转录因子是真核生物基因表达调控的重要组成部分，它们与靶基因上游特定的DNA序列片段结合，激活或抑制靶基因转录活性，从而调控靶基因的特异时空表达(Xiong et al.，2005)。作为植物特有的一类转录因子，SBP基因首先是在金鱼草(Antirrhinum majus)中发现和确认的，因其能识别并结合MAD-box基因SQUAMOSA(SQUA)启动子而被命名为Squamosa promoter binding protein(SBP)(Klein et al.，1996)。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他植物中均发现存在SBP 基因家族成员，其基因内部存在一个高度保守的DNA 结合域，被称为SBP domain，由于这些基因能编码类似SBP蛋白，将它们称为类SBP(SQUAMOSA promoter binding-like，SPL)基因(Cardon et al.，1999; Stone et al.，2005; Yamasaki et al.，2006)。已有的研究表明，SPL基因家族在植物中参与了如开花时间的调节、种子的萌发、胚胎的发育、产量的形成等不同的发育过程(Miura et al.，2010; Schwarz et al.，2008;Wang et al.，2009; Yu et al.，2010)。例如，拟南芥SPL3编码的蛋白能够识别花分生组织特征基因AP1(SQUA的同源基因)的启动子，调控AP1的表达，从而控制成花的过程; 且其在拟南芥中的过量表达会引起提前开花，因而被认为是调控开花的重要因子(Cardon et al.，1997; 代法国等，2010)。在水稻( Oryza sativa)中，OsSPL14能够促进花序的分枝、控制植株形态，且其在‘日本晴’中的过量表达提高了水稻的产量(Miura et al.，2010; Jiao et al.，2010)。同样地，在林木中也发现SPL基因可能与成花和花的发育相关。如白桦(Betula platyphylla)BpSPL1蛋白能特异结合BpMADS5启动子，被认为参与调节花发育(Lännenpää et al.，2004); 枳(Poncirus trifoliata)的2个转录因子SPL9和SPL13可能对茎和果实的发育有调控作用(宋长年等，2010)。同时，该基因家族的很多成员是microRNA156(miR156)的靶基因，其基因序列上具有miR156的识别靶序列，其表达受miR156的调控(Nonogaki，2010; Wang et al.，2011; Gou et al.，2011)。miR156介导的SPLs基因表达也被认为是调控植物开花的内源性途径(Wang et al.，2009)。如在拟南芥SPL3，SPL4和SPL5中存在miR156的调控位点，研究人员通过减少miR156的含量，结果导致SPL3表达增强和植株提前开花，表明miR156通过调控SPL3的表达来实现幼年期到成年期的转变(Wu et al.，2006; Fornara et al.，2009; Wang et al.，2009)。在水稻中，OsSPL14也直接受到OsmiR156的调控，来控制花序的分枝和植株形态，从而影响水稻的产量(Jiao et al.，2010)。

光皮桦(Betula luminifera)又名亮叶桦，为桦木科(Betulaceae)桦木属(Betula)落叶乔木，属我国特有速生树种，主要分布于秦岭和长江流域以南至两广北部及西部，其材质优良，纹理细致，木材坚硬，是高级实木家具、高级胶合板和实木地板等的优良材料，也是近年来我国南方部分地区大力发展的重要用材树种(郑万钧，1985; 胡晓媛等，2006)。本课题组前期对全分布区的光皮桦天然种群进行了调查和种质收集，发现在天然种群中存在丰富的遗传变异，来自不同种源的种质在材性、叶形、花期等性状上存在显著差异(陈奕良等，2009; 张俊红等，2010)。这些变异丰富的材料为研究相关基因的SNPs(single nucleotide polymorphisms)变异与关联分析提供了优良材料和重要基础。SNPs作为基因组中最丰富的多态性位点，已经成为遗传作图、关联分析、多样性分析以及图位克隆的重要工具(Rafalski，2010)。基于候选基因SNPs 的关联遗传分析已成为揭示林木基因型与表型内在联系的重要手段，逐渐应用于林木的分子辅助育种研究(王荣焕等，2007; Thumma et al.，2005; González-Martínez et al.，2007)。因此，本研究以具有丰富变异的光皮桦为材料，分离克隆了与成花相关的BlSPL1基因，并对其进行了表达、SNP以及连锁不平衡(LD)分析，为在光皮桦中开展基于BlSPL1基因的连锁不平衡作图和辅助育种提供科学依据。

