白桦酯醇(betulin)是具有羽扇豆烷型结构的五环三萜类化合物，分子式为R＝CH₂OH。白桦酯醇与白桦酯酸(betulinic acid)具有相同的五环三萜骨架，是白桦酯酸合成的前体化合物。目前，白桦酯酸主要通过白桦酯醇的半合成获得(范桂枝等，2008)。近年来的研究表明，白桦酯醇、白桦酯酸具有镇咳祛痰、清热利湿、消肿解毒、提高机休免疫力、降血脂等作用，更重要的是白桦酯酸作为天然药物在抗肿瘤和抗HIV等活性上显示出了靶向作用性更强，几乎无不良反应等特点(Suresh et al.，2012;Kommera et al.，2011;Chintharlapalli et al.，2007)。

对白桦酯醇、白桦酯酸提取和测定的研究发现，白桦酯酸在植物中含量极低，仅为0.084%(Zhao et al.，2007)，而白桦酯醇在植物中含量较高，特别是在白桦(Betula platyphylla)树皮中含量达132.45～257.11 mg·g^-1(范桂枝等，2007)。由于白桦自然资源有限，从白桦树皮中提取和分离白桦酯醇不仅造成白桦资源的破坏，而且作为新型药剂的临床研究，特别是推广应用的数量受到限制。

白桦酯醇和齐墩果酸等三萜物质可以在白桦愈伤组织中积累(范桂枝等，2007;2011;Fan et al.，2010)，同时，从多种白桦内生真菌中筛选到了有效提高三萜积累的真菌诱导子种类，并优化了其诱导条件(Zhai et al.，2011，翟俏丽等，2011)。而真菌诱导子诱导次生代谢物合成是一个复杂的生物学过程，受众多内源信号分子调控。过氧化氢(H₂O₂)被认为是真菌诱导子诱发植物细胞防卫反应的主要胞内信使物质之一(徐茂军等，2006)，H₂O₂是否介导真菌诱导子诱导白桦酯醇积累的研究还未见报道。本文分析外源H₂O₂和真菌诱导的内源H₂O₂对白桦酯醇积累的调控作用，不仅证实H₂O₂对白桦酯醇的调控作用，而且对理解真菌诱导子诱发植物次生代谢产物合成的信号转导机制具有重要意义。

产白桦酯醇的白桦悬浮细胞系由本实验室选育。悬浮细胞的培养基为NT附加0.1 mg·L^-1 6-benzyladenine(6-BA)和0.01 mg·L^-1 thidiazuron(TDZ)以及20 g·L^-1蔗糖，灭菌前调pH 5.5～6.0。250 mL摇瓶中盛有100 mL培养液，每瓶接种4 g鲜质量的愈伤组织，培养温度为25～27 ℃，光照强度为2 000 lx，光照16 h·d^-1，摇床转速为120 r·min^-1。试验中所用的白桦悬浮细胞已经过50～60次继代培养，具有稳定的形态特征和生长速率。

将0(CK)，0.1和1 mmol·L^-1无菌的H₂O₂溶液添加到培养8天的白桦悬浮培养体系中，在处理后12，24，48和96 h取样测定白桦悬浮细胞的活力、干质量和白桦酯醇的含量。对照加入等体积的无菌水，每种处理重复3次。添加的H₂O₂溶液采用无菌的0.45 μm微孔滤膜进行过滤除菌。

将白桦内生真菌的菌丝在PDA液体培养基中发酵培养10天，将菌体匀浆，121 ℃高压灭菌20 min后作为真菌诱导子加入白桦悬浮培养液中，诱导子质量浓度以糖质量浓度表示，以葡萄糖为标准，用蒽酮比色法测定(李合生，2000)。

将40 μg·mL^-1拟茎点霉真菌诱导子添加到培养8天的白桦悬浮培养体系中，在处理24 h后分析白桦悬浮细胞的活力和三萜含量(翟俏丽等，2011)，对照加入等体积的无菌水，每种处理重复3次。

CAT溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤除菌后添加，使其终浓度为2 mkat·L^-1，在添加清除剂后20 min添加真菌诱导子，对照加入等体积无菌水，每种处理重复3次。

将收获的白桦悬浮细胞烘干、研磨，取0.5 g用盐酸-乙醇溶液(配比为2:8)25 mL浸泡过夜，加热回流3 h，过滤，水浴浓缩提取液，再用乙醚萃取提取液3次，萃取液经旋转蒸发仪回收溶剂，得到白桦酯醇粗品，再用甲醇溶解并定容，取定容液1 mL，并将其用0.45 μm滤膜过滤作为样品检测液。

