植物生长过程中，水分和养分是不可或缺的物质，二者分别或相互作用共同影响植物的生长。然而，面对全球水资源、养分资源日益紧缺，干旱趋势加剧，提高植物自身的水分利用效率(water useefficient，WUE)和养分利用效率(nitrogen useefficient，NUE)成为植物高效用水用肥的关键和潜力所在(山仑，2003; Bacon，2004)。此外，过去的林业生产中，由于对所选主要造林树种的水分生理和养分生理特征认识不充分，导致了“小老头树”等问题的发生，林业生产效率低下，造成了资源的浪费(王云霓等，2012)。因此，深入研究树种的水分、养分利用效率，培育高效用水用肥的植物新品种势在必行。

目前，稳定碳同位素法是国际上较为接受的测定植物叶片WUE 的方法。大量研究表明，植物叶片δ¹³C 值表示碳同化过程中胞间CO₂与大气CO2浓度比率(c_i /c_a)，反映了同化速率与气孔导度之间的平衡，可用于指示植物长期的水分利用效率(Farquhar et al., 1984; Hubick et al., 1987; McDowell et al., 2003;郑淑霞等，2005; 曹生奎等，2012; 樊延录等，2011;展小云等，2012)，这种方法测定过程简单、结果准确，且不受取样时空限制，能精确反映树种的水分状况(曹生奎等，2009)。叶片的养分利用效率反映了植物对养分的吸收利用特性，可用单位吸收量所产生的生物量(吴福忠等，2008)、养分再吸收(苏波等，2000)、老叶养分含量的倒数(Vitousek，1982)、碳氮比(Livingston et al., 1999)等参数表示，但至今仍没有统一的衡量标准。其中，叶片C/N 反映植物C 获取和同化率、N 分配和利用率的相对强弱(Chapin et al., 1989; 展小云等，2012)。

美洲黑杨(Populus deltoides)原产于北美密西西比河沿岸，拥有生长期长、生长量大等优良特性(徐纬英，1988)，是我国杨树杂交育种中重要的基因供体。由于环境问题越来越多地受到重视，因此通过种内杂交，选育生长显著超过亲本，且水分、养分利用效率高的新品种具有重要的生态及经济意义。前人的研究分别阐述了杨树不同无性系δ¹³ C和养分利用效率的遗传变异(刘希华等，2010; 赵凤君等，2005; 方晓娟等，2009; 李海玲等，2006;陈甜等，2009; 尹伟伦等，2007; 郭鹏等，2011)，但对于同一杂交组合不同生长势杂交子代的水分、养分利用效率的特异性研究还未见报道; 此外也没有对不同冠层资源利用效率进行研究。本研究以美洲黑杨亲本杂交衍生的不同生长势F₁杂种为研究对象，测定了不同冠层叶片的δ¹³ C 同位素丰度、碳氮含量，分析不同生长势美洲黑杨叶片的水分利用效率和氮素利用效率的差异及相互之间关系，以探讨美洲黑杨不同生长势子代形成的生物学机制，为林木杂种优势产生的生物学机制研究和高效水肥利用效率的林木育种提供参考。

试验中所用的材料均来自同一试验林中5 年生的美洲黑杨55 号杨(P.deltoides cl.‘55 /65’)(P₁，母本)和美洲黑杨10 /17 杨(P.deltoides cl.‘10 /17’)(P₂，父本)以及它们衍生的杂种F1代中不同生长水平的H₁，H₂，H₃(均具有超高亲生长优势，已获得中华人民共和国植物新品种保护权)和L₁，L₂，L₃(生长均低于双亲)共8 个无性系。亲本和杂种F₁于2007 年种植在河南省焦作市武陟县阳城试验林中，试验地位于35°8'N，113°17'E，极端最高温43.6 ℃，极端最低温-14.3 ℃，年平均气温15.2 ℃，平均降水量625.4 mm，全年≥10 ℃ 积温4 633 ℃，无霜期224 天，相对湿度61%，全年光照时数2 434 h，土壤pH6.8，有灌溉条件。完全随机区组设计，4 次重复，每个小区定植8 株，株行距为3 m × 5 m。

