文章信息
- 尹忠平, 上官新晨, 陈继光, 吴少福, 黎冬明
- Yin Zhongping, Shangguan Xinchen, Chen Jiguang, Wu Shaofu, Li Dongming
- 青钱柳悬浮培养细胞三萜酸的分离及结构鉴定
- Separation and Identification of Triterpenic Acids from Suspended Cultured Cells of Cyclocarya paliurus
- 林业科学, 2013, 49(9): 23-27
- Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(9): 23-27.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130904
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文章历史
- 收稿日期:2012-09-12
- 修回日期:2013-01-14
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作者相关文章
2. 江西农业大学食品科学与工程学院 南昌 330045
2. Food Science and Engineering Department, Jiangxi Agricultural University Nanchang 330045
青钱柳(Cyclocarya paliurus)为我国特有的胡桃科(Jugl and aceae)青钱柳属珍稀濒危植物,零星分布于南方各省。青钱柳叶含三萜、黄酮、多糖及微量元素等活性成分(谢明勇等,2008; 尹忠平等,2011;Fang et al.,2011; Xie et al.,2006),具有降糖(谢明勇等,2008; Kurihara et al.,2003a)、调脂(Kurihara et al.,2003b)、增强免疫力(谢明勇等,2008)等多种功能,是良好的天然保健食品和医药资源。青钱柳繁育困难(谢明勇等,2008)、资源匮乏严重等问题制约其开发利用。三萜化合物是一类由6个异戊二烯单位构成的化合物群,具有抗肿瘤(Wang et al.,2012)、抗炎(Yang et al.,2012)、降脂(McGhie et al.,2012)等多种功能活性,在医药和保健食品领域具有重要的开发利用价值。三萜化合物是青钱柳叶中重要的活性物质,舒任庚等(2005)率先对青钱柳叶中的三萜类物质进行分离和结构鉴定,先后鉴定出乌苏酸、Epikatonic acid等多个三萜类化合物; 研究人员现已从青钱柳叶中鉴定了17个三萜类化合物(谢明勇等,2008; 舒任庚等,2005; Jiang et al.,2006; 李俊,2008)。目前,国内外尚未见青钱柳悬浮培养细胞三萜酸分离鉴定方面的研究报道。笔者对青钱柳悬浮培养细胞中的三萜类化合物进行研究,从中分离出5种三萜酸并进行结构鉴定,旨在探索以青钱柳细胞悬浮培养方式生产三萜酸类功能因子的可行性,以解决资源匮乏制约其活性成分开发利用的难题。
1 材料与方法 1.1 试验材料青钱柳悬浮培养细胞由本实验室培养获得(尹忠平等,2011)。培养物经减压抽滤得到新鲜细胞,再于60 ℃真空干燥箱中烘干至恒质量,粉碎后备用。
1.2 试剂乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚、甲醇、乙酸酐、浓硫酸等均为分析纯(天津永大化学试剂厂); 色谱纯级无水甲醇(江苏汉邦公司); 大孔树脂AB-8(河北沧洲宝恩吸附材料科技有限公司); 葡萄聚糖凝胶Sephadex LH-20(GE Pharmacia); 硅胶100~200目、200~300目(青岛海洋化工有限公司)。
1.3 试验仪器超声循环提取机(HF-2.5B,北京弘祥隆公司);高效液相色谱仪(Breeze 1525-7725-2487,Waters);低速大容量离心机(Anke TDL 5-A,上海安亭仪器厂); 显微熔点测定仪(XR6,上海永亨光学仪器制造公司); 核磁共振波谱仪(AVANCEⅢ 600,Bruker); 高分离度快速液相-飞行时间质谱(RRLC-TOF/MS)联用仪(安捷伦1200型液相色谱仪、安捷伦G6220A飞行时间质谱仪、ESI Agilent标准电喷雾离子源、Qualitative analy-sis质谱分析软件)。
