寄生蜂毒液具有调控寄主体液免疫、细胞免疫、生长发育、内分泌激素和营养代谢等功能(Nakamatsu et al.，2002 ; 2003 ; 2004 a;2004 b;Nguyen et al.，2008 ; Kwon et al.，2008 ; Suzuki et al.，2007 ; Zhang et al.，2004 ; Zhu et al.，2011)。 Houari等(2006)研究发现草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)被注射双斑镶颚姬蜂(Hyposoter didymator)的 PDV(polydnavirus)后，酚氧化酶、酚氧化酶激活酶、丝氨酸蛋白酶等基因产生了差异表达; 斑痣悬茧蜂(Meteorus pulchricornis)的 VLPs(virus-like particles)能使粘虫(Mythimna separata)的颗粒血细胞大量凋亡，并使少量浆血细胞也发生凋亡(Suzuki et al.，2006); 沙草粘虫(裹尸)薄茧小蜂(Euplectrus sp． near plathypenae)和粘虫盘绒茧蜂(Cotesia kariyai)毒液能减缓寄主的生长或抑制寄主化蛹(Beckage et al.，2004)，但棉大卷螟甲腹茧蜂(Chelonus inanitus)毒液却能使寄主提前早熟变态(Peenacchio et al.，2006)。另外，Tanaka等(1987)研究发现，寄生蜂能通过破坏寄主前胸腺激素的释放来抑制寄主化蛹; 毒液不仅能抑制促前胸腺激素PTTH 的分泌和合成，也能通过保持蜕皮激素较低水平来延缓寄主幼虫 －蛹中间态的蜕皮(Steiner et al.，1999); Guerra等(1993)研究发现墨西哥棉铃象(Anthonmus grandis)的3龄幼虫被蜜茧蜂(Bracon mellitor)寄生后，体内自由氨基酸发生变化，出现2个自由氨基酸峰，而且自由氨基酸的上升总是与整体可溶蛋白的下降同步。对绝大多数不具多酚 DNA 病毒和畸形细胞的寄生蜂而言，毒液是调控寄主生理最关键的因子(Richards et al.，2000; Cai et al.，2004; 郦卫弟等，2006); 内寄生蜂和外寄生蜂毒液对寄主免疫、营养、内分泌等方面都有调控作用，但大量研究发现外寄生蜂对毒液的依赖性高于内寄生蜂(Nakamatsu et al.，2003; Zhu et al.，2011; Quicke，1997; Rivers et al.，2005; Webb et al.，1994)。

川硬皮肿腿蜂(Sclerodermus sichuanensis)隶属于膜翅目(Hymenoptera)肿腿蜂科(Bethylidae)，是杉棕天牛(Callidium villosulum)和松墨天牛(Monochamus alternatus)等钻蛀性害虫的抑性外寄生蜂，能在寄生过程中使寄主永久性麻痹(周祖基等，1997)。川硬皮肿腿蜂雌蜂生殖系统较简单，无明显萼区，毒囊体积所占比例大，可见毒液在川硬皮肿腿蜂和寄主昆虫相互关系中起重要作用(蒋学建等，2006)。目前，对川硬皮肿腿蜂毒液的研究主要围绕在对寄主生理生化的影响等方面，而对蜂毒的麻痹作用、蜂毒蛋白的分离纯化的报道相对较少。本文将对寄主的麻痹作用进行研究，并对其一种麻痹毒液蛋白进行分离纯化和活性鉴定。

川硬皮肿腿蜂为四川农业大学森林保护省级重点实验室用黄粉虫(Tenebrio molitor)蛹繁殖的雌成蜂，其子代雌蜂羽化6天后(以完成交配)用于试验。

供试寄主黄粉虫用麦麸和无污染蔬菜饲养，试验前已在实验室繁殖多年。选取体质量为0.1~0.15 g 的蛹用于试验。

雌蜂驯化: 将已交配雌蜂和黄粉虫蛹以1:1比例放入玻璃指形管(6 cm ×1 cm)中，使雌蜂熟悉向寄主注入毒液并麻痹寄主的过程，若能在3 h 内麻痹寄主，则视为驯化成功。此过程是为了避免雌蜂初次麻痹寄主所花时间过长，不能保持处理与对照组寄主蛹龄的一致性。

