广玉兰(Magnolia grandiflora)，又名洋玉兰、荷花玉兰，属木兰科(Magnoliaceae)木兰属，常绿乔木，原产北美东南部(火树华，1990)。1913年前后引入我国广州，故名广玉兰。广玉兰树姿端庄雄伟、枝繁叶茂、叶大光亮、花期较长且洁白芳香，耐烟抗风，尤其是对二氧化硫等有毒气体具有很高的抗性，具有很高的经济观赏价值，多用于城市绿化、园林景观设计中(曹受金，2006 ; 温红等，2010)。

近年来，随着城市化进程的加快，人们对环境质量的要求也越来越高。在较高纬度的城市园林中，引种和应用广玉兰美化城市园林景观，已经广泛引起重视，但目前存在盲目引种的趋势，低温冻害仍然是广玉兰自然分布的主要限制因子，因此开展广玉兰越冬适应性观察、抗寒性生理方面的研究对于高纬度城市园林引种与应用具有重要参考价值。周建等(2008)测定低温胁迫下广玉兰生理指标的变化情况，并探讨其影响机制，结果表明: 随着处理温度的降低，广玉兰叶片中丙二醛含量、相对电导率、脯氨酸和可溶性糖含量增加，过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性先升后降。在低温胁迫中，丙二醛积累与相对电导率上升为影响广玉兰存活的负面因素;可溶性糖、脯氨酸调节渗透压成为广玉兰缓解低温胁迫的主要保护性因素，而过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性受低温影响，去除活性氧自由基成为次要保护性因素。同时，周建等(2009)的研究认为，低温胁迫除导致光合作用的气孔抑制外，还直接损伤光合机构使 PSⅡ反应中心失活，引起其光能原初捕捉能力和光能同化率减弱，增加了通过热辐射消耗的光能比例，最终导致广玉兰幼苗光合作用能力减弱。张亚红等(2010)研究发现: 广玉兰的抗寒性强于香樟(Cinnamomum camphora)。通过对河南郑州、信阳、濮阳，河北石家庄，山东济南、青岛及北京等地的广玉兰进行调查，发现栽培的广玉兰叶片形状、叶片大小、叶片颜色、叶背面被毛情况及树冠等存在较大差异，刘艳萍等(2012)将广玉兰初步划分为6个类型。河南郑州地处广玉兰由南到北分布的过渡带，此地引种栽培有广玉兰的6个类型。本文研究6种不同类型广玉兰的叶片微观结构特征，对低温胁迫下不同类型广玉兰叶片的相对电导率进行研究，计算出广玉兰6个类型的低温半致死温度，最终对广玉兰6个类型的抗寒性强弱进行评价，为广玉兰向高纬度城市引种与应用提供理论参考。

广玉兰叶片: 取自郑州市，按广玉兰6个类型，即狭绿叶少毛紧凑型(类型Ⅰ)、椭圆绿叶少毛稍开张型(类型Ⅱ)、狭绿叶白毛稍开张型(类型Ⅲ)、圆黄叶锈毛开张型(类型Ⅳ)、小绿叶锈毛疏冠型(类型Ⅴ)、圆绿叶密锈毛密冠型(类型Ⅵ)(刘艳萍等，2012)，于2011年12月28日在树冠中部的东西南北4个方向剪取无病虫害的当年生枝条; 摘下叶片，充分混合，再随机选取20片叶片备用。

1)低温处理方法    将准备好的广玉兰叶片分成6份放入密封袋里，每个密封袋里放3~4片，然后置于美国 HARRIS 公司生产的 ELT-13 V-85 V34型超低温冰箱进行低温处理，设定的温度梯度分别为: 0，-5，-10，-15，-20，-25 ℃，以当天取样时的温度5 ℃为对照，每2个温度间降温过程30 min，并在处理温度持续24 h。

2)相对电导率的测定    采用电导率仪法测定(郝建军等，2006)。将低温处理后的材料，取出用洁净滤纸吸干水分，并将每个叶片剪成长约1 cm、宽约2~3 mm 的小片，分别取约0.5 g 放入电导杯中，加入超纯水25 mL，摇匀后浸泡24 h，用上海 DDS-307型电导率仪测定其电导率; 再将样品放入沸水浴中煮30 min，冷却后摇匀再用电导率仪测定其电导率，每个试样重复3次。相对电导率的计算公式为:

