林业科学  2013, Vol. 49 Issue (10): 48-53   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20131008
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文章信息

杨尚尚, 苑兆和, 李云, 李芹, 尹燕雷, 冯立娟, 招雪晴
Yang Shangshang, Yuan Zhaohe, Li Yun, Li Qin, Yin Yanlei, Feng Lijuan, Zhao Xueqing
石榴‘泰山红’的花粉萌发生物学特性
Biological Characteristics of Pollen Germination of ‘Taishanhong’ Pomegranate
林业科学, 2013, 49(10): 48-53
Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(10): 48-53.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20131008

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收稿日期：2012-10-26
修回日期：2013-02-23

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杨尚尚
苑兆和
李云
李芹
尹燕雷
冯立娟
招雪晴

引用本文
杨尚尚, 苑兆和, 李云, 李芹, 尹燕雷, 冯立娟, 招雪晴. 2013. 石榴‘泰山红’的花粉萌发生物学特性[J]. 林业科学, 49(10): 48-53.
Yang Shangshang, Yuan Zhaohe, Li Yun, Li Qin, Yin Yanlei, Feng Lijuan, Zhao Xueqing. 2013. Biological Characteristics of Pollen Germination of ‘Taishanhong’ Pomegranate. Scientia Silvae Sinicae, 49(10): 48-53.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20131008
石榴‘泰山红’的花粉萌发生物学特性
杨尚尚1, 2, 苑兆和1, 李云1, 李芹1, 尹燕雷1, 冯立娟1, 招雪晴1    
1. 山东省果树研究所 泰安 271000;
2. 山东农业大学林学院 泰安 271018
收稿日期：2012-10-26；修回日期：2013-02-23
基金项目：山东省科技发展计划项目(2011GNC11025);山东省农业科技成果转化资金项目(鲁科农字[2010]79号)。
通讯作者：苑兆和
摘要：以石榴栽培品种‘泰山红’为试材,利用扫描电镜观察石榴的开花进程和花粉萌发进程,确定花粉萌发的最佳培养条件,研究不同植物生长调节物质对花粉萌发和花粉管伸长的影响。结果表明: 1)石榴花朵开放至花朵凋落或坐果经过3个形态变化。散粉一般在花瓣展开的第2天,集中在8: 00—17: 00(22~30 ℃,空气相对湿度25%~40%),花药散粉完毕一般需要1~2天。2)通过正交试验得出,最佳培养条件组合为: 10%蔗糖,0.005%硼酸,pH值7.0。 3)石榴花粉的萌发时间较短,仅3 h。4)低浓度的6-BA(1~10 mg·L-1)、2,4-D(1~5 mg·L-1)对花粉萌发和花粉管生长起促进作用,超过此浓度范围,对花粉萌发和花粉管生长起抑制作用,促进花粉萌发和花粉管生长的最佳浓度为10 mg·L-1的6-BA和5 mg·L-1的2,4-D; NAA(1~30 mg·L-1)和多效唑(50~800 mg·L-1)对花粉萌发和花粉管生长有抑制作用,抑制程度随浓度的增大而加强。
关键词： 石榴    花粉萌发    植物生长调节物质    
Biological Characteristics of Pollen Germination of ‘Taishanhong’ Pomegranate
Yang Shangshang1, 2, Yuan Zhaohe1, Li Yun1, Li Qin1, Yin Yanlei1, Feng Lijuan1, Zhao Xueqing1     
1. Shandong Institute of Pomology Tai'an 271000;
2. College of Forestry, Shandong Agricultural University Tai'an 271018
Abstract: The cultivar, ‘Taishanhong’, of pomegranate (Punica granatum) was used as experimental materials to investigate the course of flowering and pollen germination to find the optimal culture conditions of pollen germination and to study the effects of plant growth regulators on pollen germination and pollen tube growth. The results showed that there were three morphological phases during flowering periods. The anther released pollens the next day from 8:00 to 17:00 (22-30 ℃,relative humidity 25%-40%) when flowers were completely open. The pollen dispersion period usually took 1-2 days. The optimal culture conditions of pollen germination were with 10% sucrose,0.005% H3BO3 and pH 7.0. The time of pollen germination was 3 h. Low concentration 6-BA (1-10 mg·L-1) and 2,4-D (1-5 mg·L-1) promoted the pollen germination and tube growth. However, high concentrations of the hormones expressed inhibition effects on the pollen germination and tube growth. The optimal concentration for pollen germination pollen and tube growth was 10 mg·L-1(6-BA) and 5 mg·L-1(2,4-D). In the contrast, NAA (1-30 mg·L-1) and PP333(50-800 mg·L-1) had some inhibitory effects on the pollen germination and tube growth of pomegranate. The inhibitory effects strengthened with concentration increasing.
Key words: Punica granatum    pollen germination    plant growth regulators    