用于基因克隆的材料为5年生光皮桦无性系植株; 用于基因表达分析的材料为6年生光皮桦无性系植株上的芽及不同发育时期的雌花和雄花(1月中旬至3月底); 用于SNP分析的材料为来自黄山东部(浙江临安和安徽黄山)、武夷山东部(福建武夷山和温州)、四川、贵州、广西光皮桦天然分布区的57个无性系(6年生)。所有无性系均种植于浙江农林大学良种繁育中心苗圃内。

基因组DNA 的提取按改良的CTAB法(谢一青等，2006)。

总RNA的提取采用Trizol法，cDNA合成采用PrimeScript^® RT reagent Kit(TaKaRa)，均按照试剂盒说明书进行。

依据已测序的光皮桦转录组序列设计特异引物5'-GSP1(表 1)进行5'-RACE，RACE具体步骤按SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(ClonTech)说明书进行。根据克隆获得的全长序列，设计引物51F和51R(表 1)，用于全长cDNA和相应基因组DNA 序列的克隆。PCR扩增程序为: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，扩增35个循环; 72 ℃延伸5 min。克隆所用T载体为pGEM-T Easy Vector(Promega)，测序由南京金斯瑞生物科技公司完成。

表 1 用于基因克隆和表达分析的引物 Tab.1 Primers used for gene cloning and expression analysis

表 1 用于基因克隆和表达分析的引物 Tab.1 Primers used for gene cloning and expression analysis 引物名称Primer name 序列Sequence( 5'—3') 5'GSP1 CGAGGGGTTCTGGCTGAGGCTTCC 51F TGGAAGTCTCTGCTACTCCCCTGC 51R ACATCACAGGGCGGAAACCATAGT 51F433 CGGGTTGATAAGGTGTGTGGA 51R2098 TGCACATCCTACTTCAGAGCTGA 51F2608 TGTTGAGAAGAGCACCAAAAGACT 51QF CTCGGTTTCACCCACATAGCTCA 51QR TGATCCATCAGACCCCATGTGA ACTQF GCCAACAGAGAAAAGATGACTC ACTQR TCACCAGAATCCAGCACAATAC

利用NucleicTools(http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz-page+applSelect)分析推测BlSPL1基因编码蛋白的氨基酸组成。用ProtParam tool(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)工具推测分子量和等电点(pI)。利用蛋白质保守结构域推测工具InterProScan(http://ebi.ac.uk/Tools./InterProScan/)分析其结构域。采用Vector NTI 11.0进行多序列比对。

基于拟南芥、水稻、毛果杨(Populus trichocarpa)、小立碗藓(Physcomitrella patens)、番茄(Solanumlycopersicum)、衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的SPL蛋白中SBP-domain区氨基酸序列(76 aa)，采用MEGA4.0软件(邻接法)进行多序列比较，对光皮桦BlSPL1进行系统进化分析(Tamura et al.，2007)，所用序列来自数据库PlnTFDB(v3.0)(http://plntfdb.bio.unipotsdam.de/v3.0/)、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、Plant TFDB(http://planttfdb.cbi.edu.cn)。具体的基因名和序列号参考Salinas等(2011)的报道。

Real time PCR按照SYBR^® PREMIX EX TAQTMII(TAKARA)试剂盒说明进行，其扩增反应程序为:95 ℃ 5 min; 95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环。定量引物为51QF和51QR，内参基因Actin的引物为ActinQF和ActinQR(表 1)，采用相对定量分析基因表达。