$ 相对电导率\left( {100\% } \right) = \frac{{{C_1}}}{{{C_2}}} \times 100\% , $

3)扫描电子显微镜观察    利用取回的新鲜叶片，先在玻片上滴少许4 % 戊二醛，在其中用锋利的单面刀切取叶片约1 cm × 1 cm 大小，迅速投入4 %戊二醛中固定，磷酸缓冲液清洗，酒精梯度脱水，乙酸异戊脂置换，临界点干燥，喷金，采用 FEI Quanta200环境扫描电子显微镜观察广玉兰叶片微观结构。

4)叶片组织细胞结构    依据广玉兰叶片扫描电镜图片，分别测量不同类型广玉兰的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度和下部紧密组织厚度，并按下面的公式计算:

$ 叶片组织细胞结构紧密度\left( {{\rm{CTR}}} \right)\% = \frac{{栅栏组织厚度+ 下部紧密组织厚度}}{{叶片厚度}} \times 100\% , $

$ 叶片组织细胞结构疏松度\left( {{\rm{SR}}} \right)\% = \frac{{海绵组织厚度}}{{叶片厚度}} \times 100\% 。 $

5)低温半致死温度    根据莫惠栋(1983)的计算方法，利用 Microsoft Origin 8.0对不同温度处理下的相对电导率数值进行拟合，求出不同类型广玉兰叶片的低温半致死温度(LT₅₀)。

随着温度的降低，6个类型广玉兰叶片相对电导率的变化趋势基本一致，均呈先缓慢上升、后急剧升高、最后趋于稳定，即开始时随温度降低而缓慢增加，表明在此温度范围内能够适应，但温度下降到 -5~-10 ℃时，相对电导率开始急剧升高，而且温度进一步降低到-20~-25 ℃时，广玉兰叶片的相对电导率趋于稳定，表明此时细胞已受到严重伤害。方差分析结果表明，不同类型间的相对电导率差异显著(P<0.05)。

由表 1可知:随着温度的降低，6个类型广玉兰叶片的相对电导率的增加值差异较大。当温度由5 ℃降至 -25 ℃时，类型Ⅰ的相对电导率由32.10 % 升高至80.82 %，增加了50.72 % ; 类型Ⅱ的相对电导率由29.14 % 升高至75.80 %，增加了46.66 % ; 类型Ⅲ的相对电导率由38.77 % 升高至78.17 %，增加了39.40 % ; 类型Ⅳ的相对电导率由25.19 % 升高至62.61 %，增加了37.42 % ; 类型Ⅴ的相对电导率由27.35 % 升高至58.65 %，增加了31.30 % ; 类型Ⅵ的相对电导率由30.53 % 升高至69.52 %，增加了38.99 % 。类型Ⅴ的增幅最小，且在各个设定温度下的相对电导率均较低，尤其是随着温度的降低，其相对电导率显著低于其他几个类型的相对电导率; 其次为类型Ⅳ，相对电导率值和增幅也较小; 类型Ⅰ的相对电导率值和增幅均最大。

表 1 不同类型广玉兰叶片相对电导率的多重比较^① Tab.1 The leaf relative electric conductivity of different types of M． grandiflora