寄生试验:将成功驯化的雌蜂和黄粉虫蛹以1∶ 1比例放入玻璃指形管(6 cm × 1 cm)中，以脱脂棉封口，自然光培养，成功麻痹寄主24 h 后记为第1天。

消毒灭菌: 对解剖器械(镊子、解剖针等)，注射器械(微量进样器20 μL)、PBS(8 g·L^-1 NaCl，0.01mol·L^-1磷酸盐，pH 7.0~7.2)、蒸馏水、去离子水等进行灭菌(115 Pa，20 min); 用棉球蘸75%酒精对黄粉虫腹部进行消毒。

在解剖镜下用镊子拉出雌蜂产卵鞘，取毒囊并释放毒液至盛有 PBS 溶液，0 ℃冰水浴的 Eppendorf管中，10 000 g、4 ℃离心10 min，除去空毒囊和组织碎片，取上清液用于试验。

取20头寄生蜂毒液，从而对单个毒囊的毒液蛋白含量进行测定，测定方法为Bradford(1976)法，标准曲线用牛血清蛋白进行测定，曲线范围0~100μg，试验重复5次。

取制备好的毒液用PBS 稀释成0.01，0.02，0.05，0.1，0.2和0.3 VRE(1个毒囊中的毒液溶入1 μL PBS 认定为1 VRE)，将稀释好的毒液对黄粉虫蛹进行腹部注射(每头1 μL)，注射部位为两腹板之间连接膜(寄生蜂寄生时注射毒液的部位)，若蛹因注射产生的伤流而死亡，则重新注射新的蛹;每个浓度注射40头蛹，以注射 PBS 为对照，注射后置于(27 ± 1)℃，RH85%环境下培养，12 h 后统计麻痹情况，24 h 后统计恢复活动的蛹的数量; 试验重复3次。

参照1.2节，制备200头寄生蜂毒液，溶于1 mL 去离子水中。

分别提取30头蜂毒液(参照1.2节)并溶于去离子水中，并以上样缓冲液为对照，作毒液总蛋白 PAGE和SDS-PAGE。

PAGE: 电泳浓缩胶为5%，分离胶浓度为8%，80 V 恒压至指示剂进入分离胶后，以100 V 恒压至指示剂距离胶底部约1 cm 时结束电泳，考马斯亮蓝R250染色，并扫描分析。

SDS-PAGE: 电泳浓缩胶为5%，分离胶浓度为12%，80 V 恒压至指示剂进入分离胶后，以100 V恒压至指示剂距离胶底部约1 cm 时结束电泳，考马斯亮蓝 R250染色，并扫描分析。

采用 SephadexG75对毒液样品进行凝胶层析，条件设置: 恒流泵流速为0.5 mL·min^-1，自动收集器每管2 min，每管收集1 mL，检测器吸光值为A₂₈₀ 。

葡聚糖凝胶层析后，对照[样品Vn． 0(Venom number)，第5-9管]峰和纯化蛋白峰(样品 Vn． 1，第55-59管)分别合并，用冷冻干燥机将各合并液浓缩成固体，取40 μL 去离子水溶解，用20 μL 分别做 PAGE和SDS-PAGE 电泳(参照1.4.2节)。

将上述样品浓缩液用于麻痹活性检测，以对照组层析液、去离子水和灭菌PBS 为阴性对照，毒液(0.01，0.03，0.05和0.3VRE)为阳性对照。每只蛹腹部注射1 μL，共注射40头(参照1.3节)。重新分离纯化、浓缩、纯度检测，活性检测重复3次。

试验数据用 SPASS 18.0软件进行分析。

川硬皮肿腿蜂每个毒囊蛋白含量约为(3.078 ± 0.351)μg，浓度0.3 VRE 蛋白含量约为(0.923 ± 0.105)μg·μL^-1 。

经过观察麻痹程度可分为轻微麻痹、完全麻痹和致死麻痹，其中: 轻微麻痹是指黄粉虫蛹受刺激后没有完全丧失活动能力，躯体尚能摆动，但是活动速度较缓慢，幅度较小，不灵活，并且这种麻痹作用是可逆的，24 h 后恢复活动与对照无差异; 完全麻痹是指对刺激完全没有反应，完全僵化，没有任何动作; 致死麻痹是指注射毒液后黄粉虫蛹不产生与轻微麻痹或完全麻痹相似的麻痹效果，而是直接死亡。