鉴于BlSPL1基因组序列较长，为便于克隆和测序，将其分成A和B 2段进行克隆、SNP搜寻与分析，其中A片段包含5'-UTR部分序列和第1、2个外显子及第1个内含子、第2个内含子部分序列共1 665 bp，B片段包括第2个内含子部分序列、第3个外显子(含miR156靶位点)以及3'-UTR共846bp。引物51F433和51R2098用于A片段的克隆，51F2608和51R用于B片段的克隆(图 2)。以57个不同种源的无性系植株基因组DNA为模板，采用高保真Pfu酶(北京全式金)进行PCR 扩增，PCR扩增产物回收后采用pEASY-Blunt cloning Kit进行克隆，挑取阳性克隆进行序列测定，每个样本至少挑3个克隆进行测序。利用DnaSP5.0软件(Librado et al.，2009)对序列进行分析，搜寻SNP位点、计算SNP频率及多样性指数; 分析同义突变、错义突变和无义突变情况; 分析LD在光皮桦不同群体BlSPL1基因中的延伸模式。

	图 1 BlSPL1与其他植物SPL蛋白质的同源比对 Fig. 1 Sequence alignment of BlSPL1 and related SPL from different plants MdSPL1( ADL36824.1): 苹果Malus × domestica; PpSPL1 ( EMJ10405): 桃Prunus persica; PtSPL1( XP_002322273.1 ) : 毛果杨 Populus trichocarpa; AtSPL13( NP_568731.1): 拟南芥Arabidopsis thaliana.=: miR156 靶位点编码的多肽The conserved peptide encoded by the miR156 target site.

	图 2 光皮桦BlSPL1基因的结构示意 Fig. 2 Schematic structure of the BlSPL1 图由DNA 2. 0 公司的软件Gene Designer(Alan et al.，2006)绘制. Graphic was made by means of Gene Designer by DNA 2. 0 Inc.(Alan et al.，2006). A，B: SNP 分析区域SNP analysis region; Ⅰ: 外显子1 Exon 1; Ⅱ: 外显子2 Exon 2;Ⅲ: 外显子3 Exon 3.

基于光皮桦转录组序列，利用RACE技术，克隆获得了BlSPL1基因。序列分析结果表明，该基因cDNA序列全长1 825 bp，分别包含486 bp的5'-UTR，169 bp的3'-UTR，以及长为1 170 bp开放阅读框，其编码389个氨基酸。用ProtParam tool估算推导的蛋白质的分子量约为42.37 kDa，其等电点为8.43。同源分析表明，BlSPL1(KC110080)与桃(Prunus persica)PpSPL1(EMJ10405)、苹果(Malus×domestica)MdSPL1(ADL36824.1)的序列同源性最高，分别达到67%和60%(图 1)。同时，为进行后续的SNP分析，根据cDNA序列克隆了其对应的基因组DNA序列。结果表明BlSPL1的基因组序列全长3 457 bp，包含2个内含子和3个外显子，第1个内含子长1 005 bp，第2个内含子为624 bp，3个外显子分别长416 bp，134 bp，620 bp，在第3个外显子处含有miR156靶位点(图 2)。

进一步的蛋白结构域分析表明，BlSPL1在蛋白质的第92—170氨基酸残基位置上含有该基因家族所特有SBP 结构域，此结构域包含2个锌指结构，其中N端锌指结构(Zn-1)为Cys3His，C端锌指结构(Zn-2)为Cys2HisCys，另外在该结构域的C端第150—167位置上含有核定位信号(Nuclear Localization Signal，NLS)(图 1)，这与相关报道(Birkenbihl et al.，2005; Yang et al.，2008b)相符。为分析BlSPL1基因的系统进化关系，参照Salinas等(2011)构建了SBP-box基因家族系统发育进化树。由图 3可见，陆地植物SPL蛋白分化为8个分支，即group Ⅰ-Ⅷ，而BlSPL1属于group Ⅶ这一分支，与来自水稻、拟南芥和杨树的相关SPL蛋白同属一个分支，且与杨树的PtSBP20亲缘关系最近。

