冬枣(Ziziphus jujuba)是我国的特色鲜食果品之一，以其极优的品质和富含人体必需的营养物质而备受消费者青睐(魏绍冲等，2012; 刘方春等，2010)。但是，大量化肥的施用不仅引起了水体富营养化、土壤物理性质恶化，还导致冬枣果实品质的严重下降(Yang et al., 2010)。植物的施肥效应除了受土壤、林木本身营养特性影响外，更主要的是受肥料种类的影响(Fang et al., 2006)。不同肥料的施用会引起土壤物理、化学和生物性状的变化，从而会改变土壤的养分供应能力。因此，开展不同肥料对冬枣根际土壤理化性状影响的研究显得尤为重要，微生物肥料就是其中之一。

土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，在有机质分解、养分循环和植物养分利用过程中发挥着关键的作用。接种土壤微生物，特别是接种植物根际促生细菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，被普遍认为是一种环境友好、 经济有效的提高产量和品质的方法(Abbasi et al., 2011)。PGPR 是指生存在植物根圈范围中、对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益细菌的统称，对植物生长及病害防治有极其重要的作用(Weyens et al., 2009; Verma et al., 2010)。文献证明，PGPR 对植物生长具有显著的促进作用(Abbasi et al., 2011; Krey et al., 2011; Egamberdiyeva，2007)。有关PGPR 生物肥料对植物生长和土壤理化性质影响的研究较多(周莉华等，2005)，但对植物根际环境影响，尤其是对根际土壤细菌多样性影响的关注较少。此外，PGPR 生物肥料的应用研究多集中在农作物上(Abbasi et al., 2011; Egamberdiyeva，2007)，关于其在冬枣中的应用研究鲜有报道。笔者从冬枣根际土壤中筛选出具有促生作用的优势细菌，以发酵鸡粪作为载体，制成有针对性的生物有机肥，利用传统的氯仿熏蒸法和现代的 T-RFLP(terminal restriction fragment length polymorphism)技术，探讨不同施肥对冬枣根际土壤微生物特征的影响，以期为PGPR 生物肥料在冬枣中的应用提供科学的理论依据。

试验于2009 年3 月28 日冬枣萌芽前在滨州市林业局冬枣示范园(37. 22° N，108. 02° E)进行。 选用6 年生长势相近的冬枣，砧木为酸枣，株行距为 3 m × 3 m。土壤有机质含量为10. 25 g·kg^－1，碱解氮为38. 74 mg·kg^－1，有效磷为18. 46 mg·kg^－1，有效钾为125. 3 mg·kg^－1，土壤pH 值为8. 5，土壤类型为潮土。

通过小麦叶片保绿法和萝卜子叶增质量法从6 年生冬枣根际土壤中筛选出1 株产细胞分裂素的 PGPR(Hussain et al., 2011)，分子鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该细菌产反式玉米素、激动素和吲哚乙酸的量分别为368. 73 ng·mL ^{－ 1}，2 73. 56 ng·mL ^{－ 1}和13. 85 μg·mL ^{－ 1}。

将筛选出的细菌分离物在往返式振荡器中以 180 r·min ^{－ 1}振荡培养72 h，利用平板计数法测定每毫升含菌量，计算菌液浓度，然后稀释至2. 5 亿 CFU·mL ^{－ 1}，复合到121 ℃灭菌2 h 的腐熟鸡粪中，制成冬枣专用的PGPR 生物肥肥料(微生物含量为 0. 5 亿CFU·g ^{－ 1} )。利用山东农业大学提供的乳酸菌(lactobacillus)DY4和酵母菌(saccharomyces)DY3，按照1∶ 1的比例混合，以同样的方法制成普通生物有机肥料作为对照肥料(微生物含量为0. 5 亿 CFU·g ^{－ 1})。试验包含4 个处理: 1)施用冬枣专用的PGPR 生物有机肥每株15 g(PF); 2)施用普通的生物有机肥(NF); 3)施用发酵鸡粪每株15 g(DC); 4)不施用任何肥料(CK)。试验采用完全随机设计每处理36 株树，重复3 次，在不同处理间设置2 行保护行，分别于2009 年3 月28 日和2010 年3 月27 日采用放射状施肥。