1.4 试验方法 1.4.1 总三萜酸提取以乙酸乙酯为溶剂,采用超声辅助法提取总三萜酸,主要提取条件如下: 提取时间为40 min,提取温度为50 ℃,料液比为1: 10。重复提取1次,合并提取液,60 ℃旋转真空浓缩得粗提物。
1.4.2 三萜酸分离纯化经超声辅助提取、真空浓缩得到的青钱柳叶总三萜粗提物,以AB-8大孔树脂进行吸附,上柱后以40%乙醇清洗去杂,以95%乙醇洗脱,得初步纯化的总三萜。初步纯化的总三萜再进行硅胶柱层析(100~200目),干法上柱,依次以石油醚/乙酸乙酯(20: 1—2: 1)、石油醚/乙酸乙酯/甲醇(20: 10: 1—20: 10: 10)和甲醇(100%)进行梯度洗脱,每500 mL 为1个单位进行收集,获得含三萜化合物的组分1,2和3。组分1,2和3再以200 ~ 300目硅胶进行分离和纯化,分别采用石油醚/乙酸乙酯(10: 1)、石油醚/乙酸乙酯(6: 1)和二氯甲烷/甲醇(10: 1)进行洗脱,收集含三萜的目标成分,再分别以Sephadex LH-20进行纯化[采用二氯甲烷/甲醇(1: 1)的溶剂进行洗脱],最后以半制备高效液相色谱和重结晶进行分离和纯化,从组分1中分离得到三萜化合物单体Ⅳ和Ⅴ,从组分2中得到三萜单体Ⅲ,从组分3中得到了三萜单体Ⅰ和Ⅱ。
1.4.3 半制备高效液相色谱分离色谱柱: WatersC18柱(7.8 mm×300 mm,7 μm); 检测器: Waters2487; 检测波长: 210 nm; 流动相: V(甲醇): V(0.1%醋酸水溶液)= 89: 11; 流速: 2.0 mL·min-1 ; 柱温: 40 ℃。样品以色谱纯甲醇溶解,0.22 μm滤膜过滤后上柱分离。
1.4.4 RRLC-TOF/MS 检测液相色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(2.1 mm×50 mm,1.8μm); 流动相为90 %甲醇+ 10%甲酸水(甲酸含量为0.1%)。质谱条件为电喷雾负离子模式; 质量扫描范围为110 ~ 1 000(m/z); 毛细管电压为4000 V; 雾化气压力为0.21 MPa; 干燥气流速为10L·min-1 ; 干燥气温度为350 ℃; 碎片电压为180V。选择参比校准液进行实时质量数校正。样品测定之前,以调谐液进行质量轴校准,使质量精度误差小于2 × 10-6。数据以Qualitative Analysis 软件进行处理。
2 结果与分析 2.1 化合物Ⅰ白色无定形粉末(甲醇)。熔点: 269~271 ℃(未校正)。Liebermann-Burchard、10%浓硫酸乙醇反应均呈阳性。RRLC-TOF/MS负离子模式准分子离子峰[M-H]-m/z 471.354 6。1H NMR(600 MHz,DMSO): δ12.03(1H,brs,COOH-28); δ5.17(1H,t,J=3.6 Hz,H-12); δ4.39(1H,d,J=4.2 Hz,Hβ-2); δ4.29(1H,d,J=4.2 Hz,Hα-3); δ3.42(1H,m,H-18); δ1.10(3H,s),0.92(3H,s),0.90(3H,s),0.88(6H,s),0.71(3H,s),0.70(3H,s)对应7处甲基氢信号。13 C NMR(150MHz,DMSO)、DEPT谱图表明该化合物含30个碳,其中,13个伯碳和叔碳、9个仲碳、8个季碳; δ179.0(C28),δ144.4(C13),δ121.9(C12),δ82.8(C3),δ67.7(C2),δ29.3(C23)、17.6(C24)、16.8(C25)、17.4(C26)、26.1(C27)、33.3(C29)、23.9(C30)对应7个甲基碳; 以上碳信号提示该化合物是含有2个羟基的三萜酸。13C NMR谱图数据归属见表 1。该化合物的1H NMR,13 C NMR,DEPT谱图数据与文献(刘博等,2010; 鞠建华等,2003; 陈龙胜等,2008)所报道的2α-羟基齐墩果酸相应数据基本一致,因此鉴定为2α-羟基齐墩果酸(maslinic acid)。该化合物结构见图 1-Ⅰ。