水平自栽植后(2007 年)，于每一年生长结束后测量所有参试无性系的树高和胸径。由于在林业生产中，超高亲杂种优势具有重要的意义，本研究以5 年生长数据，按下列公式计算F₁杂种无性系的超高亲杂种优势水平(王明庥，2001): H =(F₁ -HP)/ HP × 100%。式中: H 为杂种优势; F₁为杂种F₁平均值; HP 为较优亲本值。用H 代表正向杂种优势的无性系，L 代表负向杂种优势的无性系。

2011 年8 月8 日8: 00—10: 00，每个无性系分别采集上(13 m)、中(8 m)、下(3.3 m)3 个冠层同一方向的叶片作为分析样品。每个系号选择3 株健康、长势一致的植株，每株每个冠层采集正常叶片20 片，混合作为一个样品处理。

稳定碳同位素测定: 叶片样品用蒸馏水漂洗，105 ℃杀青，然后在60 ℃下烘48 h 至恒质量，用植物样品粉碎机(1093Sample Mill，Sweden)将叶片粉碎过120 目筛，用Flash EA1112 HT 元素分析仪高温燃烧后生成CO₂，用DELTA V Advantage 同位素比率质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Inc.，USA)检测CO₂的¹³ C 与¹² C 比率，并与国际标准物(PeeDee Belemnite，PDB)比对后计算出样品的δ¹³C 比率值: δ¹³C =(¹³C/¹²C_样品-¹³C/¹²C_PDB)/(¹³C/¹²C_PDB)×1 000‰。式中: ¹³ C /¹² C_样品是植物叶片样品的¹³C /¹²C比率; ¹³C /¹² CPDB是测定过程中标准物质PDB 的¹³C /¹²C 比率。

碳氮含量测定: 叶片样品于60 ℃烘48 h，粉碎后过100 目筛制成供试样品。全氮(N)用凯氏定氮法(2300 自动定氮仪，Sweden)测定，每样品养分指标的测定重复3 次; 全碳(LTC)含量采用K₂Cr₂O₇氧化-FeSO₄滴定法测定(鲁如坤，2000)。

应用SPSS 17.0 统计分析软件进行数据分析处理，Duncan 新复极差法检验差异显著性，应用Excel 软件进行图形和表格处理。

对亲本和杂种F1连续5 年的树高和胸径进行方差分析，结果显示6 个杂种F1代生长势显著不同。其中H₁，H₂，H₃在各树龄时树高和胸径均高于亲本，然而L₁，L₂，L₃在各树龄时树高和胸径均低于亲本(图 1)，说明2 类杂种的生长差异是稳定存在的。通过杂种优势计算公式得出，H1，H2，H3的树高和胸径均表现为正向杂种优势，而L₁，L₂，L₃的树高和胸径均表现为负向杂种优势(表 1)，说明美洲黑杨可通过种内杂交，经过基因重组分化出生长势截然相反的杂交子代。

	图1 亲本与杂种F1树高和胸径比较 Fig.1 Comparison of tree height and DBH between the parents and F1 hybrids 不同的字母表示系号间显著性差异( P ＜ 0. 05) 。下同。 Different letters indicate significant difference ( P ＜ 0. 05) ． The same below．

表1 5 年生杂种F₁ 杂种优势水平^① Tab.1 Level of heterosis of five-year-old F₁ hybrids

表 15 年生杂种F1 杂种优势水平① Tab.1Level of heterosis of five-year-old F1 hybrids 无性系Clone 超亲杂种优势Better-parent heterosis ( %) 树高Tree height 胸径DBH H1 7. 81 1. 26 H2 12. 55 1. 49 H3 11. 09 0. 72 L1 -5. 77 -20. 92 L2 -7. 59 -21. 82 L3 -3. 29 -18. 11 ① 超亲杂种优势计算公式为: H = ( F1 － HP) /HP × 100%，H 代 表杂种优势，F1 为杂种表现值，HP 为较好亲本的表现值。用H 代表 具有正向杂种优势的无性系，L 代表具有负向杂种优势的无性系。 Better-parent heterosis was calculated as H = ( F1 － HP) /HP × 100%， where H is the amount of heterosis，F1 is the trait value of the hybrid， and HP is the trait value of the better parent． H represents clone which has positive heterosis and L represents clone which has negative heterosis．

