2013, Vol. 49
文章信息
- 杨立宾, 宋瑞清, 邓勋, 李冲伟
- Yang Libin, Song Ruiqing, Deng Xun, Li Chongwei
- 哈茨木霉T28发酵液提取物对致病疫霉的抑菌作用及有效成分
- Active Components of Extracts from the Fermentation Liquid of Trichoderma harzianum Strain T28 and Their Inhibiting Activities to Phytophthora infestans
- 林业科学, 2013, 49(7): 118-122
- Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(7): 118-122.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130717
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文章历史
- 收稿日期：2012-08-27
- 修回日期：2013-01-14
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作者相关文章
2. 黑龙江省林业科学院森林保护研究所 哈尔滨 150040；
3. 黑龙江大学生命科学学院 哈尔滨 150080；
4. 黑龙江省农垦科学院 哈尔滨 150038
2. Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy Harbin 150040;
3. College of Life Science,Heilongjiang University Harbin 150080;
4. Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences Harbin 150038
致病疫霉(Phytophthora infestans)是活体营养型的致病卵菌，属假菌界(Kingdom Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)(林晓民等，2007)。致病疫霉主要侵染马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(S．lycopersicum)等50多种茄科植物(娜仁等，2008)。由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病，是造成粮食作物减产的最严重的真菌病害之一(杨艳丽等，2001)。
木霉(Trichoderma)属半知菌亚门(Deuteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)的黏孢菌类(Gloiosporae)，其有性阶段为子囊菌亚门(Ascomycotina)、肉座目(Hypocreales)、肉座科(Hypocreaceae)的肉座菌属(Hypocrea)。木霉广泛存在于土壤、空气、植物体内及体表，被认为是最有希望的生物防治因子(杨合同，2009 ; Samuels et al.，1996 ; 张衡宇，2011)。据不完全统计(杨春林，2009 ; Zimand et al.，1996 ; 陈方新等，2005)，木霉至少对18个属29种病原真菌在体外或体内表现有抑制作用。生物防治中应用最为广泛的木霉为哈茨木霉(Trichoderma harzianum)，其具有广谱性、广泛适应性和多机制性的抑菌特点(杨艳丽等，2001)。
国内外关于马铃薯晚疫病生物防治和哈茨木霉防治真菌性病害的研究主要集中在木霉菌株筛选、对致病疫霉的拮抗机制、分子生物学以及生物防治菌剂等方面，对哈茨木霉代谢产物抑制致病疫霉菌生长及其活性成分鉴定的报道较少或不够深入(Fakhouri et al.，2001 ; 杨怀文等，2000 ; 蓝希钳等，2003 ; 从心黎等，2005)。本课题组在前期研究中获得了对致病疫霉菌抑制效果较好的哈茨木霉菌株T28，本研究则以其发酵液乙酸乙酯提取物对致病疫霉菌进行抑菌试验，并初步分析其有效抑菌成分，为利用哈茨木霉防治马铃薯晚疫病以及生防制剂的开发提供依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料哈茨木霉菌株 T 28引进于以色列，致病疫霉菌株分离于黑龙江省农垦科学院马铃薯试验地，2个菌株均保存于东北林业大学。
1.2 试验方法 1.2.1 菌株 T 28的发酵培养将菌株 T 28接种到加富 PD 培养基(200 g 马铃薯、20 g 葡萄糖、3 g 磷酸二氢钾、 1.5 g 硫酸镁、 1 L 水)中，25 ℃、120 r·min-1培养7天，制成发酵液。