	图 3 光皮桦BlSPL1蛋白的系统进化分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of BlSPL1 and SPL protein from related plant species

SPL基因在植物成花过程中被认为是比较上游的调控因子(Hwan et al.，2012)。因此，本研究采用定量PCR对BlSPL1基因在光皮桦芽、雌花、雄花以及幼苗早期不同发育阶段的表达情况进行了分析。由图 4可见，BlSPL1基因在光皮桦的芽、雌花、雄花、幼苗中均有表达，但在雄花和幼苗中的表达水平较低，而在芽发育成雌花的过程中其表达逐渐升高(图 4B1-B3)，在雌花明显可见时(图 4F1)表达量达到最高，其后表达量又逐渐降低(图 4F2-F3)。从这些结果可以初步推测BlSPL1可能在芽发育为雌花的过程中起调控作用。

图 4 BlSPL1基因在不同器官和不同发育时期组织中的表达分析 Fig. 4 Expression analysis of BlSPL1 in different organs and tissues from different development stages 上图为光皮桦不同器官在不同发育阶段的示意(Bar=1 cm) ，下图为BlSPL1在对应材料中的表达情况。 The top of figure represents the different developmental phases of different organs in Betula luminifera(Bar=1 cm) ; The bottom of figure shows the expression patterns of BlSPL1 in the corresponding materials. B1-B3: 芽的不同发育阶段The different developmental phase of bud; F1-F3: 早期雌花的不同发育阶段The different developmental phase of early female flower; M1-M3: 雄花的不同阶段The different developmental phase of male flower; S1，S2: 苗的不同发育时期The different developmental phase of young plants.

分析基因在自然群体中的SNP多样性是进行连锁不平衡作图的基础，同时也可获知该基因在种内演化过程中是否遭受自然选择的影响。以来自主要天然分布区57株不同基因型的光皮桦个体为材料，克隆BlSPL1基因片段进行SNP位点搜寻和分析。结果显示，在检测的光皮桦不同基因型中，BlSPL1基因内存在3次缺失、3次插入及98个SNPs(含1个位于非编码区的三态SNP位点)(表 2)。插入和缺失长度在1～3 bp之间，其中编码区有一长度为3 bp的插入，未导致编码区的移码突变，其余均发生在非编码区。BlSPL1基因内SNP发生的平均频率为1/26 bp，在5'-UTR、外显子、内含子、3'-UTR分别检测到了2、28、61、7个SNPs，其出现频率为内含子＞3'-UTR＞5'-UTR＞外显子。由SNP在BlSPL1基因内部出现的频率可知，该基因不同区域的保守性不同，而在编码区核苷酸变异程度最低，显示了该基因在进化过程中编码区受到了较强的选择压。进一步对检测到的97个SNPs进行了变异类型统计(表 3)。结果显示，在这些SNPs中，有57个属于转换类型，分别包含29个A$ \Leftrightarrow $G和28个T$ \Leftrightarrow $C。对于颠换类型，共检测到40个，分别是14个A$ \Leftrightarrow $C、7个T$ \Leftrightarrow $G、11个A$ \Leftrightarrow $T和8个G$ \Leftrightarrow $C，转换/颠换= 1.43(表 3)。

表 2 在BlSPL1基因组不同区域检测到的SNP 数量及其频率 Tab.2 Number and frequency of SNPs detected in different regions of BlSPL1

表 2 在BlSPL1基因组不同区域检测到的SNP 数量及其频率 Tab.2 Number and frequency of SNPs detected in different regions of BlSPL1 BlSPL1 总数Total 5'非翻译区5'-UTR 外显子Exon 内含子Intron 3'非翻译区3'-UTR 序列长度Gene length/bp 2 511 54 1 170 1 118 169 SNP 数量SNP number 98 2 28 61 7 SNP 频率SNP frequency /bp-1 26 27 42 18 24