亲本与杂种F₁美洲黑杨叶片δ¹³ C 值范围在-25.91‰ ～ -29.24‰之间，平均值为-27.46‰;N 含量范围在13.27 ～ 17.93 g·kg ^-1 之间，平均值为15.285 g·kg ^-1 ; C 含量范围在522.31 ～ 643.21 g·kg ^-1之间，平均值为575.42 g·kg ^-1。首先分析每一冠层美洲黑杨亲本与不同生长势杂种F1叶片δ¹³C、碳氮含量，结果显示: 超亲杂种F₁在每个冠层的叶片δ¹³C 值极显著高于低亲杂种F₁，上中下3 个冠层超亲子代平均值分别较低亲子代平均值高2.84%，3.50%和3.66%(表 2); 超亲杂种F₁在树冠上层和中层的叶片N 含量显著大于亲本和低亲杂种F₁，而树冠下层各无性系叶片N 含量差异不显著，上中下3 个冠层超亲子代平均值分别较低亲子代平均值高25.25%，15.31%和8.40%(表 3); 超亲杂种F₁在每个冠层的叶片C 含量极显著大于低亲杂种F₁，上中下3 个冠层超亲子代平均值分别较低亲子代平均值高9.77%，11.83%和27.48%(表 4)。

表2 美洲黑杨亲本与杂种F₁ 不同冠层的叶片δ13C 值^① Tab.2 Foliar δ¹³C value of different canopies in P． deltoides parents and F₁ hybrids

表 2美洲黑杨亲本与杂种F1 不同冠层的叶片δ13C 值① Tab.2Foliar δ13C value of different canopies in P． deltoides parents and F1 hybrids 无性系Clone δ13C( ‰) 上层Upper 中层Middle 下层Lower 平均Mean P1 -26. 73 ± 0. 03 a -27. 50 ± 0. 58 abc -28. 19 ± 0. 18 bc -27. 41 ± 0. 34 P2 -26. 86 ± 0. 08 a -27. 16 ± 0. 15 abc -27. 88 ± 0. 03 ab -27. 32 ± 0. 18 H1 -26. 70 ± 0. 19 a -26. 68 ± 0. 61 a -27. 13 ± 0. 54 a -26. 86 ± 0. 19 H2 -26. 53 ± 0. 23 a -27. 08 ± 0. 61 ab -27. 45 ± 0. 06 ab -26. 97 ± 0. 20 H3 -26. 57 ± 0. 34 a -27. 24 ± 0. 24 abc -27. 51 ± 0. 36 ab -27. 06 ± 0. 21 L1 -27. 08 ± 0. 15 a -28. 20 ± 0. 69 d -28. 72 ± 0. 42 d -28. 11 ± 0. 29 L2 -27. 27 ± 0. 02 ab -28. 04 ± 0. 29 cd -28. 42 ± 0. 94 cd -27. 99 ± 0. 25 L3 -27. 79 ± 0. 39 b -27. 70 ± 0. 48 bcd -28. 26 ± 0. 19 bc -27. 88 ± 0. 16 ① 不同的字母表示系号间差异显著( P ＜ 0. 05) 。下同。Different letters indicate significant difference ( P ＜ 0. 05) ． The same below．

表3 美洲黑杨亲本与杂种F₁ 不同冠层的叶片N 含量 Tab.3 Foliar N nutrient content of different canopies in P． deltoides parents and F₁ hybrids