表 1 不同类型广玉兰叶片相对电导率的多重比较① Tab.1 The leaf relative electric conductivity of different types of M． grandiflora % 温度 Temperature / ℃ 类型 Type Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ ①表中数据为平均值±标准差 The data in table is average ± SD．同一列中 ，a -c 表示相同类型下不同温度的差异水平(P<0.05)，字母相同表示差异不显著 In the same column，a -c mean the significance of difference in the same type with different temperature(P<0.05)．下同。 The same below． 5 32.11 ± 0.09 a 29.14 ± 0.26 a 38.78 ± 0.004 a 25.19 ± 0.78 a 27.36 ± 1.07 a 30.54 ± 0.65 a 0 35.06 ± 0.54 a 32.64 ± 0.16 a 42.14 ± 0.84 a 34.21 ± 0.30 ab 33.74 ± 0.73 ab 30.71 ± 0.53 a -5 55.79 ± 0.42 b 38.12 ± 0.80 a 61.50 ± 0.25 b 41.45 ± 0.78 b 38.11 ± 0.94 ab 55.01 ± 0.60 b -10 64.25 ± 0.60 bc 67.10 ± 0.01 b 63.43 ± 0.55 bc 58.07 ± 0.23 c 46.24 ± 0.91 b 56.30 ± 0.009 b -15 76.69 ± 0.23 c 65.82 ± 0.96 b 77.65 ± 1.35 c 56.51 ± 0.40 c 47.72 ± 0.28 b 67.49 ± 1.21 b -20 79.84 ± 1.41 c 67.79 ± 0.32 b 78.10 ± 0.09 c 59.77 ± 0.33 c 47.78 ± 0.07 b 67.72 ± 0.83 b -25 80.82 ± 0.05 c 75.80 ± 0.74 b 78.17 ± 0.51 c 62.61 ± 0.46 c 58.65 ± 0.96 b 69.53 ± 0.41 b

表 2 不同类型广玉兰叶片的低温半致死温度 Tab.2 The semilethal temperature of different types of M． grandiflora

表 2 不同类型广玉兰叶片的低温半致死温度 Tab.2 The semilethal temperature of different types of M． grandiflora 类型Ⅰ 类型Ⅱ 类型Ⅲ 类型Ⅳ 类型Ⅴ 类型Ⅵ TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ TypeⅣ TypeⅤ TypeⅥ 低温半致死温度 Semilethal temperature / ℃ -18.86 -19.76 -19.47 -21.10 -22.56 -20.99

研究结果表明: 低温胁迫下，类型Ⅴ的低温半致死温度最低，为 -22.56 ℃，其次为类型Ⅳ的，为 -21.10 ℃ ; 类型Ⅰ的低温半致死温度相对较高，为 -18.86 ℃ ; 类型Ⅱ、类型Ⅲ和类型Ⅵ的低温半致死温度居中。这说明类型Ⅴ的抗寒性最强，其次为类型Ⅳ，类型Ⅰ的抗寒性最差，类型Ⅱ、类型Ⅲ和类型Ⅵ的抗寒性居中。

对6个类型广玉兰叶片横切面的微观结构进行研究(图 1)，6个类型广玉兰叶片下表皮上均长有针状表皮毛; 上、下表皮细胞呈长圆形或近长方形; 栅栏组织由1层纵向排列的方形细胞组成，海绵组织细胞近圆形、靠近栅栏组织一侧的细胞排列较为紧密、下部细胞排列疏松且分布有大空隙。

	图 1 不同类型广玉兰叶片的微观结构 Fig. 1 Leaf microstructure of different types of M． grandiflora A: 类型Ⅰ TypeⅠ ; B: 类型Ⅱ TypeⅡ ; C:类型Ⅲ TypeⅢ ; D:类型Ⅳ TypeⅣ ; E:类型Ⅴ TypeⅤ ; F:类型Ⅵ TypeⅥ

对6个类型广玉兰叶片横切面的微观结构研究结果表明: 广玉兰6个类型中，叶片较厚的是类型Ⅴ和类型Ⅱ，叶片厚度最薄的是类型Ⅳ，最厚与最薄的相差87.62 μm(表 3)。由表 3可看出，6个类型广玉兰叶片上、下表皮细胞较厚的是类型Ⅴ，分别为37.97和25.13 μm，最薄的是类型Ⅲ，为12.56和12.58 μm。叶肉组织由栅栏组织和海绵组织构成，两者之比为栅海比。研究发现，广玉兰6个类型的栅海比是类型Ⅴ > 类型Ⅳ > 类型Ⅱ> 类型Ⅲ > 类型Ⅵ > 类型Ⅰ，分别为2.73，1.83，1.55，1.52，1.46和1.41。

表 3 6个类型广玉兰叶片的解剖结构 Tab.3 Leaf anatomical structure of different types of M． grandiflora

