明，红锥天然群体间和群体内都存在显著的遗传变异(P＜0.001)。2种方法均表明红锥群体内的遗传变异是总变异的主要来源，群体之间有明显的遗传分化。
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根据Nei’s方法计算出红锥群体间的Nei’s无偏遗传距离(D)(表 6)，可以看出，红锥天然群体的遗传距离为0.012～0.163。广西浦北和广西博白群体间的Nei’s无偏遗传距离(D)最小(0.012)，它们之间的亲缘关系最近;福建华丰与广东始兴群体间的Nei's无偏遗传距离(D)最大(0.163)，亲缘关系最远。为了解不同分布区红锥的遗传距离与地理距离之间是否存在内在关联，对红锥群体间的遗传距离和地理距离进行Mantel相关性分析，结果表明，15个红锥群体间的遗传距离和地理距离之间相关性不显著(P＞0.10)。
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研究表明广布植物存在较高的遗传多样性水平，如枫香(Liquidambar formosana)(PPB=87.41%)(毕泉鑫等，2010)、木荷(Schima superba)(PPB=90.02%)(金则新等，2007)、油松(Pinustabulaeformis)(PPB=91.67%)(李毳等，2006)、蜡梅(Chimonanthus praecox)(PPB=88.70%)(赵冰等，2008)。本试验研究结果显示红锥群体水平存在很高的遗传多样性，红锥天然群体多态位点百分率(PPB)为94.89%，高于以上广布植物，这与Li等(2007)、杨峰等(2012)、王鸣刚等(2006)对红锥群体、品系/家系的遗传多样性的研究结果一致，表明红锥资源存在很高的遗传多样性。对15个种源的分子方差分析(AMOVA)表明，11.3%的遗传多样性存在于群体间，而绝大部分的遗传变异存在于群体内(88.7%)，说明群体之间遗传分化较小。另外从Shannon表型多样性指数来看，有21.3%遗传变异存在群体间，同样表明群体之间遗传分化相对较小，与Li等(2007)得到的研究结果(23.6%遗传变异存在群体间)一致。
多数学者普遍认为，分布广、多年生、异交且种子随风传播或鸟兽取食的木本植物的遗传多样性水平较高，其群体内的遗传多样性比群体间更丰富(Hamrick，1990;Hamrick et al.，1992;郑健等，2008)。红锥较高的遗传多样性及其遗传结构的形成可能有以下几个方面的原因:1)红锥是以风媒传粉为主的异交植物，也可借助种子自身重力和鸟兽取食来扩散传播，分布范围较广，为基因重组提供了机会，产生丰富的遗传多样性;同时促进了群体间的基因交换，从而减小了群体间分化。2)植物遗传多样性与环境适应有关(Semagn et al.，2000)。红锥分布范围较广，适应能力强，在红锥天然分布区内气候、土壤等条件存在巨大差异(张方秋等，2006;2008)，在长期自然选择的作用下产生了广泛的遗传变异，形成了表型不一，对环境条件要求各异的地理种源。3)目前，由于滥采滥伐和生境的人为改变，致使红锥天然资源破坏十分严重，红锥分布多呈零星状态，其生境片断化和适宜生存环境不断萎缩和退化，这也是影响红锥群体遗传分化的一个重要原因。4)居群内的遗传多样性水平同时还受取样数目的影响(Nybom et al.，2000;Gaudett et al.，2005)，居群内的遗传多样性与取样的数目成正比(Persson et al.，1998)。在本研究中福建华丰、广东始兴的PPB、H0值都较小，遗传多样性较低，这可能与收集样品数目较少有关(每一种源5份材料)，这在一定程度上可能影响了该群体的分析结果。5)经Mantel检测表明15个红锥天然群体的地理距离和遗传距离之间没有显著相关性，这与一些学者的研究结果相一致，如李晓东等(2003)对水杉(Metasequoia glyptostroboides)、穆立蔷等(2007)对紫椴(Tilia amurensis)、赵冰等(2012)对秀雅杜鹃(Rhododendron concinnum)的研究结果均显示遗传距离与地理距离间不存在显著相关性。根据Fisher等(2000)的观点，只有在基因流动起主导作时，遗传距离和地理距离才会出现相关性，当遗传群体太小而产生遗传漂移时，二者的相关性就不显著;推测长期以来红锥天然群体呈零散分布，群体个体数量很小，可能是造成研究结果中红锥的遗传距离和地理距离无明显相关性的原因。
本研究利用ISSR技术以细胞核DNA为模板对红锥群体的遗传多样性和遗传结构进行分析，与Li等(2007)利用SSR技术以叶绿体DNA为模板对红锥群体进行遗传分析获得的遗传多样性及遗传分化结果一致，表明以上2种标记及不同DNA都适合于红锥种质资源遗传多样性的分析，这为红锥指纹图谱、遗传图谱构建、基因定位、基因克隆提供了研究基础。此外，本研究采样具体位置与Li等(2007)不同，所以本研究结果对于前期红锥种质资源的遗传多样性研究将会是一个较全面的丰富与补充，这对于正确评价我国红锥天然分布资源具有重要意义。
红锥群体遗传多样性和遗传结构的分析，对实现红锥资源的有效管理利用和制定合理的保护策略有重要的参考价值。本研究揭示红锥天然群体具有较高的遗传多样性，特别是广东高州、广东陆河、广东信宜的资源相对丰富，遗传多样性也较高，应对其进行就地保护和重点开发利用。红锥群体间和群体内都存在显著的遗传变异，且红锥遗传变异主要存在于群体内，因此在红锥的遗传改良中，优良种源、优良家系和优良个体选择都不容忽视，在注重种源选择的同时，要加大种源内个体的选择力度，通过群体选择和优树选择相互配合，从而取得最大的遗传增益。此外，为更好地进行红锥良种选育、种源区划以及种子调拨区划分，建议在分子标记基础上，结合表型分析对红锥种质资源进行综合评价。
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