经人工注射毒液的蛹，被麻痹的程度与毒液注入量呈正相关，恢复活动情况与毒液注入量呈负相关(图 1)。注入0.01VRE 毒液的蛹表现出轻微的麻痹，且大部分能极显著地恢复活动(P< 0.01)，但随着毒液浓度增加，黄粉虫蛹逐渐表现出对刺激无反应的完全僵化迹象，且恢复活动能力随之减弱 ; 当浓度达到0.03 VRE 时，完全麻痹状态极显著升高(P<0.01)，轻微麻痹状态、恢复能力极显著减弱(P< 0.01); 当浓度达到0.05 VRE 时，大量蛹开始显著地被完全麻痹(P< 0.01); 当浓度达到0.2 VRE 时麻痹状态开始显著不可复(P< 0.01)，使蛹表现完全僵化状态至死。人工注射的蛹在4，5天后大量死亡。

图 1 注射不同浓度毒液后寄主麻痹状况① Fig. 1 Paralytic degree of host after injected with different concentration venom VRE 指1个毒囊中的毒液溶入1 μL PBS 认定为1 VRE。 TheVRE was venom reservoir equivalent，one venom reservoir equivalentwas defined as the supernatant from one torn venom reservoir in 1 μLPBS. 不同小写字母表示0.05水平差异显著 ，不同大写字母表示0.01水平差异极显著。Different small letters in the figure meansignificant difference at 0.05 level among treatments， different capital letters in the figure mean significant difference at 0.01 level among treatments. 下同。The same below.

由毒液总蛋白 PAGE 及 SDS-PAGE 电泳图谱可以看出(图 2)，川硬皮肿腿蜂毒液中存在6种大分子毒液蛋白，分别为 vpr 1-vpr 6(venom protein 1-6); 经过β －巯基乙醇分解二硫键后，SDS-PAGE 电泳出现9条肽链(vpr Ⅰ—Ⅸ(2 b))，经计算9条肽链相对分子量分别约为: vpr Ⅰ 187.83 ku，vpr Ⅱ 88.73 ku，vpr Ⅲ 68.33 ku，vpr Ⅳ 59.40 ku，vpr Ⅴ 38.23 ku，vpr Ⅵ 27.30 ku，vpr Ⅶ 16.89 ku，vpr Ⅷ 14.13 ku，vpr Ⅸ 12.94ku，即所有肽链相对分子量均介于6.5~200 ku 之间。

图 2 毒液总蛋白 PAGE(a)及 SDS-PAGE(b)电泳图谱 Fig. 2 PAGE(a)and SDS-PAGE(b) electrophoretogram of total venom protein A 为 PAGE 对照点样孔。 A wasthe PAGE hole of controlsampleapplication. B 为 PAGE 毒液总蛋白点样孔。B was the PAGE hole oftotal venom protein sample application. C为 SDS-PAGE 毒液总蛋白点样孔。 C was the SDS-PAGE hole of total venom protein sampleapplication. D 为蛋白分子量标(宽)点样孔。D wasthe SDS-PAGEhole of protein molecular weight marker(broad)sample application.

经 Sephadex G75层析后，检测器检测出6个峰(Peak 1-Peak 6)，与毒液总蛋白 PAGE 对应相同，即第1-6个峰依次为vpr 1-vpr 6(图 3)。

	图 3 Sephadex G75层析检测 Fig. 3 Detection of SephadexG75 chromatography Peak 1-Peak 6分别指Sephadex G75层析检测的6个峰 Peak 1-Peak 6 were stood for 6 peaksrespectively，Sephadex G75 chromatographydetected; vpr 1-vpr 6分别指6种毒液大分子蛋白 vpr 1-vpr 6 were stood for 6 macromolecular venom proteins in venom respectively.

经PAGE 电泳检测，分离纯化的毒液蛋白出现1条带(图 4 a)，证明 Sephadex G75层析分离纯化的毒液蛋白 vpr 4(Vn． 1)是单一纯净的; 经 SDS-PAGE 电泳检测，出现2条带(vpr Ⅴ，vpr Ⅸ)(图 4 b)，证明vpr 4被β －巯基乙醇分解成了2条肽链(vpr Ⅴ，vprⅨ)，即 vpr 4的相对分子质量为 vpr Ⅴ和vpr Ⅸ的相对分子质量之和，约为51.17 ku。

图 4 纯化毒液蛋白 PAGE(a)、SDS-PAGE(b)电泳图谱 Fig. 4 SDS-PAGE electrophoretogram of purified venom protein E 为 PAGE 对照点样孔。 E wasthe PAGE hole of controlsampleapplication. F 为 PAGE 纯化毒液蛋白点样孔。F was the PAGE holeof purified venom protein sample application. G 为 SDS-PAGE 对照点样孔。G was the SDS-PAGE hole of control sample application. H 为 SDS-PAGE 纯化毒液蛋白点样孔。H was the PAGE hole of purifiedvenom protein sample application. I 为蛋白分子量标(宽)点样孔。Iwas the SDS-PAGE hole of protein molecular weight marker(broad) sample application.