色谱条件检测条件为:色谱柱HiQ sil C18V4.6 mm×250 mm;流动相乙腈(乙腈与水体积比4:1);柱温25 ℃;灵敏度16AUFS;流速1.0 mL·min^-1;检测波长210 nm，进样20 μL(范桂枝等，2007)。白桦酯醇与其他组分完全分离，保留时间合适，峰形好(图 1)，适合定量分析。

	图 1 白桦酯醇的色谱 Fig. 1 HPLC chromatogram of betulin in B. platyphylla

以白桦酯醇为对照品做标准曲线。以白桦酯醇质量浓度(Y)为纵坐标，吸光度值(A)为横坐标，得回归方程Y=0.000 000 3X+0.003，相关系数R²=0.999 6，在2.0～8.0 g·L^-1具有良好的线性关系。

取白桦悬浮细胞鲜样0.20 g，加入2.5 mL现配的0.4%氯化三苯四氮唑(TTC)，再加入2.5 mLPBS缓冲液(pH7.0)，常温下暗处理14 h。去除上清溶液，用5 mL蒸馏水清洗细胞，待细胞沉淀静止后，吸去上清再次洗涤细胞，共重复3次。用5 mL95%乙醇脱色处理，于60 ℃水浴30 min，每隔5 min轻晃倒置试管摇匀。待细胞沉淀后用紫外分光光度计测定上清溶液的OD值，OD值大则细胞活力强(王博等，2008)。

H2DCF-DA(carboxy-2，7-dichlorodihydrofluoresceindiacetate)购自Sigma公司，将待测细胞用蒸馏水清洗，加入H2DCF-DA使其终浓度为50 μmol·L^-1，避光放置于26 ℃下孵育2 h，取出后使用pH7.4的Tris-HCl洗掉细胞表面的荧光探针，利用荧光显微镜的激发滤光片波长488 nm，阻断滤光片波长515nm观察，每个试验重复5～10次(张小莉等，2009)。

将0.1和1 mmol·L^-1 H₂O₂分别添加到培养8天的白桦悬浮培养体系中，分析H₂O₂处理对白桦悬浮细胞活力、干质量和白桦酯醇含量的影响(图 2)。0.1和1 mmol·L^-1 H₂O₂处理均降低白桦细胞的活力和干质量的积累量，并且均随H₂O₂处理时间的延长降低幅度增大。其中，1 mmol·L^-1的H₂O₂比0.1 mmol·L^-1 H₂O₂降低幅度大，H₂O₂处理96 h，白桦细胞活力和干质量分别降低61.02%和25.16%。对白桦酯醇含量的分析发现，1 mmol·L^-1 H₂O₂处理12 h后，白桦酯醇含量比对照增加了89.45%，而后随着处理时间的延长降低至对照水平。0.1 mmol·L^-1 H₂O₂处理后白桦酯醇含量呈先增加后降低趋势，在处理后24 h增加率最高，比对照增加73.72%。

	图 2 外源H2O2对白桦悬浮细胞活力、干质量和白桦酯醇含量的影响 Fig. 2 Effect of H2O2 on cell viability，dry mass andbetulin content in cells of B. platyphylla

DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解生成二氯荧光素(DCFH)。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，因此DCF荧光强弱反应细胞内H₂O₂的含量。白桦细胞中H₂O₂的荧光强度随真菌处理时间的延长先增强后减弱，其中，细胞内H₂O₂的荧光强度在真菌处理12和24 h后，分别比对照增加了517.18%和391.67%(图 3)。由此可见，真菌诱导后白桦悬浮细胞中H₂O₂的含量增加。而在真菌诱导前20 min添加H₂O₂清除剂过氧化氢酶(CAT)后，细胞中的H₂O₂的荧光强度从真菌诱导后的74.39降低到20.01，但仍高于对照水平。

图 3 真菌诱导子对白桦悬浮细胞中H2O2荧光强度的影响 Fig. 3 Effect of fungal elicitor on fluorescence intensity of H2O2 in cells of B. platyphylla A～D为真菌处理12，24，48和96 h，E为真菌处理+CAT，F为对照;不同字母表示差异显著(P＜0.05，Tukey分析)。 Figures in the diagram for the optical density，A～D is for 12，24，48 and 96 h afterfungal treatment，E is fungal treatment+CAT，F is control. Different letters showsignificant differences between means(P＜0.05，Tukey test).