白色无定形粉末(甲醇)。熔点: 251~253 ℃(未校正)。Liebermann-Burchard、10%浓硫酸乙醇反应均呈阳性。RRLC-TOF/MS负离子模式准分子离子峰[M-H]-m/z 471.355 8。1H NMR(600 MHz,DMSO): δ11.95(1H,brs,COOH-28); δ5.14(1H,t,J = 3.6 Hz,H-12); δ4.40(1H,d,J = 4.2 Hz,Hβ-2); δ4.28(1H,d,J=4.2 Hz,Hα-3); δ3.42(1H,m,H-18); δ0.70(3H,s),0.74(3H,s),0.81(3H,d,J = 6.6 Hz),0.92(6H,s),0.93(3H,d,J =3.6)、1.04(3H,s)对应7处甲基氢信号。13C NMR(150 MHz,DMSO)、DEPT谱图表明该化合物含有30个碳,其中,15个伯碳和叔碳、8个仲碳、7个季碳;δ178.8(C28),δ82.7(C3),δ67.6(C2),δ138.7(C13)、δ125.0(C12),δ29.3(C23)、17.5(C24)、16.9(C25)、17.7(C26)、23.8(C27)、17.4(C29)、21.6(C30)分别对应7个甲基碳; 以上碳信号提示该化合物是带有2个羟基的五环三萜类化物。13C NMR谱图数据归属见表 1。该化合物的1H NMR,13 C NMR,DEPT谱图数据与文献(刘博等,2010; Yamagishi et al.,1988,陈龙胜等,2008)所报道的2α-羟基熊果酸相应数据基本一致,故鉴定为2α-羟基熊果酸(Corosolic acid)。该化合物结构见图 1-Ⅱ。
2.3 化合物Ⅲ白色无定形粉末(甲醇)。熔点: 294~296 ℃(未校正)。Liebermann-Burchard、10%浓硫酸乙醇反应均呈阳性。RRLC-TOF/MS 负离子模式准分子离子峰[M-H]-m/z 455.3618。1H NMR(600 MHz,CDCl3): δ4.74(1H,s,H-29β)和4.61(1H,s,H-29α)表明可能含有一个环外双键; δ3.19(1H,dd,J= 11.4,6.6Hz,H-3); δ3.00(1H,ddd,J = 10.8,10.8,4.8 Hz,H-19); δ 0.76(3H,s),0.83(3H,s),0.94(3H,s),0.97(3H,s),1.01(3H,s),1.69(3H,s)为6处甲基氢信号。13 C NMR(150MHz,CDCl3): δ180.4(C28),δ79.0(C3),δ150.4(C20),δ109.7(C29)提示该化合物可能为羽扇豆烷型三萜类化合物; δ28.0(C23),15.4(C24),16.1(C25),16.1(C26),14.7(C27),19.4(C30)对应6个甲基碳; 13C NMR谱图数据归属见表 1。该化合物1HNMR,13C NMR数据与文献(林朝展等,2010; Chen et al.,2008)报道的白桦脂酸数据基本一致,因此鉴定为白桦脂酸(betulinic acid)。该化合物结构见图 1-Ⅲ。
2.4 化合物Ⅳ白色针状结晶(氯仿-甲醇)。熔点: 301~303 ℃(未校正)。Liebermann-Burchard、10%浓硫酸乙醇反应均呈阳性。RRLC-TOF/MS 负离子模式准分子离子峰[M-H]-m/z 455.358 3。1H NMR(600 MHz,CDCl3): δ5.29(1H,t,J=3.6 Hz,H-12);δ3.22(1H,dd,J=10.8,4.2 Hz,H-3); δ2.73(1H,dd,J=13.8,4.2 Hz,H-18); δ 0.75(3H,s),0.77(3H,s),0.90(3H,s),0.91(3H,s),0.93(3H,s),0.99(3H,s),1.13(3H,s)为7处甲基氢信号。13 CNMR(150MHz,CDCl3): δ183.2(C28),δ143.6(C13),δ122.7(C12),δ79.0(C3)表明该化合物可能为五环三萜的基本骨架; δ28.1(C23),15.5(C24),15.3(C25),17.1(C26),25.9(C27),33.1(C29),23.6(C30)分别对应7个甲基碳; 13C NMR谱图数据归属如表 1所示。该化合物的1H NMR,13C NMR数据与文献(Qu et al.,2009; 周洪波等,2011)所报道的齐墩果酸数据基本一致,因此鉴定为齐墩果酸(oleanolic acid)。该化合物结构见图 1-Ⅳ。