表 3美洲黑杨亲本与杂种F1 不同冠层的叶片N 含量 Tab.3Foliar N nutrient content of different canopies in P． deltoides parents and F1 hybrids 无性系Clone N 含量N content /( g·kg -1 ) 上层Upper 中层Middle 下层Lower 平均Mean P1 15. 47 ± 1. 83 bc 15. 42 ± 0. 38 ab 16. 17 ± 0. 76 a 15. 69 ± 0. 60 bc P2 16. 42 ± 0. 66 bc 13. 27 ± 1. 18 b 15. 82 ± 0. 49 a 15. 17 ± 0. 64 bc H1 17. 93 ± 0. 07 a 16. 97 ± 0. 11 a 14. 16 ± 0. 99 a 16. 15 ± 0. 68 ab H2 16. 78 ± 1. 05 ab 16. 21 ± 1. 22 a 16. 24 ± 0. 67 a 16. 41 ± 0. 50 a H3 16. 92 ± 0. 44 ab 16. 31 ± 0. 59 a 16. 33 ± 0. 32 a 16. 52 ± 0. 25 a L1 14. 41 ± 0. 35 cd 14. 54 ± 0. 17 ab 14. 81 ± 0. 21 a 14. 58 ± 0. 14 cd L2 13. 52 ± 0. 26 cd 15. 09 ± 0. 81 ab 13. 88 ± 1. 89 a 14. 16 ± 0. 64 cd L3 13. 31 ± 0. 79 d 13. 30 ± 1. 04 b 14. 20 ± 0. 38 a 13. 60 ± 0. 42 d

表4 美洲黑杨亲本与杂种F₁ 不同冠层的叶片C 含量 Tab.4 Foliar C nutrient content of different canopies in P． deltoides parents and F₁ hybrids

表 4美洲黑杨亲本与杂种F1 不同冠层的叶片C 含量 Tab.4Foliar C nutrient content of different canopies in P． deltoides parents and F1 hybrids 无性系Clone C 含量C content /( g·kg -1 ) 上层Upper 中层Middle 下层Lower 平均Mean P1 589. 12 ± 12. 34 b 573. 21 ± 14. 32 ab 545. 03 ± 11. 09 b 569. 12 ± 12. 34 P2 597. 32 ± 14. 25 b 584. 23 ± 16. 28 ab 547. 92 ± 12. 81 b 576. 49 ± 14. 25 H1 621. 24 ± 10. 14 a 602. 12 ± 14. 29 ab 571. 66 ± 13. 54 a 598. 34 ± 10. 14 H2 632. 12 ± 17. 82 a 623. 33 ± 18. 91 a 548. 42 ± 16. 79 a 601. 29 ± 17. 82 H3 643. 21 ± 12. 11 a 628. 22 ± 15. 54 a 562. 86 ± 13. 46 a 611. 43 ± 12. 11 L1 587. 32 ± 18. 12 b 560. 34 ± 20. 11 b 524. 51 ± 16. 52 c 560. 39 ± 18. 12 L2 572. 89 ± 14. 54 b 558. 31 ± 16. 89 b 522. 31 ± 12. 34 c 551. 17 ± 14. 54 L3 564. 34 ± 16. 34 b 538. 11 ± 19. 34 b 502. 88 ± 18. 27 c 535. 11 ± 16. 34

从每一个无性系叶片δ¹³ C、碳氮含量的平均值来看，亲本与杂种F1叶片的δ¹³ C 值差异极显著(P ＜ 0.01)，超亲子代H₁(-26.86‰)、H₂(-26.97‰)和H₃(-27.06‰)大于亲本P₁(-27.41‰)、P₂(-27.32‰)，而低亲子代L₁(-28.11‰)、L₂(-27.99‰)和L₃(-27.88‰)显著低于亲本(表 2)。亲本与杂种F₁美洲黑杨叶片N 含量差异极显著(P ＜ 0.01)，超亲子代H₁(16.15g·kg ^-1)、H₂(16.41 g·kg ^-1)和H₃(16.52 g·kg ^-1)显著高于亲本P₁(15.69 g·kg ^-1)、P₂(15.17 g·kg ^-1)，低亲子代L₁(14.58 g·kg ^-1)、L₂(14.16 g·kg ^-1)和L₃(13.60 g·kg ^-1)显著低于亲本(表 3)。超亲子代H₁、H₂和H₃的叶片C 含量(598.34，601.29，611.43g·kg ^-1)极显著高于亲本P₁(569.12 g·kg ^-1)、P₂(576.49 g·kg ^-1)，低亲子代L₁(560.39 g·kg ^-1)、L₂(551.17 g·kg ^-1)低于亲本，但差异不显著，L₃(535.11g·kg ^-1)极显著低于所有系号(表 4)。

