2013, Vol. 49
文章信息
- 杨杞, 张涛, 王颖, 李高, 尹佳佳, 韩晓敏, 齐力旺, 李国婧, 王瑞刚
- Yang Qi, Zhang Tao, Wang Ying, Li Gao, Yin Jiajia, Han Xiaomin, Qi Liwang, Li Guojing, Wang Ruigang
- 干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库构建及CkWRKY1基因克隆
- Construction of a Suppression Subtractive Hybridization Library of Caragana korshinskii Under Drought Stress and Cloning of CkWRKY 1 Gene
- 林业科学, 2013, 49(7): 62-68
- Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(7): 62-68.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130709
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文章历史
- 收稿日期：2012-10-09
- 修回日期：2013-02-21
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作者相关文章
2. 北京市颐和园管理处 北京 100091;
3. 中国林业科学研究院林业研究所 北京 100091
2. Beijing Summer Palace Management Office Beijing 100091;
3. Research Institute of Forestry, CAF Beijing 100091
柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)，落叶灌木，欧亚大陆特有种，广泛分布于我国西北部地区及蒙古、中亚地区(牛西午，2003)。柠条锦鸡儿是我国西北干旱荒漠地区重要的饲用灌木，同时具有巨大的生态价值，是植树造林的优良树种(杨洪晓等，2010)。
柠条锦鸡儿抗旱、抗寒、耐热、耐盐碱和贫瘠，因此对其抗逆性的研究一直是热点。过去对柠条锦鸡儿抗逆的研究主要集中在生理机制上(杨文斌等，1997;王志会等，2007;李彦瑾等，2008;徐当会等，2012)，而近几年利用分子生物学技术对其分子机制的研究逐渐增多。郭九峰等(2012)构建了水分胁迫下柠条锦鸡儿叶片均一化全长cDNA文库，王文芳(2010)构建了冷胁迫下柠条锦鸡儿差减杂交文库。一些抗逆相关基因也逐渐被克隆，有研究表明CkDREB基因明显被高盐、脱水和低温诱导，过表达转基因烟草(Nicotiana tabacum)的抗逆性明显增强(Wang et al.，2010)。此外，柠条锦鸡儿GME基因、NCED4基因也已经得到克隆并证明被干旱等非生物胁迫诱导(王美珍等，2009;王学敏等，2010)。因此寻找柠条锦鸡儿抗逆相关基因，并对其功能进行研究，有助于探讨柠条锦鸡儿抗逆境的分子机制，而且可能具有广阔的应用前景。
植物在遭受生物胁迫与非生物胁迫时，体内转录组会发生很大的变化，其中一部分转录因子被激活，进而调控一些下游防御反应基因的表达(李冉等，2011)。WRKY转录因子是在植物中发现的一类锌指型转录因子基因家族，因在其序列中含有高度保守的“WRKYGQK”氨基酸序列而得名(秦伟等，2010)。近年来的研究显示，WRKY转录因子参与了植物抗生物胁迫和抗非生物胁迫过程。当植物受到非生物胁迫时，如在干旱、冷冻、盐、低温及创伤等逆境条件下，一些WRKY转录因子被诱导表达。例如，对水稻(Oryza sativa)的103个WRKY转录因子在不同非生物胁迫(冻害、干旱、盐害)下的表达情况进行分析，结果发现其中的54个基因在不同的非生物胁迫下会诱导表达(李冉等，2011;Ramamoorthy et al.，2008);而拟南芥(Arabidopsis thaliana)中过量表达大豆(Glycine max)GmWRKY54后则增强了抗旱、抗盐及抗冷能力(Zhou et al.，2008)。
为了挖掘柠条锦鸡儿抗旱相关基因，本研究构建了干旱胁迫下柠条锦鸡儿抑制性差减杂交(suppression subtractive hybridization，SSH)文库，在对其进行测序分析后得到了大量干旱胁迫相关的EST序列;通过RACE技术克隆了其中1个WRKY转录因子编码基因的cDNA全长，并发现该基因在干旱处理时表达量明显上调。
1 材料与方法 1.1 植物材料与处理方法柠条锦鸡儿种子由鄂尔多斯林业研究所提供。种子播种于装有蛭石的培养钵中，置于25 ℃、16 h光照/8 h黑暗、光照强度7 000～8 000 lx条件下培养。取苗龄1个月小苗用于试验。
从培养钵小心取出柠条锦鸡儿苗，蒸馏水冲洗干净，尽量避免造成损伤。吸水纸吸干净水，在原生长环境中放置3 h进行干旱处理，未处理的柠条锦鸡儿苗作为对照。分别剪取对照和处理柠条锦鸡儿苗的叶片置于50 mL离心管中，液氮速冻，保存于-80 ℃冰箱作为构建文库样品备用。该处理样品同时做RACE克隆。