2.5 化合物Ⅴ白色无定形粉末(甲醇)。熔点: 284~286 ℃(未校正)。Liebermann-Burchard、10%浓硫酸乙醇反应均呈阳性。RRLC-TOF/MS负离子模式准分子离子峰[M-H]-m/z455.359 7。1H NMR(600 MHz,DMSO): δ11.94(1H,brs,COOH-28);δ5.13(1H,t,J=3.6 Hz,H-12); δ4.30(1H,brs,OH-3); δ3.43(1H,dd,J=13.8,7.2 Hz,H-3);δ2.10(1H,d,J=10.8 Hz,H-18); δ 0.68(3H,s),0.75(3H,s),0.82(3H,d,J=6.6 Hz),0.87(3H,s),0.90(3H,s),0.91(3H,s),1.04(3H,s)为7处甲基氢信号。13 C NMR(150MHz,DMSO)、DEPT谱图表明该化合物有30个碳,其中,14个伯碳和叔碳、9个仲碳、7个季碳; δ178.8(C28),77.3(C3),δ138.7(C13),δ125.1(C12)提示该化合物可能是带有1个羟基的五环三萜酸; δ28.7(C23),16.6(C24),15.7(C25),17.4(C26),23.8(C27),17.5(C29),21.6(C30)分别对应7个甲基碳; 13C NMR 谱数据归属见表 1。该化合物的1H NMR,13C NMR、DEPT谱图数据与文献(Qu et al.,2009; 尹海龙等,2010)所报道的熊果酸数据基本一致,因此鉴定为熊果酸(ursolic acid),其结构见图 1-Ⅴ。
3 结论与讨论目前可利用的青钱柳资源很少,且大都零星分布于深山老林之中,或保存于自然保护区内(谢明勇等,2008; 谢寅峰等,2012)。青钱柳种壳坚硬,种子属于综合性深休眠类型,自然萌发率低,有性繁育困难。尚旭岚等(2011)、Fang等(2007)采用酸蚀、GA3浸种、GA3拌沙、先低温后暖温层积的方法,可实现头年采种、翌年出苗。无性繁殖方面的研究主要在扦插和组培繁殖技术上,但难以生根,成活率很低(谢明勇等,2008; 谢寅峰等,2011)。从实际应用情况来看,目前尚无青钱柳大量人工繁殖和栽培的成功经验,资源稀缺局面仍未得到根本改观。
用植物细胞培养生产活性天然产物具有周期短、可控性强、受自然条件影响小、操作方便、重复性好、易于工业化生产等优点(刘菲,2010; Bonfill et al.,2011; Georgiev et al.,2009),可用来解决青钱柳活性成分开发利用的难题。研究人员已对1 000多种植物进行细胞培养研究,从中分离出600多种次生代谢产物,其中,有60多种物质的含量接近或超过原有植物,有20多种的含量超过培养细胞干质量的1%; 用人参(Panax ginseng)细胞培养生产皂甙、用洋地黄(Digitoxin purpurea)细胞培养生产生物碱等都已经达到了工业化生产的规模,用长春花(Catharanthus roseus)细胞培养生产生物碱已达到中试水平(刘菲,2010)。
本实验室前期已经建立了青钱柳细胞悬浮培养体系,并对其中的三萜化合物积累进行了初步研究(尹忠平等,2011)。本文则对其中的三萜酸进行分离和结构鉴定,从青钱柳悬浮培养细胞中分离了5个单体三萜酸,经RRLC-TOF/MS,1H NMR、13C NMR和DEPT等鉴定,分别为2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基熊果酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸,其中2α-羟基齐墩果酸和白桦脂酸是首次在青钱柳中得到分离鉴定。研究结果表明,青钱柳悬浮培养细胞中含有多种活性三萜酸,可进一步从诱导、培养方式方法、代谢途径中的关键酶基因以及生物反应器培养等方面进行深入研究,为植物细胞培养工业化生产活性三萜类物质奠定基础。
本文以大孔树脂吸附层析对三萜酸粗提物进行初步纯化,取得了较好的纯化效果,回收率可达75.5%,纯化后总三萜的纯度可达62.4%。在上柱吸附操作时,因用乙酸乙酯提取的粗提物极性较小,难溶于水,故以水溶液上柱时上柱液体积非常大,时间长,效果不好。课题组对三萜酸在AB-8树脂上的吸附-解吸特性进行了反复试验,发现以30%的乙醇溶液上柱效果较好,操作也较为方便,同时一些极性大的杂质在树脂上的吸附也较少,可提高树脂的吸附能力,洗脱所得的目标物纯度上也更高。洗脱时,以65%以上的乙醇溶液就可以将目标物洗脱下来,随着乙醇浓度的增加,洗脱的效率能够得到提升,回收率提高,最后确定以95%的乙醇进行洗脱。在以硅胶进行分离时,课题组发现提取物中还有少量极性更高些的三萜类物质,但含量较少,分离难度大,此组分有待于进一步分离和鉴定。