表 3 BlSPL1基因内部SNP 替代类型 Tab.3 The substitution types of SNPs for BlSPL1

表 3 BlSPL1基因内部SNP 替代类型 Tab.3 The substitution types of SNPs for BlSPL1 基因Gene 二态SNP 数量Quantity of dimorphic SNPs 替代类型Substitution types 转换Transitions 颠换Transversions A$ \Leftrightarrow $G T$ \Leftrightarrow $C A$ \Leftrightarrow $C T$ \Leftrightarrow $G A$ \Leftrightarrow $T G$ \Leftrightarrow $C BlSPL1 97 29 28 14 7 11 8

为检测BlSPL1编码区SNPs是否引起其编码氨基酸的改变，对编码区内的28个SNPs进行了同义突变、错义突变、无义突变分析。在BlSPL1编码区内的28个SNPs中，11个属于同义突变，17个为错义突变。其在SBP domain区域内发生了2次同义突变和0次错义突变，而在SBP domain外的编码区发生了9次同义突变和17次错义突变，如位于编码区的第172和第1974位置上分别发生了第1位和第2位密码子的改变，由AGA突变为GGA，GCA突变为GAA，从而分别导致其编码的氨基酸由精氨酸(Arg)变成甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)变成谷氨酸(Glu)。可知SBP domain编码区内无错义突变，而SBP domain以外编码区错义突变频率为1/18aa; 又基因的第3个外显子内错义突变达15个，而其区域内的miR156靶位点(图 2)没有核苷酸突变位点出现(表 4)。由以上可知SBP domain和miR156靶位点有很强的保守性。

表 4 BlSPL1编码区内SNP的突变类型 Tab.4 Mutation types of SNPs located in coding region in BlSPL1

表 4 BlSPL1编码区内SNP的突变类型 Tab.4 Mutation types of SNPs located in coding region in BlSPL1 基因Gene 编码区长度Length of codingregion /bp 编码氨基酸数Quantity of amino acids encoded 同义突变Synonymous mutation 错义突变Missense mutation SBP 结构域SBP domain SBP 结构域外( miR156)Outside of SBP domain ( miR156) SBP 结构域SBP domain SBP 结构域外( miR156)Outside of SBP domain ( miR156) BlSPL1 1 170 389 2 9( 0) 0 17( 0)

为了检测BlSPL1基因在光皮桦不同群体内核苷酸变异及群体分化程度，利用DnaSP5.0软件对5个群体分别进行了多态性位点数、单核苷酸多样性、Tajima’s D^*和Fu and Li’s D^*(Tajima，1989; Fu et al.，1993)的中性检验(表 6)。对于检测到的SNP多样性指数π_tot、π_sil、π_s、π_n均有差异，但差异不显著，说明BlSPL1在群体间的分化程度并未达到显著水平。Tajima’s D^*和Fu and Li’s D^*中性检验结果表明，D^*均为负值，这显示了在光皮桦群体内，BlSPL1 基因在进化过程中存在过剩的稀有SNPs，特别是广西群体内存在较多的低频率SNPs。而5个群体，均为π_n＜π_s，即非同义突变与同义突变的比率＜1，显示出在光皮桦物种演化过程中，纯化选择是BlSPL1基因内同义SNP位点的主要筛选压。

表 6 BlSPL1基因在不同群体内的核苷酸变异^① Tab.6 Summary of nucleotide variation in 6 populations for BlSPL1