Sephadex G7 5层析分离纯化后的毒液蛋白 vpr 4(Vn ． 1)麻痹黄粉虫蛹总数目极显著高于对照组(P< 0 .0 1)，极显著低于0 .0 1 VRE 总毒液蛋白(P< 0 .0 1)，证明分离纯化后得到的蛋白具有麻痹活性，属于麻痹蛋白 ; 轻微麻痹数目极显著高于0 .0 3VRE(P<0 .0 1)，但与0 .0 5 VRE 总毒液蛋白差异不显著(P > 0 .0 5); 完全麻痹数目极显著高于0 .0 3VRE(P< 0 .0 1)，且极显著低于0 .0 5 VRE 总毒液蛋白(P< 0 .0 1); 恢复活动数目极显著低于0 .0 3 VRE(P< 0 .0 1)，且极显著高于0 .0 5 VRE总毒液蛋白(P< 0 .0 1)(表 1)。

表 1 各峰毒液麻痹蛋白活性检测^① Tab.1 Detection of the activity of paralysis protein in different fractionations

表 1 各峰毒液麻痹蛋白活性检测① Tab.1 Detection of the activity of paralysis protein in different fractionations 麻痹状况Paralysis degree Vn. 0 Vn. 1 毒液 Venom 灭菌蒸馏水Sterile purified water 灭菌 PBS Sterile PBS 0. 01 VRE 0. 03 VRE 0. 05 VRE 0. 3 VRE ① 1个毒囊中的毒液溶入1 μL PBS认定为1 VRE。 The VRE was venom reservoir equivalent，one venom reservoir equivalent was defined as the supernatant from one torn venom reservoir in 1 μL PBS.数据为平均值±标准误。 The data in the table are mean± SD.不同小写字母表示0.05水平差异显著 ，不同大写字母表示0.01水平差异极显著。 Different small letters in the table mean significant difference at 0.05 level among treatments，different capital letters in the table mean significant difference at 0.01 level among treatments. 麻痹总数目Total paralysis/head 1.33 ±0.33 Aa 31.67 ±0.33 Bb 37.00 ±1.73 Cc 39.00 ±0.58 Cc 39.33 ±0.33 Cc 38.67 ±0.88 Cc 0 Aa 0 Aa 轻微麻痹Slight paralysis/head 1.33 ±0.33 Aa 6.33 ±0.33 DFdf 32.67 ±1.45 CGcg 18.67 ±0.88 EHe 7.33 ±0.88 Ff 7.33 ±0.33 Ff 0 Aa 0 Aa 完全麻痹Complete paralysis/head 0 Ab 25.33 ± 0.33 Cc 4.33 ±0.33 Dd 20.33 ±1.20 Ee 32.00 ±1.15 Jj 31.33 ±0.67 Jj 0 Aab 0 Aab 恢复活动 Reactivated host/head 1.33 ±0.33 Aa 14.67 ±0.67 EHeh 29.00 ±1.53 Gg 15.33 ±0.33 Hh 9.67 ±0.67 Ff 0.67 ±0.33 Aa 0 Aa 0 Aa

寄生蜂毒液不论是单独还是与其他成分联合作用都具有多种功能，例如干扰寄主免疫应答、多方面的抑制作用和减少血细胞调节反应等(Nakamatsu et al.，2003 ; Beckage et al.，2004 ; Asgari，2006 ; 2007 ;Richard et al.，2004 ; Moreau et al.，2005 ; Schmidt et al.，2001 ; Shelby et al.，1999)。川硬皮肿腿蜂毒液总蛋白 PAGE 电泳结果显示毒液有6种大分子蛋白，SDS-PAGE 电泳结果显示6种大分子蛋白被分解成9条肽链，这与很多以毒液为调控方式的寄生蜂毒液蛋白数量差异很大，例如丽蝇蛹集金小蜂(Nasonia vitripennis)毒液经2种质谱联合检测，在生物信息学和蛋白质组学研究中识别出79种蛋白，其中，16种与其他组织和分泌物的已知蛋白类似，另外23种与任何已知的蛋白都没有相似性(Graaf et al.，2010)。寄生蜂要对寄主进行精细的调控，需要功能丰富的多种蛋白质，因此粗毒液的成分也就成了毒液的主要作用物质，例如有79种毒液蛋白的丽蝇蛹集金小蜂寄生后，它在寄主免疫抑制、诱导寄主滞育和提高寄主脂肪含量等方面均有出色的表现(Graaf et al.，2010 ; Saunders，1996 ; Cornell et al.，1978 ; Legner，1967)。川硬皮肿腿蜂毒液蛋白含量虽少，但在寄生过程中会不断撕咬寄主，且子代蜂也寄生于寄主表面，所以川硬皮肿腿蜂对寄主免疫的调控应该是毒液、卵巢蛋白、萼液以及子代分泌物联合作用的结果。另外，Parkinson等(1999)、Richards等(2000)和Hartzer等(2005)也认为寄生蜂对寄主免疫调控是由毒液、卵巢蛋白和萼液共同作用的结果。