2010 年4—10 月分7 次采集冬枣根际土壤样品。每个试验处理内随机抽取2 ～ 3 株样树，根际土的取样方法参考Wang等(1998)的方法。采集的样品装入已消毒的密封塑料袋，带回实验室后分成2 份，一份用于土壤微生物生物量碳和微生物数量的测定，另外一份放于－ 80 ℃的冰箱中保存，最后将不同时间采集的同一处理样品等质量混合后用于 T-RFLP 分析的测定。

土壤微生物种群数量测定采用稀释平板法。真菌的测定采用马丁培养基+ 孟加拉红+ 硫酸链霉素方法; 放线菌的测定采用改良高氏1 号培养基+ 重铬酸钾方法; 细菌的测定采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基方法。用0. 1 mL 消毒移液管取每个稀释度悬液，无菌操作，接种于消毒培养皿，重复3 次。每种菌均以不加悬液的消毒蒸馏水作为空白对照。

微生物生物量碳采用氯仿熏蒸K₂SO₄浸提法测定(徐永刚等，2010)。提取时，称取30 g 新鲜过筛土样，在真空干燥器中用氯仿蒸汽熏蒸24 h，用反复抽真空方法除去残存氯仿后，另取等量土样不熏蒸，用100 mL 0. 5 mol·L ^{－ 1} K₂SO₄ 溶液浸提振荡30 min 后立即过滤，滤出的浸提液在－ 15 ℃下保存，待测定。提取液中有机碳含量采用重铬酸钾氧化法测定。

样品基因组总DNA 的提取纯化使用E. Z. N. A. Soil DNA Kit(美国 OMEGA 公司)。采用上游引物27F-FAM(5-FAMAGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3')和下游引物1492R(5'-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3')扩增16S rDNA。 PCR 反应条件为: 95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，30 个循环; 72 ℃ 10 min。PCR 产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用PCR 产物纯化试剂盒纯化，－ 20 ℃保存备用。

用限制性内切酶Msp I 对上述PCR 产物进行酶切。反应体系为Msp I 15U，10 × T Buffer 2 μL，0. 1% BSA 2 μL，DNA≤1 μg，ddH₂O 补足20 μL。 混匀后37 ℃酶切6 h，65 ℃作用15 min 停止反应。 酶切产物由ABI 3730 测序仪扫描，扫描结果采用 Peak Scanner Softwear v1. 0 分析(宋洪宁等，2010)。

细菌群落多样性分析: 单个T-RF(terminal restriction fragment)的相对峰面积(A_p)通过公式 A_p = n_i /N × 100 进行计算，其中，n_i 为单个T-RF 的峰面积，N 为图谱中所有峰的面积的总和。A_p 值仅采用了片段长度在50 ～ 500 bp 区间的T-RF 数值进行计算，且仅采用A_p 值大于1% 的T-RF 进行统计分析。以图谱中每个可统计的T-RF 视为1 个OTU(operational taxonomic unit)，以T-RF 的相对峰面积作为对应的OTU 的丰度。根据图谱中OTU 的种类及其丰度，通过BIO-DAP 程序进行多样性分析(丰富度指数、多样性指数和均匀度指数)。根据T-RFs 在不同样品图谱中的分布及丰度，采用SPSS 软件对样品进行主成分分析(PCA)。

根际土壤中微生物数量及微生物生物量碳的显著性检验采用Excel 2007和SPSS 软件进行相关分析，结果为3 次重复试验的平均值。

表 1 显示了冬枣一个生长周期内根际土壤中微生物数量的平均值，不同施肥处理对土壤中可培养的细菌、放线菌、真菌和微生物总量影响显著。PF 处理的细菌数量和微生物总量显著高于其他3 个处理，其中细菌数量分别比DC，NF和CK 处理提高了 47. 68%，55. 56%和50. 86%。土壤放线菌数量介于细菌和真菌之间，无论是施用生物肥还是鸡粪，均显著提高了冬枣根际土壤中放线菌数量。PF 处理的真菌数量减少显著，分别比NF，DC和CK 处理减少了29. 24%，33. 88%和23. 42%。无论是细菌、真菌、放线菌还是微生物总量，处理DC，NF 之间差异均未达显著水平。从以上分析可知，施肥对冬枣根际土壤中可培养微生物数量影响显著，施用PGPR 生物肥料显著提高了细菌数量及微生物总量，但显著降低了真菌数量。