石榴(Punica granatum)为石榴科(Punicaceae)石榴属(Punica)落叶果树或小乔木，原产于伊朗和阿富汗等中亚地区，至西汉张骞出使西域引入我国(Yuan et al.，2007)，已有2 000多年的栽培历史。石榴果实外形独特，色彩绚丽，果皮内百籽同房，籽粒晶莹，营养价值很高;根、皮、籽等富含黄酮、鞣质、生物碱、甾类等，均可入药，具有重要的医用价值和保健功能(Mirdehghan et al.，2007;Basu et al.，2009;Holland et al.，2009);石榴初春新叶红嫩，入夏繁花似锦，仲秋硕果高挂，深冬铁干虬枝，是优良的园林观赏树种，也是制作盆景的优良材料(巩雪梅等，2004)。

花粉生活力是指花粉具有存活、生长、萌发或发育的能力，花粉具有萌发活力是完成受精的必要条件，也是决定坐果率高低的前提(Kim et al.，2003)。因此，本试验采用液体培养基，研究蔗糖、硼和pH对花粉萌发的影响，旨在找出最适培养组合，为石榴杂交育种提供依据。

石榴在开花时期如遇低温、阴雨等不良气候条件会影响授粉而降低产量。生产上为促进坐果，提高产量常采用液体喷授方法，并在溶液中添加促进花粉萌发和花粉管生长的物质，如硼酸、蔗糖以及一些植物生长调节物质(薛晓敏等，2008)。前人研究表明，赤霉素、三十烷醇、吲哚乙酸和2，4-D在低浓度时能促进梨(Pyrus serotina)花粉萌发和花粉管生长，超过一定浓度时则起抑制作用，奈乙酸对花粉萌发和花粉管生长有抑制作用(张绍铃等，2003)。Vitagliano等(1989)和Viti等(1990)研究认为，低浓度的赤霉素对花粉萌发和花粉管生长没有影响，超过50 mg·L-1时起抑制作用。目前植物生长调节物质在石榴上研究较少，本文研究了几种植物生长调节物质对石榴花粉萌发和花粉管生长的影响，为石榴授粉中合理使用生长调节剂提供理论依据。

花粉萌发特性在黄牡丹(Paeonia lutea)(李宗艳等，2004)、果梅(Prunus mume)(杜玉虎等，2006)、凯特杏(Prunus armeniaca cv. Katy)(黄家兴等，2008)上已有相关报道，但在石榴上还未见报道。观察石榴开花和花粉萌发进程、确定花粉萌发最佳培养基，研究不同生长调节剂对花粉萌发和花粉管生长的影响，探明‘泰山红’石榴花粉的萌发特性，从而为人工辅助授粉、育种等实践工作以及种质资源保存、建立花粉基因库等提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