1.2.2 有效成分的提取1)直接提取法 发酵液乙酸乙酯提取物制备:将发酵液过滤除去菌体后，按发酵液∶乙酸乙酯 = 1:3(V/V)比例萃取3次后合并有机相，得到提取物，以X表示。提取物经旋转蒸发后，用5 mL 吐温- 80溶解。
2)分步提取法 发酵液乙酸乙酯分步提取物的制备: 将发酵液过滤除去菌体后，按发酵液:乙醇= 1:3(V/V)比例浸提3次后合并，50 ℃水浴、搅拌使之溶解。溶解后按溶液:石油醚(亲脂性部分，沸点为60 ℃)= 1:3(V/V)比例浸提3次后合并，用分液漏斗分离水层和脂层。水层进行下一步萃取，溶剂分别为乙醚(弱极性部分)、乙酸乙酯(中等极性部分)、正丁醇(中等偏大极性部分)，最后剩余水层部分(强极性部分)。各萃取液经浓缩，得到不同溶剂的提取物，分别表示为 A，B，C，D，E，并用吐温-80溶解。
1.2.3 抑菌活性检测1)提取物对致病疫霉菌丝生长的影响 采用平板表面涂抹法将各提取物溶液分别均匀涂抹在番茄燕麦平板培养基(200 mL 番茄汁、20 g 琼脂、20 g 蔗糖、50 g 燕麦、4 g 碳酸钙)表面，在平板中心接入直径为6 mm 致病疫霉菌片，以不涂抹提取物平板培养基上的菌片作为对照，置于20 ℃生化培养箱中黑暗条件下恒温培养。采用十字交叉法(王树桐等，2001)，每隔12 h 测量菌落横纵直径，每个处理重复3次。计算抑制率，计算公式如下:
| $ 抑制率 = \frac{{对照菌落直径-处理菌落直径}}{{对照菌落直径}} \times 100, $ |
2)提取物对致病疫霉孢子囊萌发的影响 采用凹载玻片孢子萌发法(Pappas et al.，1979)。取在番茄燕麦培养基上培养10天的致病疫霉菌，用毛刷将孢子囊刷至装有5 mL 无菌水的平板中，得到孢子囊悬浮液，将浓度调制在10 × 10倍显微镜视野下50个左右孢子囊。将孢子囊悬浮液与提取物(对照加入等体积的吐温- 80)按体积比1:1混合，将凹载玻片放入盛有湿润滤纸的无菌培养皿内，22 ℃恒温培养箱中黑暗培养24 h，每个处理重复3次，每个重复检查5个视野，在显微镜下观察孢子囊数及孢子囊芽管萌发状况，芽管生长长于孢子囊直径视为孢子萌发(孟艳等，2009)。计算孢子囊萌发率和各提取物对孢子囊萌发的抑制率，公式如下:
$ 孢子囊萌发率 = \frac{{孢子囊萌发数}}{{孢子囊总数}} \times 100, $
$ 相对抑制率 = \frac{{对照孢子囊萌发率-处理孢子囊萌发率}}{{对照孢子囊萌发率}} \times 100。 $
1.2.4 提取物对致病疫霉孢子囊释放游动孢子的影响4 ℃黑暗培养3 h，促进孢子囊释放游动孢子，其他方法同上。在显微镜下观察孢子囊总数和空孢子囊数，计算孢子囊释放游动孢子的平均百分率和提取物对游动孢子释放的抑制率，公式如下:
$ 孢子囊释放率 = \frac{{空孢子囊数}}{{孢子囊总数}} \times 100, $
$ 相对抑制率 = \frac{{对照孢子囊释放率-处理孢子囊释放率对照孢子释放率}}{{对照孢子释放率}} \times 100, $
1.2.5 乙酸乙酯提取物活性成分的鉴定采用气质联用仪(GC-MSD 6890 N-5973 insertAgilent，NIST02谱库)测定。色谱条件 : 毛细管色谱柱 DB -17 MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，汽化室温度260 ℃，载气氦气，柱流量1 mL·min -1，不分流进样，进样量1 μL。柱温 : 60 ℃保留4 min，以10 ℃·min -1升至150 ℃并保留2 min，以5 ℃·min -1升至260 ℃并保留15 min，不分流进样，进样量1 μL。 GC -MSD 接口温度280 ℃，质谱条件 : 电离源 EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，扫描范围15~500 u。
2 结果与分析 2.1 不同提取物对致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发及孢子囊释放游动孢子的影响不同提取物对致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发及孢子囊释放游动孢子均有抑制作用(表 1)。抑制效果较好的有C，D，X 3组，对菌丝生长抑制率和孢子囊萌发相对抑制率分均超过60% 以上，孢子囊释放游动孢子相对抑制率均超过70% 。3组提取物对菌丝生长、孢子囊萌发和孢子囊游动孢子释放的抑制作用与对照相比存在显著性差异。C和X 2组之间无显著性差异。