表1 不同处理对冬枣根际土壤中微生物数量影响 Tab.1 Effect of different treatment on microbial populations in Ziziphus jujuba rhizosphere soil

表 1 不同处理对冬枣根际土壤中微生物数量影响 Tab.1 Effect of different treatment on microbial populations in Ziziphus jujuba rhizosphere soil 处理Treatments 细菌Bacteria /106 放线菌Actinomycetes /105 真菌Fungus /105 微生物总量Total microorganism/106 PF 7. 17 ( 0. 51) a 5. 46 ( 0. 42) a 1. 21 ( 0. 08) b 7. 82 ( 0. 48) a NF 5. 14 ( 0. 34) b 6. 77 ( 0. 50) a 1. 71 ( 0. 13) a 5. 99 ( 0. 31) b DC 5. 04 ( 0. 37) b 5. 89 ( 0. 33) ab 1. 83 ( 0. 11) a 5. 81 ( 0. 34) b CK 5. 01 ( 0. 29) b 4. 99 ( 0. 30) b 1. 58 ( 0. 08) ab 5. 66 ( 0. 32) b

不同处理根际土壤的TRFLP 图谱见图 1，每个峰相当于一种或几种细菌，峰越多则细菌种类越多，峰面积代表该细菌的含量。 各处理在片度长度为66(67)，138和148 bp 时，TRFs 都占绝对优势，T-RFLP 图谱具有相似性。但是，在可统计的T-RFs 中，不同处理峰的数量及同一片段长度下的峰面积差别很大。如PF 处理中，片段长度为66 bp(4. 4%)，127 bp(1. 1%)和293 bp(1. 2%)的T-RFs 与其他3 个处理有较大差异。此外，PF 处理在片度长度为127 bp时，有一明显可统计的T-RF，这表明不同处理对细菌的数量产生了一定的影响。因此，在T-RFLP 图谱的基础上，有必要对根际土壤的细菌多样性进行分析。

	图1 不同处理冬枣根际土壤的T-RFLP 图谱 Fig.1 T-RFLP profiles of different treatments in Z． jujuba rhizosphere soil

细菌群落物种的丰富度、多样性和均匀度分别用Margalef 指数、Shannon-Wiener 指数和Pielou 指数表示(表 2)。PF 处理具有最高的丰富度指数、多样性指数和均匀度指数。同NF 处理相比，PF 的丰富度、多样性和均匀度分别提高26. 71%，13. 41%和7. 64%。此外，CK 处理的丰富度指数、多样性指数较DC和NF 处理有所降低。从冬枣根际土壤中筛选出的PGPR 制成生物肥料，对于微生物群落多样性是有影响的。而同施用鸡粪处理相比，普通的微生物肥料施用于冬枣，差异并不明显。

表2 不同处理冬枣根际土壤细菌多样性分析 Tab.2 Species diversity of different treatments in Z． jujuba rhizosphere soil

表 2 不同处理冬枣根际土壤细菌多样性分析 Tab.2 Species diversity of different treatments in Z． jujuba rhizosphere soil 处理Treatments 丰富度指数Margalef index 多样性指数Shannon index 均匀度指数Pielou index PF 3. 553 2. 351 1. 000 NF 2. 804 2. 073 0. 929 DC 2. 662 2. 056 0. 913 CK 2. 424 1. 844 0. 904