同样的方法处理柠条锦鸡儿苗，分别取干旱处理0，1，2，4，8，12 h样品做基因表达检测。每个处理重复3次。
1.2 总RNA的提取和mRNA的分离纯化采用TRIzol(Invitrogen)法提取柠条锦鸡儿叶片总RNA。总RNA溶于DEPC处理水中，用DnaseⅠ(TaKaRa)37 ℃处理30 min，去除DNA的干扰。1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，用微量紫外检测仪Beckman DU 800对RNA进行浓度、纯度测定。
mRNA纯化采用QIAGEN公司mRNA纯化试剂盒(Qiagen mRNA midi kit)，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。
1.3 文库的构建与分析依照PCR-SelectTM cDNA Subtraction Kit(Clontech)说明书进行文库构建。以干旱处理的柠条锦鸡儿样品作为Tester，未处理的柠条锦鸡儿样品作为Driver。经过cDNA双链合成、RsaⅠ酶切、连接接头、差减杂交和2次选择性PCR后，将第2轮PCR产物与pMD19T Vector(TaKaRa)载体连接，转化到感受态大肠杆菌(Escherichia coli)TOP10(天根)细胞中，经蓝、白斑筛选，挑取白色单克隆，在含有Amp抗性的LB培养基中37 ℃过夜摇菌。以菌液为模板、试剂盒中提供的巢式引物进行PCR扩增验证重组子。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，挑选有清晰单一条带的阳性克隆，将对应菌液送北京华大基因有限公司(BGI)测序。
1.4 CkWRKY1基因的克隆和序列分析根据文库中获得的WRKY转录因子的序列，用Primer Premier5.0设计RACE引物，以柠条锦鸡儿cDNA为模板进行5'RACE扩增。具体操作步骤按5'- RACE试剂盒(TaKaRa公司)说明书进行。将扩增到产物连入pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态，菌落PCR及酶切验证后，菌液送华大基因有限公司(BGI)测序。将5'-RACE获得的序列与文库中得到的已知序列用Vector NTI 10.0进行拼接，得到全长cDNA序列。根据RACE拼接得到的序列设计特异性全长引物F-CkWRKY1和R-CkWRKY1，利用高保真酶PrimeSTAR(TaKaRa公司)进行PCR扩增验证拼接序列。扩增条件:98 ℃预变性1 min;98 ℃变性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min 30 s，30个循环;72 ℃补充延伸10 min。扩增产物连入平末端载体pEASY-BluntCloning Vector(全式金公司)，转化大肠杆菌DH5α感受态，菌落PCR及酶切验证后，菌液送华大基因(BGI)测序。
对CkWRKY1基因进行序列分析。利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)进行序列比对分析，用ORF finder工具(http://wncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.htww.ml)分析开放阅读框。利用ExPASy的Compute pI/MW(http://web.expasy.org/compute_pi/)进行分子质量、等电点等理化性质的分析，GOR IV(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage=npsa_gor4.html)进行二级结构分析。
1.5 荧光定量PCR根据RACE拼接获得的基因的cDNA全长序列，用Primer Premier5.0设计荧光定量PCR引物F-CkWRKY1-rt、R-CkWRKY1-rt。使用SYBR® GreenⅠ荧光染料法，在LightCycler480(Roche Diagnostics)实时荧光定量PCR仪上对柠条锦鸡儿干旱胁迫处理下的CkWRKY1基因转录表达水平进行分析。根据SYBR® Premix Ex TaqTM(TaKaRa)试剂盒说明书配制反应体系，每个反应3次重复。反应体系中含有10 μL SYBR® Premix Ex TaqTM，引物各1 μL(5 μmol·L-1)，稀释的cDNA模板5 μL，灭菌水3 μL，总体系20 μL。反应程序为95 ℃预变性30s;95 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。反应结束后做溶解曲线分析。柠条锦鸡儿actin(FJ485727)作为内参基因，2-△△Ct法分析数据。
本试验所用全部引物见表 1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