表 6 BlSPL1基因在不同群体内的核苷酸变异① Tab.6 Summary of nucleotide variation in 6 populations for BlSPL1 群体Population 个体数n 位点数s πtot πsil πs πn Tajima’s D* Fu and Li’s D* ①n: 测序的样本数Number of sequences sampled; s: 分离的位点数Number of segregating sites; πtot: 整个基因区域单核苷酸多样性Average nucleotide diversity in full gene; πsil: 非编码区和内含子区域的单核苷酸多样性Average nucleotide diversity in un-translated region and introns; πs: 编码区同义突变单核苷酸多样性Average nucleotide diversity of synonymous mutation; πn: 编码区内非同义突变多样性Average nucleotide diversity of non-synonymous mutation. 黄山东部East of Huangshan 8 44 0.007 02 0.008 60 0.010 14 0.003 69 -1.488 69 -1.606 97 武夷山东部East of Wuyishan 9 46 0.006 37 0.008 22 0.008 90 0.002 83 -1.634 50 -1.925 96 四川Sichuan 12 60 0.007 08 0.010 02 0.006 07 0.003 00 -1.672 04 -2.130 97 广西Guangxi 17 59 0.006 88 0.008 88 0.007 62 0.003 68 -1.817 35 -3.318 80 贵州Guizhou 11 54 0.007 37 0.009 11 0.009 47 0.004 14 -1.604 95 -2.324 25 总和Total 57 98 0.007 12 0.009 10 0.008 45 0.003 55 -2.325 63 -6.241 49

为分析BlSPL1 基因内SNP位点间在光皮桦不同群体内连锁不平衡(linkage disequilibrium，LD)的延伸长度及程度，利用DnaSP 5.0软件中的LD程序进行分析。由图 5可知，随着BlSPL1基因核苷酸序列长度的增加，SNPs的LD程度迅速削弱，但不同群体内LD衰退程度明显不同; 当R²＜0.1，在黄山东部、武夷山东部、广西、四川、贵州群体中LD衰退序列长度分别达到1 125，838，755，563，678 bp，其中来自四川的群体LD在该基因组延伸长度最短。这一结果表明，在光皮桦不同天然群体内，BlSPL1基因内SNPs存在不同程度的连锁不平衡，但其连锁不平衡在候选基因内就已衰退。

	图 5 不同群体间BlSPL1基因内SNPs的连锁不平衡 Fig. 5 Linkage disequilibrium of SNPs in BlSPL1 from different populations

SPL基因是植物特有的一类转录因子，典型特征为其编码的氨基酸序列有一个高度保守的SBP结构域。目前的研究表明，SPL基因广泛分布于低等到高等的植物中，对植物的不同发育过程和生理反应起重要调控作用(Xie et al.，2006; Riese et al.，2007; Guo et al.，2008; Yu et al.，2012)。本研究首次从光皮桦中分离获得BlSPL1基因，序列分析表明在其第3个外显子处含有miR156靶位点，同时其编码的氨基酸具有典型的SBP-domain，包含2个典型的锌指结构(图 1)。进一步的系统进化分析表明BlSPL1属于陆地植物SPL蛋白group Ⅶ这一分支(Salinas et al.，2011)，且与杨树的PtSBP20、拟南芥AtSPL13等具有较近的亲缘关系(图 3)，基因组序列分析结果也显示BlSPL1的基因结构与这一分支的同源基因相似(图 2)(Guo et al.，2008; Salinas et al.，2011)，因此这些基因在功能上可能有一定的相似性，但目前这一分支的基因并没有深入的功能研究。同时，系统进化分析显示在每个SPL蛋白分支中都包含至少一个单子叶和双子叶植物的SPL基因(group Ⅳ除外)，这表明BlSPL1与其他高等植物的SPL基因可能具有共同的祖先，而在group Ⅶ分支中，BlSPL1与同为林木的杨树SPL基因亲缘关系最近，反映了光皮桦与杨树间的亲缘关系，同时也表明随着双子叶植物的分化，其相应的SPL基因可能也在进一步的特化。