将T-RFs 数据输入Phylogenetic Assignment Tool 数据库进行比对，对图谱中的一些优势峰所代表的物种进行推测。结果表明，PF 样品中，有显著差异的峰可能代表的物种为放线菌门(Actinobacteria，66 bp)、α-变形菌纲/δ-变形菌纲(α-Ptoteobacteria /δ- Ptoteobacteria，127 bp)和厚壁菌门(Firmicutes，293 bp)。其他图谱中的一些优势峰可能代表的物种为放线菌门(Actinobacteria，67 bp)、β-变形菌纲/拟杆菌门(β-Ptoteobacteria /Bacteroidetes，92 bp)、α-变形菌纲/γ-变形菌纲/厚壁菌门(α-Ptoteobacteria /γ- Ptoteobacteria /Firmicutes，128 bp)、γ-变形菌纲/放线菌门/厚壁菌门(γ-Ptoteobacteria /Actinobacteria / Firmicutes，138 bp)、β-变形菌纲/γ-变形菌纲/厚壁菌门(β-Ptoteobacteria /γ-Ptoteobacteria /Firmicutes，140 bp)、产水菌门/厚壁菌门(Aquificae /Firmicutes，148 bp)、厚壁菌门(Firmicutes，168，222和288bp)、产水菌门(Aquificae，198 bp)、α-变形菌纲(α- Ptoteobacteria，400 bp)和β-变形菌纲/γ-变形菌纲/ 厚壁菌门/拟杆菌门(β-Ptoteobacteria /γ- Ptoteobacteria /Firmicutes /Bacteroidetes，486 bp)。

根据T-RFs 在不同样品图谱中的分布及丰度进行主成分分析(PCA)，主成分1 的方差贡献率为64. 8%，主成分2 的方差贡献率为23. 8%，二者之和为88. 6%，可以代表系统内所有信息。T-RFLP 图谱的主成分分析结果(图 2)显示，4 个试验处理可以分为2 个相对独立的群。PF 处理具有较低的第1 主成分得分和较高的第2 主成分得分，其细菌群落结构域与其他样品有明显的差异，成为一个独立的群，而其他3 个处理构成一个相对独立的群。这从侧面反映PGPR 生物肥料有别于其他试验处理，而普通生物肥料中的微生物并未对冬枣根际土壤微生物群落产生大的影响。

	图2 不同试验处理T-RFLP 图谱的主成分分析 Fig.2 Principal component analysis for T-RFs of different treatments

土壤微生物生物量碳是微生物对土壤养分的生长固持和死亡矿化释放的外在表现形式，施肥可导致土壤微生物量增高，使其对养分的固持量与矿化释放量保持在较高水平，增强土壤肥力(郭甜等，2012)。从不同处理土壤微生物生物量碳的动态变化来看，DC，PF和NF 处理具有相似的规律，在4 月份3 处理表现出较高的微生物生物量碳，这应该是施入生物肥或鸡粪带入的碳源比较多所引起。随着冬枣树体的生长，对养分需求进一步增加，同时温度不断升高，微生物活性增强，土壤微生物生物量碳矿化释放速率增加，消耗部分土壤中的碳源，导致微生物生物量碳在5 月份急剧下降。而CK 处理在5 月份不仅没有下降，反而略有升高，表明微生物生物量碳矿化速率相对较弱，微生物活性不强。在整个生长期间(4 月份除外)，PF 处理的微生物量碳始终保持在较高的水平上，均显著高于其他处理，而除8，9 月份外，CK 处理均显著低于其他处理。PF，NF，DC和CK 处理的变异系数分别为0. 10，0. 17，0. 16和0. 22，PF 处理的变异系数最小，而CK 处理的变异系数最大。这说明PF 处理能比较稳定地提供植物所需的微生物量碳，保证微生物对土壤养分的固持和矿化释放维持在较高且稳定的水平。CK 处理变异最大，说明微生物可利用的碳源较少，冬枣树体与微生物竞争养分的状况更为激烈。以上分析说明施用鸡粪和PGPR 起到主导作用，而普通微生物对冬枣根际土壤中的微生物生物量碳影响较小。

	图3 不同施肥处理根际土壤微生物生物量碳的变化 Fig.3 Changes of soil microbial carbon in different fertilizer treatments