[1] | 陈龙胜,吕杨,许舒雯,等. 2008. 山楂中三萜酸成分的研究. 时珍国医国药, 19(12):2909-2910.(2) |
[2] | 鞠建华,周亮,林耕,等. 2003. 枇杷叶中三萜酸类成分及其抗炎、镇咳活性研究. 中国药学杂志,38(10): 752-757.(1) |
[3] | 李俊. 2008. 鹊肾树心材和青钱柳叶化学成分及其生物活性的研究. 广州:中山大学博士学位论文. (1) |
[4] | 林朝展,祝晨蔯,邓贵华,等. 2010. 枇杷叶紫珠化学成分研究. 中药材,33(6):897-900.(1) |
[5] | 刘博,吴和珍. 2010. 山茱萸药材中三萜类成分的研究. 湖北中医杂志,32(12):75-76.(2) |
[6] | 刘菲. 2010. 喜树悬浮培养体系的建立及喜树碱含量的调控研究. 长沙:湖南农业大学硕士学位论文.(2) |
[7] | 尚旭岚. 2007. 青钱柳种子休眠机理及其解除休眠方法的研究. 南京:南京林业大学博士学位论文. |
[8] | 尚旭岚,徐锡增,方升佐,等. 2011. 青钱柳种子休眠机制. 林业科学,47(3):68-74. (1) |
[9] | 舒任庚,刘玉风,陈杰,等. 2005. 青钱柳植物中三萜成分的研究. 中药材, 28(7):558-559.(2) |
[10] | 谢明勇,谢建华. 2008. 青钱柳研究进展. 食品与生物技术学报, 27(1):113-121.(6) |
[11] | 谢寅峰,张志敏,尚旭岚,等. 2011. 青钱柳茎段腋芽萌发和丛生芽增殖. 林业科学,47(1):50-55.(1) |
[12] | 谢寅峰,张志敏,张颖颖,等. 2012. 青钱柳愈伤组织增殖. 东北林业大学学报,40(6):16-18.(1) |
[13] | 尹海龙,李建,李箐晟,等. 2010. 白英的化学成分研究. 军事医学科学院院刊,34(1):65-67.(1) |
[14] | 尹忠平,上官新晨,米丽雪,等. 2011. 青钱柳细胞悬浮培养及三萜化合物积累. 深圳大学学报:理工版, 28(5): 430-435.(3) |
[15] | 周洪波,王峰,房志坚. 2011. 金钮扣中三萜类化学成分研究. 中国中药杂志,36(15):2096-2098.(1) |
[16] | Bonfill M, Mangas S, Moyano E, et al. 2011. Production of centellosides and phytosterols in cell suspension cultures of Centella asiatica. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 104(1): 61-67.(1) |
[17] | Chen J Y, Ya Q K, Lu W J, et al. 2008. Study on the chemical constituents of Baeckea frutescens. Natural Product Research and Development, 20(5): 827-829, 835.(1) |
[18] | Fang S Z, Wang J Y. 2007. Changes in the biochemical composition and enzyme activity during dormancy release of Cyclocarya paliurus seeds. Forestry Studies in China, 9(1): 7-13.(1) |
[19] | Fang S Z, Yang W X, Chu X L, et al. 2011. Provenance and temporal variations in selected flavonoids in leaves of Cyclocarya paliurus. Food Chemistry, 124(4): 1382-1386.(1) |
[20] | Georgiev M I, Weber J, Maciuk A. 2009. Bioprocessing of plant cell cultures for mass production of targeted compounds. Applied Microbiology and Biotechnology, 83(5): 808-823.(1) |