虽然SPL基因在植物中参与不同的生长发育调控，但目前对功能的研究主要集中于其对开花过程的调控。在模式植物拟南芥中的研究说明，miR156-SPL3是调控植物成花的重要途径(Hwan et al.，2012; Kim et al.，2012)。但在林木中，SPL基因的功能和调控机制仍然不明确。由于缺乏可用转基因平台或突变体，目前对木本植物SPL基因功能的研究大多是通过表达分析来进行研究。如对枳的SPL9和SPL13进行了表达分析，发现两者在叶、茎、根、花、果等各个器官均有表达，分别在茎和幼果中表达量最高，推测它们可能分别与茎和果实的发育相关(宋长年等，2010)。BlSPL1基因的表达也具有组成性，在幼苗、芽、雄花和雌花均有表达，在雄花和幼苗中表达水平较低，但在芽发育成雌花的过程中有一个明显的表达水平上调，这些结果暗示BlSPL1与光皮桦的开花相关，且可能在雌花发育过程中起调控作用(图 4)。当然，这种组成性的表达不是木本植物特有的。如拟南芥全部SPL基因在其花分生组织和四轮花器官中均有表达，在茎、叶等营养器官中亦有表达(Yang et al.，2008a)。陆地棉(Gossypium hirsutum)GhSPL3在根、茎、叶、花、顶芽中均有表达，并且在具3片真叶的顶芽和花中表达量最高(李洁等，2012)。这说明SPL基因的组成性表达在高等植物中可能是保守的，也暗示了其功能的多样性。

由于SPL基因在成花过程中的重要调控作用，同时光皮桦群体在开花性状上存在广泛的变异，因此选择SPL基因作为候选基因，在光皮桦中研究其SNP变异，可能有助于挖掘与开花性状相关的SNP位点，以及阐明开花性状变异的内在分子机制。SNP分析表明，在光皮桦BlSPL1基因内存在丰富的SNP变异，多样性水平为0.007 12、SNP频率为1/26。在可能影响蛋白功能的编码区中存在28个SNP，在保守的SBP-domain内，存在2个SNPs，错义突变/同义突变等于零，而在SBP-domain外的编码区存在26个SNPs，其错义突变/同义突变＞1。这说明SPL基因的不同区域受到了不同的进化选择压力，SBP-domain受到较大的进化压力，是纯化选择的作用; 而除SBP-domain外的其他区域的进化压力较小，进化速率较快，受到正向选择作用(Yang et al.，2008b)。这种正向选择是基因复制后产生蛋白新功能的主要驱动力，说明SPL基因在进化中其功能在进一步分化，类似正向选择的现象在拟南芥和水稻RLK和Dof基因家族中也同样存在(Shiu et al.，2004; Yang et al.，2006)。

连锁不平衡(LD)程度可以反映性状与SNP间相关性，是进行LD作图的前提。一般认为，开展基于候选基因或全基因组LD作图，取决于LD在目标物种基因组中延伸的长度及程度，在人类、动物和植物中存在较大差异(Zhang et al.，2005)。如LD在人类中可从5 kb延伸到500 kb，这使得人类全基因组LD作图成为可能(Reich et al.，2001)。然而在植物中LD的延伸范围变异很大，自交植物如拟南芥可延伸至250 kb(Nordborg et al.，2002)，但异交植物如玉米(Zea mays)LD延伸仅在1 kb之内就已消失(Remington et al.，2001); 在松树、杨树、桉树等林木中LD延伸在1kb至几kb内迅速消失(Brown et al.，2004; Neale et al.，2004; Ingvarsson，2005; 徐煲铧等，2009)。这说明群体结构对LD的延伸和程度会有较大的影响。在光皮桦同样观察到BlSPL1基因SNPs在不同群体的LD延伸在较短的距离内迅速消失(图 5)，与杨树等异交植物具有同样的特征。但在不同光皮桦群体内，BlSPL1基因SNPs的连锁不平衡程度衰退程度明显不同，四川群体LD程度最小，延伸长度也最短，其原因可能是地理隔离使得不同群体间的基因交流减少，使得BlSPL1在进化过程中发生了遗传漂变。