毒液蛋白经Sephadex G75层析分离纯化、PAGE和SDS-PAGE 纯度检测，证明毒液大分子蛋白 vpr 4被分解为肽链 vpr Ⅴ和vpr Ⅸ，且相对分子质量约为51.17 ku，这与大量寄生蜂毒液蛋白分离纯化研究结果相类似，例如Parkinson等(2002)对瘤姬蜂(Pimpla hypochondriaca)毒液组分的研究，以及 Parkinson等(1999)分离纯化得到瘤姬蜂具有麻痹活性的27 ku 的蛋白。活性检测结果显示: vpr 4具有麻痹活性，但麻痹总数目极显著低于0.01VRE总毒液蛋白，证明Vn． 1麻痹活性较低，麻痹综合效果应低于0.01 VRE 的毒液总蛋白; 轻微麻痹数目极显著高于0.03 VRE，但与0.05 VRE 毒液总蛋白差异不显著，证明 Vn． 1轻微麻痹效果应大于或等于0.05 VRE; 完全麻痹数目极显著高于0.03 VRE，且极显著低于0.05 VRE 毒液总蛋白，证明 Vn． 1完全麻痹效果应处于0.03和0.05 VRE 之间; 恢复活动数目极显著低于0.03 VRE，且极显著高于0.05VRE 毒液总蛋白，证明 Vn． 1被麻痹后恢复活动效果应处于0.03和0.05 VRE 之间。上述麻痹效果是不平衡的，主要可能有以下原因: 1)毒液总蛋白经 Sephadex G75层析分离纯化后，麻痹蛋白虽经浓缩，但总量与种类变少，或总毒液中除麻痹蛋白外，还存在其他非蛋白麻痹或麻痹辅助成分，而这些成分在葡聚糖凝胶过柱时被分离开，故麻痹综合效果减弱; 2)一种毒液蛋白或许只存在一种侧重效果，要么侧重轻微麻痹，要么侧重完全麻痹，要么侧重恢复效果，而这种侧重效果也可能存在抑制或促进之分; 3)麻痹效果可能是由2种或多种蛋白的共同调控的结果，而蛋白与蛋白之间正是由于相互作用才能对寄主免疫进行精细调控; 4)除麻痹蛋白外可能还有其他非蛋白成分单独或联合对寄主进行调控，或其他非蛋白成分与毒液联合作用，进而对寄主进行调控，如 Skinner等(1990)就发现莱氏棱角肿腿蜂(Gomiozus legneri)不完全麻痹毒液中有机小分子含量丰富，包括多胺、腐胺、脯氨酸和少量多巴胺，其中多巴胺具有阻碍神经和肌肉膜阳离子通道的功能; 5)毒液的调控与寄主的免疫抵抗之间也有相互作用，也可能造成麻痹与恢复效果不同。对毒液麻痹过程而言，寄主可能是经轻微麻痹至完全麻痹，再由完全麻痹引发死亡，进而被消化取食; 麻痹过程可能还存在寄主免疫、毒液调控和联合调控等多方面的作用，从而引起寄主恢复活动、轻微麻痹与完全麻痹之间的相互转换，继而对寄主免疫、内分泌和营养代谢等进行精细调控; 另外，寄主虽恢复活动，但由于毒液已经对寄主造成不可逆作用，使寄主不能正常蜕皮和羽化，只能被当代蜂和子代蜂取食。本文对寄生蜂毒液的麻痹作用以及一种麻痹蛋白的分离纯化作了一系列研究，同时也产生了很多疑问，需要进一步探讨。