植物根际是一个特别的微区域，由于植物根系的影响，使其周围的微域在物理、化学和生物特性方面与土体主体不同(Norton，1990)。研究施肥对土壤环境，尤其是根际土壤的微生物群落特征影响具有重要意义。无论是土壤细菌、真菌还是放线菌，由于田间空间变异以及受环境条件变化的影响较大，加上稀释平板法计数测定代表性不高和存在较大的误差等原因，在研究过程中很难获得准确可靠的信息。本研究加大了取样频度，1 年生长周期内的平均值可一定程度上弥补平板计数法的不足，其试验结果显示不同施肥对土壤微生物数量产生重要影响。PGPR 生物肥料显著提高了根际土壤中细菌和微生物总量，降低了真菌的数量。土壤中真菌的数量虽然不及细菌多，但真菌的生物量较大，在土壤中的作用不容忽视，容易引起病害的微生物多是一些真菌类物质(李秀英等，2005)。因此，PGPR 生物肥料可能会对冬枣病害防治有一定的积极作用。在植物的整个生长期间，根系可分泌大量无机和有机物质，这些物质是根际微生物的重要营养和能量来源(Cheng et al., 1996)。但不同微生物所需的营养和来源并不相同，将普通微生物肥料施入冬枣根系，对根际土壤中微生物数量影响较小; 而将PGPR 回输冬枣根际土壤中，根系分泌的营养适合于特定微生物的繁殖，从而导致微生物数量，尤其是细菌数量的大幅增加。

目前国内外比较注重PGPR 的促生及生防效果，而关于其对根际土壤细菌群落多样性特征影响的研究不够重视(Adesemoye et al., 2008; Zhang et al., 2010)。环境的变化及外在添加物均会影响植物根际土壤中的微生物群落结构(宋洪宁等，2010)。在其他外在环境基本一致的前提下，本文着重研究不同施肥种类对微生物群落多样性的影响。基于T-RFLP 图谱的多样性指数分析说明，大部分T-RFs 的分布受施肥影响较小，说明在冬枣根际土壤中有着相对稳定的土著细菌群落。同PGPR 生物肥料处理相比，施用鸡粪及普通生物肥料的细菌多样性有所降低，反映部分细菌群落的功能和结构处于相对不稳定的状态，并不能适应周围环境带来的变化。施用PGPR 生物肥料改变部分T-RFs 的分布和比例，明显提高细菌丰富度、多样性及均匀指数，这对稳定土壤性质、对外界环境变化的适应性具有重要意义。而同施用鸡粪相比，施用普通生物肥料对冬枣根际土壤的细菌多样性指数影响较小，这从侧面说明，PGPR 生物肥料对微生物群落结构影响中，从冬枣根际土壤中筛选出的PGPR 是决定性因素。

施肥方式不同，动植物残体、根系残留物和根系分泌物在土壤中的积累不同，土壤微生物可利用的碳源数量和种类也不同，从而使土壤微生物生物量碳在不同施肥方式下表现出较大差异。本研究结果发现，从冬枣根际土壤中筛选出的微生物，通过扩繁、吸附后施用于冬枣更有利于微生物作用的发挥，其原因可能是PGPR 生物肥料带入较多的碳源，微生物繁殖能力增强，微生物量碳的总体水平增高。 徐永刚等(2010)研究表明，施用有机肥可提高土壤中微生物生物量碳的含量。本研究施用普通生物肥料和鸡粪也一定程度上提高了微生物生物量碳，这与前人研究结果基本一致。同鸡粪处理相比，普通生物肥料中虽然接种了一定数量的微生物，但对根际土壤微生物生物量碳并没有显著影响。此外，同 PGPR 生物肥料相比，普通生物肥虽然接种了相同数量的微生物，但其微生物生物量碳的含量却显著降低。微生物具有土著肥料性和专用性(Abbasi et al., 2011)，本研究结论也从侧面证明，同普通微生物相比，土著微生物更能相对稳定地提供微生物生物量碳。土壤微生物的生命活动不仅需要能源，也需要生命元素，土壤环境限制因子及其水平都会影响到微生物的生命活动，微生物活动加剧消耗大量微生物量碳就是限制因子之一。同普通微生物肥料和鸡粪处理相比，利用冬枣根际土壤中筛选出 PGPR 制成的生物肥料，可相对稳定地提供冬枣生长周期内的微生物生物量碳，PGPR 肥料的应用可有效地改善土壤中限制因子。

以上分析可知: 施用普通生物肥对冬枣根际土壤微生物特征影响较小，而从冬枣根际土壤中筛选出的PGPR 制成专用的生物肥料回输到冬枣根系周围，提高了微生物群落结构的多样性，同时可相对稳定地提供微生物生物量碳，根际土壤这些性质的改善对冬枣养分的吸收和利用具有重要的意义。