[21] | Jiang Z Y, Zhang X M, Zhou J, et al. 2006. Two new triterpenoid glycosides from Cyclocarya paliurus. Journal of Asian Natural Products Research, 8(1/2): 93-98.(1) |
[22] | Kurihara H, Asami S, Shibata H, et al. 2003a. Hypolipomic effect of Cyclocarya paliurus (Batal.) Ijinskaja in lipid-loaded mice. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 26(3): 383-385.(1) |
[23] | Kurihara H, Fukami H, Kusumoto A, et al. 2003b. Hypoglycemic action of Cyclocarya paliurus (Bata1.) Iljinskaja in normal and diabetic mice. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 67(4): 877-880.(1) |
[24] | McGhie T K, Hudault S, Lunken R C M, et al. 2012. Apple peels, from seven cultivars, have lipase-inhibitory activity and contain numerous ursenoic acids as identified by LC-ESI-QTOF-HRMS. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 60(1): 482-491.(1) |
[25] | Qu W, Liang J Y, Li M R. 2009. Chemical Constituents from Houttuynia cordata. Chinese Journal of Natural Medicines, 7(6): 425-427.(2) |
[26] | Wang J L, Gu T Y, Zhong J J. 2012. Enhanced recovery of antitumor ganoderic acid T from Ganoderma lucidum mycelia by novel chemical conversion strategy. Biotechnology and Bioengineering, 109(3): 754-762.(1) |
[27] | Xie M Y, Li L, Nie S P, et al. 2006. Determination of speciation of elements related to blood sugar in bioactive extracts from Cyclocarya paliurus leaves by FIA-ICP-MS. European Food Research and Technology A, 223(2): 202-209. (1) |
[28] | Yamagishi T, Zhang D C. 1988. The cytotoxic principles of Hyptis capitata and the structures of the new triterpenes hyptatic acid A and B. Phytochemistry, 27(10): 3213-3216.(1) |
[29] | Yang M H, Wang J S, Luo J G, et al. 2012. Four new triterpenoids from Chisocheton paniculatus and their anti-inflammatory activities. Canadian Journal of Chemistry, 90(2): 199-204.(1) |