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用气相色谱质谱联用技术对提取物 C和X 进行分析，分别得到10和15个组分，所得质谱图经NIST02质谱数据库检索并与标准图谱核对，鉴定其组分。提取主要化学组分包括酯类、吡嗪、酮类、烯酸和酚类化合物，其名称及相对含量见表 2，3 。 C和X 中相同的化合物为2，5- 二叔丁基酚、邻苯二甲酸二叔丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、十八碳酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸单(2- 二乙基己基)酯。
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采用哈茨木霉菌株 T 28发酵液不同有机溶剂提取物以及不同提取方式的乙酸乙酯提取物对致病疫霉进行抑菌活性研究，结果表明: 各提取物对致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发、孢子囊释放游动孢子均有不同程度的抑制效果。其中，抑制效果较好的是乙酸乙酯和正丁醇提取物，不同提取方式的乙酸乙酯提取物抑菌效果之间无显著性差异。由于正丁醇沸点为117.25 ℃，在旋转蒸发仪上不宜蒸干，因此选择对抑菌效果较好的乙酸乙酯提取物进行 GC-MS 分析，结果表明不同提取方式获得的乙酸乙酯提取物，其组分和含量均不相同，其中乙酸乙酯直接提取的提取物含有15个组分，分步提取的提取物含有10个组分。采用分步提取法获得的活性成分抑菌效果更好，菌丝生长抑制率为67.06 %，孢子囊萌发相对抑制率为71.71 %，游动孢子释放相对抑制率为76.25 % 。
C，X 2组活性成分的抑菌率均较高且差异不显著，由此推测抑菌成分可能是它们的的共有组分，其中包括2，5- 二叔丁基酚、邻苯二甲酸二叔丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯、十八碳酸甲酯、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸单(2- 二乙基己基)酯(MEHP)。有研究发现邻苯二甲酸酯类具有抑菌作用和他感作用。 耿广东等(2009)发现辣椒(Capsicum sp．)根系分泌物具有化感作用的物质，包括邻苯二甲酸二叔丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯。田光辉等(2009)研究了糙苏(Phlomis umbrosa)花中挥发油成分的抑菌作用，发现其对肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)32201株和肠炎沙门菌(Salmonella sp．)50040株表现出较好的抑菌性，而其抑菌成分中含有邻苯二甲酸二叔丁酯、邻苯二甲酸二异丁酯。别聪聪等(2011 ; 2012 )发现邻苯二甲酸二异丁酯、邻苯二甲酸二丁酯和邻苯二甲酸单(2- 二乙基己基)酯均具有抑菌或化感作用，能够使中肋骨条藻(Skeletonema costatum)致死或诱导短裸甲藻(Gymnodinium breve)ROS 的积累，产生氧化损伤导致细胞死亡。 金亚南(2010)发现紫茎泽兰(Eupatorium adeophorum)根系分泌化感物质邻苯二甲酸二丁酯在中低浓度下(50，50，200 mg·L -1)对有机磷细菌的生长有促进作用，而在高浓度下(500，1 000 mg·L -1)有抑制作用，而且 DBP 能使有机磷细菌的对数生长期提前，进而加快有机磷细菌群体的增殖。 董昆明等(2011)发现广玉兰(Magnolia grandiflora)叶片浸提液对铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)增殖具有抑制作用，其活性成分中含有 MEHP，含量为31.69 % 。 万旭英等(2010)发现 MEHP 对体外大鼠(Rattus norregicus)卵泡发育作用明显，明显损害卵泡发育和分化，具有雌性生殖毒性。李强等(1999)在鼠尾草(Salvia farinacea)的药用成分中发现其含有十八碳酸甲酯。目前有关化合物2，5- 二叔丁基酚对生物体作用的研究尚未见报道。
本研究对不同提取方式的2组发酵液提取物进行抑菌试验并进行 GC-MS 分析，发现其对致病疫霉的抑菌性较强并含有6种相同组分; 其中有些组分的作用已有报道，其它组分是否具有抑菌作用，以及抑菌机理、在农林业上的应用，还有待深入研究。
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