以石榴‘泰山红’为试材，试验地点在山东省果树研究所石榴种质资源圃进行。

1.2 方法 1.2.1 石榴开花动态特征观察

在花期选择花苞未开裂的花朵观察开花动态。随机挂牌标记长势均匀、即将开花的花蕾20个，每天观察1次，直到单花开放后每隔2 h观察1次，记录花朵的开放进程，直到花药全部落去(Lansac et al.，1994)。雄蕊特征观察包括花丝及花药2部分。每次观测时记录雄蕊数目、形状、颜色及雄蕊伸展的时空动态变化特征，同时，测定大气温度和湿度。选择盛花期完全开放、花丝完全伸长、空间分布均一的单花测量花丝长度。用镊子从花丝基部将花丝取下并去除花药，快速用游标卡尺测量各个花丝长度。

1.2.2 花粉萌发培养基优化

在石榴种质资源圃中分别采集的花药置于PC管中，在自然条件下阴干，直至散粉，立即收集花粉。花粉培养为液体培养，以蔗糖和硼酸不同用量、不同pH值为参选因素，采用正交试验设计L9(33)，以花粉萌发率为测定指标，筛选出最佳培养基。每个组合3个重复。

1.2.3 花粉培养观察

筛选出最佳培养基后，将花粉均匀撒在培养基上，培养0.5，1，2，3，4，5 h后进行显微镜和扫描电镜观察，并拍照。

普通显微镜观察:用吸管吸出少量的样本，制成5～6个临时装片，放入冰箱快速冷冻，再依次化冻观察，以避免多个样本因观测时间延长造成花粉培养时间不等的影响(张颖等，2005)。然后在显微镜下观测，每张装片选3～4个花粉分散较均匀的视野并拍照，以花粉管长度超过花粉直径作为萌发标准，花粉管长度用测微尺测量(Danfni et al.，2000)，统计花粉萌发率(萌发率%=已萌发的花粉粒数目/花粉粒总数×100)。

扫描电镜观察:将各个时间段的处理，先在2.5%戊二醛固定液中固定，真空泵抽气至样品沉淀，在0～4 ℃下固定6 h，用0.1 mol·L-1的PBS溶液漂洗3次(每次10 min)，再分别用30%，50%，70%，85%，95%的乙醇各浸泡30 min，后用无水乙醇和乙酸异戊酯各浸泡2次，第1次40 min，第2次10 h;把浸泡的材料，分别放在CO2临界点干燥仪中干燥2 h，干燥后的花粉均匀地粘在样品台上，真空喷金镀膜后用日立S-570扫描电镜观察并拍照。

1.2.4 植物生长调节剂对花粉培养的影响

在基本培养基中分别添加如下质量浓度的植物生长调节物质。6-BA: 1，5，10，20，30，40 mg·L-1;2，4-D:1，5，10，20，30，40 mg·L-1;NAA: 0.5，1，5，10，20，30 mg·L-1;多效唑: 50，100，200，400，600，800 mg·L-1。配制液体培养基，以基本培养基作为空白对照。在普通显微镜观察花粉萌发率和花粉管长度。

1.2.5 数据统计分析

用Microsoft Excel 2000进行数据管理;用DPS 9.5数据统计软件，新复极差法对数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析 2.1 石榴开花动态和雄蕊的形态特征

石榴‘泰山红’在山东泰安花期一般在5月中下旬至6月中旬，初花期为5月10日左右，盛花期为5月25日左右，末花期为6月15日左右。石榴花为子房下位，萼筒与子房连生，具6枚红色萼片，花瓣红色，6片。石榴花包括两性花(图 1A，B)和不完全花(图 1G，H);当花朵完全开放时，两性花的柱头约为1.53 cm，高于周围的花药(图 1B)，不完全花的柱头约0.75 cm，低于周围的花药(图 1H)。雄蕊数量不固定，约260～300枚;花丝长度为0.2～0.7 cm，颜色为红色。