为了分析不同冠层间美洲黑杨叶片δ¹³C、碳氮含量的差异，对其进行方差分析。图 2 显示，不同冠层间叶片δ¹³C 值和C 含量差异极显著(P ＜ 0.01)，树冠上层叶片δ¹³C 值和C 含量最大，中层次之，而下层叶片δ¹³C 值和C 含量最小; 不同冠层间叶片N含量差异不显著(P ＞ 0. 05)，但是上层N 含量大于中层，下层N 含量最小。

	图2 不同冠层的δ13C、碳氮含量 Fig.2 Foliar δ13C value，N nutrient content and C nutrient content in different canopies

美洲黑杨亲本与杂种F₁叶片的N 含量与δ¹³C值的相关性分析(图 3)显示，N 含量与δ¹³C 值呈极显著正相关(R² = 0.941)，说明植物叶片氮含量越高，其δ¹³C 值也越高。

	图3 美洲黑杨亲本与杂种F1 叶片的N 与δ13C 的关系 Fig.3 Relationships between foliar N content and δ13 C value of P． deltoides parents and F1 hybrids

叶片的长期氮素利用效率(NUE)利用叶片C /N表示。由图 4 可看出，3 个低亲杂种F₁的C /N 最大，与父本差异不显著(P ＞ 0.05)，但极显著大于3个超亲杂种F₁和母本(P ＜ 0.01)。用δ¹³C 值表示叶片的长期水分利用效率(WUE)，亲本与杂种F₁叶片的WUE 差异极显著，其中超亲子代H₁，H₂和H₃大于亲本P₁，P₂，而低亲子代L₁，L₂和L₃显著低于亲本(表 2)。对NUE和WUE 进行相关性分析，结果显示二者之间呈现显著负相关(R² =-0.652)，说明美洲黑杨叶片的WUE和NUE 存在一定的制约关系。

	图4 美洲黑杨亲本与杂种F1 叶片的氮素利用效率 Fig.4 Foliar nitrogen use efficiency ( NUE) of P． deltoides parents and F1 hybrids

杨树育种工作既利用性状分化，又常利用其亲本的遗传杂合性，通过杂交重组分化出具有不同基因型和表现型的杂交子代，这是在F₁代进行目的基因型选择的遗传基础。本研究中，美洲黑杨通过种内杂交获得了生长势截然相反的杂交子代，证实了亲本杂合性可用于杨树杂交育种。由于水分和养分对植物生长具有重要的意义，有必要对不同生长势的美洲黑杨杂种F₁代的同位素丰度和元素含量进行比较，揭示不同生长势的生物学机制。

植物叶片的δ¹³C 值反映叶肉细胞对CO₂的需求和CO₂通过叶片气孔扩散至叶片内部之间的平衡(展小云等，2012)。大量研究证明δ¹³ C 值和长期水分利用效率有密切关系，高水分利用效率品种育种已成为农作物育种目标之一，在林业中同样证实高δ¹³ C 值可以作为筛选高长期水分利用效率(long-term water use efficiency，WUEL)毛白杨(Populus tomentosa)和美洲黑杨的有效指标(赵凤君等，2005; 方晓娟等，2009)。本研究中超亲子代的δ¹³C 值显著高于低亲子代，说明其水分利用效率较低亲子代高。氮素是植物生长不可或缺的营养元素，是植物体内多种有机化合物的关键元素，也是遗传物质的基础，蛋白质、核酸、酶、叶绿素、维生素更离不开氮的参与(王勇等，2010)。低亲杂种F₁由于较超亲杂种F₁的氮素含量低，导致其叶绿素含量下降，光合作用减弱，从而生长较缓慢。同时美洲黑杨超亲杂种子代的δ¹³ C 同位素丰度和氮素含量都较高，为将来筛选高效水肥利用效率的无性系提供了理论依据。此外，由于树冠上层和中层的叶片δ¹³C值和N 含量均差异显著，而下层差异不显著，在将来多年生大树的δ¹³C 值和N 含量试验中可利用中层叶片的δ¹³C 值和N 含量代表整株林木的水平，以减少大树取样的工作量。