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对样品的总RNA及纯化的mRMA质量检测结果显示满足文库构建要求。反转录效果、酶切效果、接头连接效率、消减效率和菌落PCR阳性率检测的结果表明各项指标均符合试验要求。
图 1是文库构建中2轮PCR电泳结果。可以看出，第1轮扩增后差减cDNA、未差减cDNA为模板都只能看到轻微的弥散带(1，2泳道)，经过第2轮扩增后才可以看到明显的弥散带，大小范围下移，而且亮度增加(3，4泳道)。PCR产物条带主要集中在250～750 bp。说明cDNA的差减效果较明显，富集了干旱诱导表达cDNA片段。
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图 1 差减杂交后第1轮、第2轮PCR电泳结果
Fig. 1 Analysis of the PCR products after subtraction
M: 1 kb DNA marker;1，2．未差减样品的第1轮及第2轮PCR产物The first and the second round of PCR products unsubtracted respectively;3，4．差减样品第1轮及第2轮PCR产物 The first and the second round of PCR products after subtraction respectively. |
第2轮PCR产物克隆转化后，菌液PCR鉴定结果显示插入片段大多在250～750 bp，阳性率90%以上，共获得1 359个阳性克隆。以上结果表明，以干旱处理及未处理的柠条锦鸡儿叶片为材料，成功构建了差减杂交文库。
2.2 柠条锦鸡儿SSH文库EST序列分析测序的1 359个阳性克隆中，除去73条低质量的EST序列(去除载体序列后长度小于100 bp)后，共获得1 286条高质量的ESTs序列。这些EST序列未去除载体序列的测序平均读长是851 bp，去掉载体序列后的平均长度是475 bp，足够的序列长度保证了后期能够较容易地克隆相关基因。将这些EST序列拼接后获得Unigenes 645条，其中Contigs226条，Singlets 419条，冗余度48.84%。拼接后得到的645条Unigenes平均长度是518.8 bp，比未拼接时平均长度略有增加。
将这些Unigenes序列在NT库和NR库进行Blast比对(e值设置为1e-5)注释后发现，仅13条序列未得到注释，632条序列得到注释，得到注释的序列中119条功能未知。已知功能的EST序列涉及到信号转导、转录、植物抗逆性反应、光合作用、代谢与能量、蛋白质合成与转运和氧化胁迫等相关基因。提交获得的EST序列到GenBank获得的部分登录号为JZ167376，JZ167377，JZ167378，…，JZ167772。
通过COG分析可以把EST序列归入对应的COG家族，可以明确它们在细胞生理过程、信号存储与加工和各类代谢中的作用。将比对结果阈值低于1e-05的225条Unigenes进行功能分类，结果如表 2所示。利用COG对Unigenes功能分类后显示这些序列比例前3位的是翻译后修饰、蛋白转运、分子伴侣相关基因，翻译、核糖体结构相关基因和氨基酸转运、新陈代谢相关基因，分别占到全部EST序列的18.67%、12.44%和11.56%。从表 2可以看到，在受到干旱胁迫后，柠条锦鸡儿表达了大量与能量代谢与物质代谢相关的基因。蛋白质、糖类、脂类和核苷酸类物质的转运、代谢相关的EST序列约占到总数30%以上。这些物质代谢相关的基因为细胞提供了大量的渗透调节剂，维持细胞的渗透平衡，比如大量的LEA蛋白、水通道蛋白及富含脯氨酸的各类蛋白。同时，能量代谢为这些物质的运输提供了所需能量。另外，经COG分析的225条Unigenes中，信号转导相关基因共11条，占到总序列的4.89%，这类基因虽然数目较少，但是大多是各类激酶和转录因子，对下游功能蛋白的表达起着关键的调控作用，推测它们与柠条锦鸡儿抵抗干旱胁迫的机制密切相关。
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在构建好的柠条锦鸡儿干旱胁迫SSH文库获得的645条Unigenes中，找到1个WRKY转录因子编码序列。为了检测这个WRKY基因是否确实受到干旱胁迫的诱导，并进一步探讨它的功能，研究它在柠条锦鸡儿抵抗干旱胁迫中的作用，通过RACE技术克隆了这条WRKY转录因子的cDNA全长。