图 1 石榴花朵的形态 Fig. 1 Pomegranate flowers 标尺Bar: B-F=10 mm;H-L=10 mm.
A.两性花完全开放时的花朵形态;B.两性花纵切观察;C.两性花的花蕾时期;D.两性花萼片开裂，花瓣未展开;E.两性花花瓣展开;F.两性花花瓣凋落，开始坐果。G.不完全
花完全开放时的花朵形态;H.不完全花纵切观察;I.不完全花的花蕾时期;J.不完全花萼片开裂，花瓣未展开;K.不完全花花瓣展开;L.不完全花花瓣凋落，花朵开败。
Pomegranate flowersA. Morphological of fully open bisexual flower;B. Longitudinal section of a bisexual flower;C. Closed bud period of bisexualflower;
D. Dehiscent sepals and unopened petal of bisexual flower;E. Fully opened petals of bisexual flower;F. Witheredbisexual flower.
G. Morphological of fully open functionally male flower;H. Longitudinal section of a functionally male flower;I.Closed bud period of functionally male flower;J. Dehiscent sepals and unopened
petal of functionally male flower;K. Fully openedpetals of functionally male flower;L. Withered functionally male flower.

石榴‘泰山红’从开花到萎焉经历3个形态变化时期: 1)从花蕾以绿豆大小开始直至萼片刚开裂(图 1C，I)，此阶段经历8～12天;随着花蕾的膨大，雄蕊的数量也不断增多，花药呈现白色。2)萼片开裂，直至花瓣完全展开(图 1D，J)，此阶段经历2～3天;花药呈淡黄色，未散粉。3)花瓣完全展开(图 1E，K)，直至完全凋落(图 1L)或坐果(图 1F )，此阶段经历2～3天;花药开始散粉，随花朵开败，花粉散尽，花药呈黑色，花丝萎焉，两性花如果授粉成功便能坐果，不完全花则凋落。

据观察，‘泰山红’石榴花一般在花瓣展开的第2天散粉，当天不散粉。散粉集中在8:00—17:00(22～30 ℃，空气相对湿度25%～40%)，花药从散粉开始到完毕一般需要1～2天。

2.2 石榴花粉萌发最佳培养基

为寻求蔗糖、硼酸和pH的最佳组合，进行正交L9(33)试验设计(表 1)。由表 1可知，不同处理之间花粉萌发率差异较大(16.59%～54.42%)，处理4和6的花粉萌发率较高，差异不显著，其中处理4的花粉萌发率最高，为54.42%。极差分析表明，对‘泰山红’石榴花粉萌发的影响为:蔗糖＞pH＞硼酸。根据T值，确定最佳的培养条件为: 10%蔗糖，0.005%硼酸，pH值7.0。

表 1 花粉培养正交试验设计方案与试验结果直观分析① Tab.1 Test design and visual analysis of pollen germination by orthogonal experiment
2.3 石榴花粉萌发动态

通过光学显微镜和扫描电镜观察‘泰山红’石榴花粉离体萌发动态。当培养到0.5 h时，花粉粒已经吸水膨大，花粉管已经伸出，花粉管长度35.23 μm(图 2A;图 3A)，此时花粉萌发率为23.51%。当培养1 h时(图 2B;图 3B)，花粉管长度为95.18 μm，花粉萌发率达到43.62%。当培养2 h时(图 2C;图 3C)，花粉管长度为177.13 μm，花粉萌发率达到48.43%。当培养到3 h时(图 2D;图 3D)，花粉管长度为289.15 μm，花粉萌发率达到54.03%，此阶段属于快速萌发阶段，花粉管长度和花粉萌发率显著提高。当培养4 h时(图 2E;图 3E)，花粉管长度为310.14 μm，花粉萌发率达到56.55%。当培养5 h时(图 2F;图 3F)，花粉管长度为318.63 μm，花粉萌发率达到57.35%。在4 ～5 h时，花粉萌发率趋于平缓，花粉管长度增加不显著，花粉管的生长状况良好。