植物δ¹³C 值除受环境因子(纬度、年均温、水分可利用性)的影响外(李善家等，2011)，还受营养物质的影响(曹生奎等，2012)。植物叶片N 含量在某种程度上反映了叶片吸收和固定大气CO₂的能力，从而影响了δ¹³ C 值(Zhao et al., 2008)。(Sparks 等(1997))研究发现叶片氮浓度与光合能力呈显著正相关，氮有助于光合器官以及光合作用所必需的RuBP 羧化酶的合成，同时营养物的缺乏能造成更负的δ13 C 值和更低的瞬时水分利用效率(instantaneous water use efficiency，WUEi)。本研究显示美洲黑杨叶片的N 含量与δ13C 值呈极显著正相关，证明了这一观点。

植物叶片δ¹³C和碳氮含量存在空间分布差异。对水曲柳(Fraxinus m and shurica)、毛赤杨(Alnushirsuta)和黑榆(Ulmus davidiana)3 种落叶植物不同树冠高度叶片的δ¹³C 值进行研究，发现3 种植物顶层叶片的δ¹³ C 值均大于林下树丛叶片的δ¹³ C 值(Hanba et al., 1997); 美国北部落基山脉混交林中9 种针叶树种叶片的δ¹³C 值表现为从树冠的上部到下部逐渐减小(Duursma et al., 2006); 蒙古栎(Quercus mongolica)冠层上、下部叶片的单位叶面积C 含量与N 含量差异显著，但是冠层位置对N 的再吸收效率和利用效率无明显影响(程徐冰等，2011)。本研究对美洲黑杨不同冠层的叶片δ¹³C 值和碳氮含量比较分析发现，上层叶片δ¹³C 值和碳氮含量均最大，中层次之，而下层叶片δ¹³ C 值和碳氮含量最小。造成这种差异的原因可能主要是由于光照强度的不同，光合有效辐射从冠层上层到下层呈指数函数减少，周围的空气、温度、湿度随之变化，使得不同冠层形成不同的微气候环境，造成不同冠层具有不同的叶片结构、叶绿素含量等，从而造成叶片碳氮含量的不同; 同时这种差异导致不同冠层叶片的光合能力也不同，从而导致了δ¹³ C 值的差异(马永春等，2011)。

不同的植物对氮素的需要和利用率不同，即使在相同植物不同品系间也存在很大差异。刘希华等(2010)根据不同供氮水平下苗木年平均材积生长量将不同基因型欧洲黑杨(Populus nigra)划分为双高效型、高氮高效型、低氮高效型和双低效型4 种类型，并结合氮反应指数筛选出氮素利用效率高、生长表现优良、具较高育种价值的基因型。王勇等(2010)研究发现黑杨无性系在不同施氮量水平下光合能力显著不同。本研究中利用叶片C /N 表征叶片长期氮利用效率，它反映植物C 获取和同化率、N 分配和利用率的相对强弱(Chapin et al., 1989)。结果显示超亲杂种的NUE 极显著低于低亲子代。尽管超亲子代具有最高的C 含量和N 含量，但其对N 的利用速率远大于对C 的同化速率，最终导致C /N 较低; 而低亲子代与之相反，其对N 的利用效率低于对C 的同化速率，因此C /N 较高。

本研究中，美洲黑杨叶片的WUE和NUE 呈显著负相关，即超亲杂种F₁叶片的水分利用效率较高，氮素利用效率较低，而具有最低水分利用效率的低亲杂种其氮素利用效率却最高，说明不同生长势的美洲黑杨对能量的利用策略不同，超亲杂种对水分利用效率更高，而低亲杂种对氮素利用效率较高，植物不能同时对水分和氮素的利用效率达到最优，二者存在着制约关系。研究发现，羊草(Leymuschinensis)是在具有较低氮素利用效率的情况下拥有较高的水分利用效率(Chen et al., 2005)。展小云等(2012)对中国东部南北样带主要森林生态系统中不同优势植物叶片的水分利用效率和氮素利用效率进行研究，发现无论是在瞬时还是长期尺度上，植物对水分和氮素的利用均呈现负相关。

由于高大乔木取样较困难，本试验不能将养分利用效率分解为养分平均滞留时间、单位养分的生产力等更细致的研究; 此外本研究局限在叶片尺度上的水分利用效率，并没有代表植株个体水平。因此未来的研究工作重点应集中在高大乔木水分利用效率方法的研究，以及资源利用效率差异的分子机制。