由图 3和翟俏丽等(2011)可知，真菌诱导子处理后白桦悬浮细胞中H₂O₂含量和白桦酯醇含量均增加了，且白桦酯醇含量在24 h时达最高值，因此H₂O₂介导真菌诱导子促进白桦酯醇积累的研究选择真菌诱导子处理24 h。

真菌诱导子处理24 h后，白桦悬浮细胞的活力比对照降低27.63%，而在真菌诱导子处理前20 min添加H₂O₂的清除剂过氧化氢酶(CAT)，白桦悬浮细胞的活力比真菌诱导后增加12.66%。真菌诱导子使白桦酯醇积累增加的185.22%，却被添加的CAT降低了35.96%(图 4)。

	图 4 真菌诱导子对白桦悬浮细胞活力和白桦酯醇含量的影响 Fig. 4 Effect of fungal elicitor on cell viability andbetulin content in cells of B. platyphylla 不同字母表示差异显著(P＜0.05，Tukey分析)。 Different letters show significant differencesbetween means(P＜0.05，Tukey test).

H₂O₂是植物体内一种常见的信号分子，在植物生长发育和抗逆过程中起重要作用。H₂O₂和次生代谢物的累积均是植物逆境下的表征，二者是否有关联呢?杨芳等(2011)研究发现，10 μmol·L^-1H₂O₂处理下丹参(Salvia miltiorrhiza)细胞中丹参酚酸比对照组的增加了2.43倍，方芳等(2009)发现外源H₂O₂只引起茅苍术(Atractylodes loncea)细胞中苍术醇和β-桉叶醇量的增加，而对其他的挥发油积累没有促进作用。而本研究发现，外源H₂O₂促进白桦酯醇的积累，1 mmol·L^-1 H₂O₂处理12 h，白桦酯醇含量比对照增加89.45%，0.1 mmol·L^-1H₂O₂处理24 h比对照增加73.72%。由此可知，外源H₂O₂对次生代谢物积累的影响存在种类效应、浓度和时间效应。

真菌诱导子是来源于真菌的一种特定化学信号，在植物与真菌的相互作用中，能快速、高度专一和选择性地诱导植物特定基因的表达，进而活化特定次生代谢途径，积累特定目的次生产物(张莲莲等，2006)。目前对真菌诱导子诱发植物细胞中次生代谢产物合成积累的信号转导等分子机制尚不十分清楚。一般认为真菌诱导子作为一种胞外刺激物，首先与植物细胞膜上的特定受体识别并结合，进而促进细胞产生一些特定的胞内信使物质并通过相应的信号转导途径调控细胞核中相关基因的表达，最终激活细胞中的防御性次生代谢系统。H₂O₂的迸发是植物细胞在各种生物及非生物逆境胁迫下普遍出现的特征性反应之一，H₂O₂被认为是真菌诱导子诱发植物细胞防卫反应的主要胞内信使物质之一(徐茂军等，2006)。本研究将真菌诱导子添加到白桦悬浮体系中，发现白桦细胞中H₂O₂的荧光强度和白桦酯醇含量均增加，而在真菌诱导子与H₂O₂清除剂(CAT)共同处理下，白桦悬浮细胞中白桦酯醇含量和H₂O₂的荧光强度均低于真菌诱导处理的，由此可见，由真菌诱导子诱发产生的H₂O₂是白桦细胞中白桦酯醇合成积累所必需的信号分子，这与方芳等(2009)的研究一致，即内源H₂O₂介导了内生真菌AL4粗诱导子促进茅苍术悬浮细胞挥发油的合成，这初步证明H₂O₂参与了真菌诱导子促进白桦酯醇积累的过程。

另外，笔者发现真菌诱导子虽然促进白桦酯醇的合成，却抑制了白桦细胞的生长。在本试验中，外源H₂O₂的添加降低白桦细胞的活力和干物质的积累量，而真菌诱导子处理后细胞生长的抑制可被添加的CAT部分缓解，因此推断，真菌诱导子激发的H₂O₂是抑制细胞生长的因子之一。

本试验结果同时表明，H₂O₂的清除剂CAT虽然可以抑制真菌诱导子处理后白桦酯醇的积累，但不能完全阻断真菌诱导子对白桦酯醇积累的促进作用，说明虽然H₂O₂是介导真菌诱导子促进白桦酯醇积累的信号分子，但不是唯一的信号分子，这同时也暗示真菌诱导子促进植物次生代谢物积累的复杂性，需要检测更多的信号分子来揭示其诱导合成代谢物的机制。

综上所述，本试验利用药理学试验推断H₂O₂参与真菌诱导子诱导白桦酯醇积累的过程，H₂O₂如何介导真菌诱导白桦酯醇合成的机制还有待于进一步研究。