图 2 不同培养时间石榴花粉萌发显微镜观察 Fig. 2 Observation of pollen germination process in different culture time by microscope 标尺Bar: 50 μm.
A-F.分别为培养0.5，1，2，3，4，5 h时的花粉形态
Pollen morphology when culture time was 0.5，1，2，3，4，5 h，respectively.
图 3 不同培养时间石榴花粉萌发电镜扫描观察 Fig. 3 Observation of pollen germination process in different culture time by SEM(Scanning Electron Microscope) A-F.分别为培养0.5，1，2，3，4，5 h时的花粉形态
Pollen morphology when culture time was 0.5，1，2，3，4，5 h，respectively.
2.4 不同植物生长调节物质对石榴花粉萌发和花粉管生长的影响 2.4.1 6-BA对花粉萌发和花粉管生长的影响

由表 2可知，6-BA在1～10 mg·L-1时对石榴花粉萌发和花粉管生长有促进作用，但超过此浓度范围时，花粉萌发和花粉管生长随着6-BA浓度的增加而减小。当浓度在10 mg·L-1时，花粉萌发率最高，为61.83%，与对照差异显著;花粉管长度最大，为343.92 μm，与对照差异显著。因此，10 mg·L-1的6-BA对石榴花粉萌发和花粉管生长有最佳的促进作用。

表 2 6-BA对花粉萌发和花粉管长度的影响 Tab.2 Effects of 6-BA on pollen germination and tube length of pomegranate
2.4.2 2，4-D对花粉萌发和花粉管生长的影响

由表 3可知，2，4-D在1～5 mg·L-1对花粉萌发和花粉管生长有促进作用，但超过此浓度范围时，花粉萌发和花粉管生长随着2，4-D浓度的增加而减小。当浓度为5 mg·L-1时，花粉萌发率最大，为60.13%，与对照差异显著;花粉管长度最大，为335.89 μm，与对照差异显著。因此，5 mg·L-1的2，4-D对石榴花粉萌发和花粉管生长有最强的促进作用。

表 3 2，4-D对花粉萌发和花粉管长度的影响 Tab.3 Effects of 2，4-D on pollen germination and tube length of pomegranate
2.4.3 NAA对花粉萌发和花粉管生长的影响

由表 4可知，NAA对花粉萌发和花粉管生长有抑制作用，抑制程度随着浓度的增加而增强。浓度在1 ～30 mg·L-1时，NAA对花粉萌发率和花粉管生长始终有抑制作用，在各个浓度时都与对照有显著性差异。当浓度为30 mg·L-1时，抑制作用最强，花粉萌发率最低，花粉管长度最短。

表 4 NAA对花粉萌发和花粉管长度的影响 Tab.4 Effects of NAA on pollen germination and tube length of pomegranate
2.4.4 多效唑对花粉萌发和花粉管生长的影响

由表 5可知，多效唑对花粉萌发和花粉管生长起抑制作用，抑制程度随浓度的增加而增强。浓度在50～800 mg·L-1时，多效唑对花粉萌发率和花粉管长度都有抑制作用;在800 mg·L-1时，抑制作用最强，萌发率仅为20.17%，花粉管长度仅为102.72 μm。

表 5 多效唑对花粉萌发和花粉管长度的影响 Tab.5 Effects of PP333 on pollen germination and tube length of pomegranate
3 讨论

郭爱(2009)把蓝果忍冬(Lonicera caerulea)花朵开放分为6个时期，在开花后8～28 h内开始散粉，完全散尽需要2～3天。林辰壹等(2012)对新疆的高葶韭(Allium obliquum)的开花动态进行观察，从花被片展开到闭合经历5个形态变化时期，花粉完全散尽一般需要10～12 h，单花开放需4～5天。本试验对石榴‘泰山红’开花动态的观察表明:石榴从开花到萎焉经历3个时期的形态变化，单花开放一般经历12～18天，散粉在花朵完全开放后的第2天，集中散粉在8: 00—17: 00。根据此观察结果，可确定石榴花粉的采集时间以及授粉时间，从而提高杂交授粉的效率。