文库中得到WRKY基因序列长854 bp，经Blast及与其他植物WRKY基因序列比对后，发现该序列已经包含了基因的终止密码子和部分3'UTR，因此只需5' RACE便可以得到基因的cDNA全长。利用5' RACE引物CkWRKY1-5'OU、CkWRKY1-5' IN，克隆获得了776 bp的5'-RACE片段，将测序获得的5'-RACE序列及已知的中间片段序列拼接后得到1 374 bp的全长cDNA序列。以特异性引物F-CkWRKY1和R-CkWRKY1对该基因进行扩增，测序后得到的序列与RACE拼接结果完全一致，说明通过拼接获得的基因全长是正确的。将克隆到的柠条锦鸡儿WRKY基因命名为CkWRKY1并提交到GenBank，登录号为JX987095。如图 2所示，CkWRKY1基因cDNA全长1 374 bp，具有993 bp的开放阅读框，起始密码子ATG，终止密码子TAA，此外还有142 bp的5'调控区，236 bp的3'非编码区。该基因编码含有330个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列中第183个氨基酸到第189个氨基酸是一个WRKY转录因子家族共有的保守序列“WRKYGQK”，属于第Ⅱ类WRKY转录因子。Blast显示CkWRKY1与大豆的WRKY78及拟南芥的AtWRKY18氨基酸相似度分别达到70%和45%。用ExPASy的Compute pI/MW进行预测表明，CkWRKY1基因编码的蛋白质分子质量为36.79kDa，等电点8.28。利用GOR4对该推导蛋白进行二级结构预测发现α-螺旋占25.15%、β-折叠占13.33%、无规则卷曲占61.52%。
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图 2 CkWRKY1基因的全长cDNA序列及推导的氨基酸序列
Fig. 2 Full-length cDNA and deduced amino acid sequences of CkWRKY1
方框中是“WRKYGQK”保守序列，下划线部分是特异引物所在位置，小写字母表示非编码区。 Sequence in the box is“WRKYGQK”conservative sequence，the underlined part is the location of specific primers and lowercase letters indicate the non-coding region. |
为了检测CkWRKY1基因是否参与柠条锦鸡儿对干旱胁迫的响应，以干旱处理和未处理的柠条锦鸡儿幼苗作为材料，通过实时荧光定量PCR技术对干旱胁迫下CkWRKY1基因的转录水平表达进行分析。研究结果表明，受到干旱胁迫后CkWRKY1的mRNA表达水平迅速上升，1 h就达到对照的20倍。处理2 h时该基因表达水平达到最高，是对照的40多倍，之后逐渐下降，但直到12 h时仍维持高于对照的水平，如图 3所示。这说明CkWRKY1确实受到干旱胁迫的诱导。
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图 3 qRT-PCR检测干旱胁迫下CkWRKY1基因的表达
Fig. 3 The expression of CkWRKY1 after drought treatment by qRT-PCR
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SSH技术自发明以来被广泛应用于植物差异表达基因的分离，成为分离差异基因的一种常用的技术，在很多植物中都得到了应用(Leelatanawit et al.，2008;Norelli et al.，2009;冯健等，2010;Hirao et al.，2012)。本研究利用SSH技术成功构建了柠条锦鸡儿叶片干旱胁迫下的差减杂交文库，在获得的645条Unigenes基因中，与抗旱直接相关的基因包括LEA蛋白编码基因、DHN蛋白编码基因、各类激酶和转录因子相关基因，另外还有水通道蛋白基因、光合作用相关基因、泛素类蛋白基因、抗氧化胁迫相关基因等等。对文库中EST序列功能分类的分析显示，柠条锦鸡儿对干旱胁迫的响应涉及到体内各类物质的代谢、能量代谢、信号转导和物质运输等多个方面，具有复杂的分子机制。柠条锦鸡儿生长于干旱荒漠地区，适应了干旱、寒冷和盐碱等逆境条件，柠条锦鸡儿干旱胁迫下叶片差减文库的构建为研究其抗旱的分子机制，挖掘利用抗旱相关基因提供了序列信息。
干旱胁迫引起植物细胞缺水，使细胞的水分平衡紊乱，影响植物的正常生长甚至导致死亡。为了应对干旱胁迫，植物表达了一系列抗旱相关基因保护植物的基本生理功能，其中包括一系列的转录因子。WRKY转录因子作为一类重要的转录因子，参与植物多种非生物胁迫的途径中，如干旱(Pnueli et al.，2002)、低温(Huang et al.，2002)、创伤(Guo et al.，2004)等。本研究构建的干旱胁迫下柠条锦鸡儿叶片SSH文库中的EST序列中，包括了MYB、bZIP、WRKY、NAC和bHLH各类转录因子。本研究选择了其中1条WRKY基因片段，通过RACE技术克隆到了1 374 bp的cDNA全长，命名为CkWRKY1。与大豆及拟南芥相关WRKY转录因子的比对及保守序列的分析显示CkWRKY1属于第Ⅱ类WRKY转录因子。利用实时荧光定量PCR技术检测在干旱胁迫下该基因的表达，发现CkWRKY1基因转录表达水平在干旱胁迫后明显上升，并持续保持高水平表达，这说明CkWRKY1可能参与到柠条锦鸡儿抗旱的分子机制中。这些结果为今后进一步研究柠条锦鸡儿CkWRKY1基因的功能奠定了基础。
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