蔗糖是花粉粒萌发及花粉管壁合成的主要营养物质，又是参与花粉代谢与跨膜运输的碳源，在培养过程中不断被消耗以保持培养基的物理、化学稳定性(Fei et al.，2003)。在正交试验设计中，蔗糖浓度对花粉萌发有显著影响，当浓度为10%时，花粉管生长健壮，花粉内外渗透压平衡，随着蔗糖浓度的增大，维持了花粉的正常生活力。当蔗糖浓度为15%时，花粉萌发率显著降低，因而高浓度的蔗糖对花粉萌发有抑制作用，这与小麦(Triticum aestivum)(朱展望等，2007)、百合(Lilium)(年玉欣等，2005)上的研究结果一致。硼酸在花粉萌发中的主要作用是可以增加糖的吸收、运转和代谢，促进构成花粉管壁的成分果胶物的合成(田翠婷等，2007)。硼与糖的结合，能极大提高供试百合花粉的萌发率(年玉欣等，2005)。本试验中，硼酸对花粉萌发的最适浓度为0.01%。pH对不同植物的花粉萌发影响不同。梨花粉萌发的适宜pH 6.5(张绍铃等，2005);凯特杏花粉萌发的最适pH 6.0(黄家兴等，2008)。本试验中石榴花粉萌发的pH 7.0。因此，石榴花粉离体培养的最佳培养条件为: 10%蔗糖，0.01%硼酸，pH7.0。

植物花粉的活力因物种不同及环境条件不同而有差异。同样条件下，银杏(Ginkgo biloba)花粉在无菌培养基上的发芽时间长达6～7天，苹果(Maluspumila)花粉接种后4 h发芽率达3%，而桃(Amygdalus persica)花粉接种后12 h发芽率达100%(孙霞等，1998);枣(Ziziphus jujuba)的花粉发芽动态试验表明，培养5.5 h花粉发芽率不再变化，7.5 h花粉管停止生长(韩斌等，2008)。石榴花粉萌发时间与其他植物明显不同，培养0.5 h时，花粉萌发率23.51%，萌发管长度达35.32 μm，培养3 h时花粉萌发率和萌发管长度基本达到最大值，之后生长缓慢。较其他植物而言，石榴花粉的萌发时间较短，仅3 h。

关于植物生长调节剂对不同植物花粉离体萌发的影响报道不一。李晓林(2005)认为IBA、2，4-D对桃花粉萌发和花粉管生长有促进作用;符碧(2001)对荔枝(Litchi chinensis)花粉萌发和生长的研究结果表明NAA低浓度时起促进作用，超过一定浓度起抑制作用;薛晓敏等(2008)认为NAA和多效唑对桃花粉萌发有抑制作用，抑制程度随浓度的增大而增强，但在适宜浓度范围内对花粉管生长却有促进作用。本研究发现，较低浓度的6-BA(1～10mg·L-1)、2，4-D(1～5 mg·L-1)能促进石榴花粉萌发和花粉管生长，但超过此浓度范围时起抑制作用;而NAA和多效唑对花粉萌发和花粉管生长有抑制作用，抑制程度随浓度的增大而增强。因此，在实际生产中，可利用1～10 mg·L-1的6-BA、1～5 mg·L-1的2，4-D促进花粉萌发，提高坐果率，提高产量。目前有关生长调节物质对花粉萌发和花粉管生长的作用机制尚不清楚，但有研究表明，花粉自身含有生长激素类物质，这些物质的多少对花粉自身的萌发、生长及储藏有较大的影响。多效唑是生长延缓剂，对花粉萌发和花粉管生长有抑制作用，抑制程度随浓度的增大而增强，这与对植物生长发育的作用表现出相同的规律。由这些不同现象可以认为植物的花粉萌发和花粉管生长是一个极其复杂的生理代谢过程，不仅受生长调节物质的影响，而且有许多酶参与(Lush et al.，1997)，不同种类的生长调节物质，由于其起作用的浓度、作用方式及时间等均存在一定的差异，因而产生不同的效果。

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