表 3 6个类型广玉兰叶片的解剖结构 Tab.3 Leaf anatomical structure of different types of M． grandiflora 类型 Type 表皮厚度 Epidermis thickness / μm 栅栏组织厚度Thickness of palisade tissue / μm 海绵组织厚度Thickness of spongy tissue / μm 叶片厚度 Thickness ofleaf / μm CTR(%) SR(%) 上表皮 Adaxial epidermis 下表皮 Adaxial epidermis Ⅰ 12.50 ± 0.42 25.23 ± 0.52 87.50 ± 0.70 62.27 ± 0.38 187.50 ± 0.68 66.79 ± 0.08 33.21 ± 0.08 Ⅱ 25.20 ± 1.27 12.50 ± 0.56 75.83 ± 0.24 48.97 ± 1.45 162.50 ± 0.28 69.86 ± 0.84 30.14 ± 0.84 Ⅲ 12.56 ± 0.60 12.58 ± 0.29 75.33 ± 0.46 49.53 ± 0.67 150.00 ± 0.59 66.98 ± 0.81 33.02 ± 0.32 Ⅳ 18.75 ± 0.50 12.50 ± 0.90 52.50 ± 0.72 28.75 ± 0.39 112.50 ± 0.77 74.44 ± 0.52 25.56 ± 0.52 Ⅴ 37.97 ± 0.08 25.13 ± 0.33 100.25 ± 0.66 36.77 ± 0.91 200.12 ± 0.19 81.63 ± 0.44 18.37 ± 0.44 Ⅵ 31.25 ± 0.42 25.81 ± 0.32 62.50 ± 0.72 42.94 ± 0.16 162.50 ± 0.91 73.58 ± 0.25 26.42 ± 0.25

植物叶片组织细胞结构紧密度(CTR)与品种耐寒性密切相关且成正相关关系，可作为植物耐寒性的鉴定指标(张惠斌等，1993 ; 吕庆芳等，2000 ; 刘冰洁等，2006)。广玉兰6个类型的 CTR 值大小依次为类型Ⅴ > 类型Ⅳ > 类型Ⅵ > 类型Ⅱ > 类型Ⅲ >类型Ⅰ，表明广玉兰类型Ⅴ的抗寒性最强，其次为类型Ⅳ和类型Ⅵ，类型Ⅰ的抗寒性最差。根据 CTR 值将广玉兰6个类型的耐寒性分为耐寒性强(Ⅰ)、较强(Ⅱ)、中等(Ⅲ)、弱(Ⅳ)4类。Ⅰ类，CTR 值为80 % 以上: 类型Ⅴ; Ⅱ类，CTR 值为70 %~80 % :类型Ⅳ和类型Ⅵ; Ⅲ类，CTR 值为68 %~70 % : 类型Ⅱ; Ⅳ类，CTR 值为68 % 以下: 类型Ⅲ和类型Ⅰ(表 3)。

抗寒性研究是常绿树种向高纬度地区引种成败的关键。长期以来，人们以营养器官受冻程度进行目测评定(王名金等，1965)，后来有人以植物组织中的电阻值和含糖量评价其抗寒性(顾英等，1981)。近年来，研究者又以离体叶片为试材，通过人工低温胁迫处理，利用电导法测定其电导率，并拟合 Logistic 方程求其半致死温度，作为鉴定树种抗寒性大小的数量指标(贺善安等，1986 ; 田如男等，2005 ; 李刚等，2007)，确定供试树种的抗寒性: 深山含笑(Michelia maydiae)、阔瓣含笑(M．platypetala)、乳源木莲(Manalietia yuyuanensis)> 大叶冬青(Ilex latifolia)> 金叶含笑(Michelia foveolata)、乐昌含笑(田如男等，2005)，乐东拟单性木兰(Parakmeria lotungensis)> 阔瓣含笑 > 金叶含笑，红花木莲(Manglietia insignis)> 醉香含笑(Michelia macclurei)> 观光木(Tsoongiodendronodorum)(李刚等，2007); 2组试验中重复树种的抗寒性具有一致性，且这一结果与施福成等(1993)对常绿木兰科植物连续4个冬季的田间追踪结果基本一致。这说明利用离体叶片为材料，通过人工低温胁迫评价常绿树种的抗寒性是可行的，据此开展广玉兰不同类型的抗寒性研究。

低温是限制植物向高纬度地区引种的主要环境胁迫因子，生物膜是低温伤害作用于植物细胞的原初部位(Lyons et al.，1970)。电导法是依据质膜透性原理来鉴定植物的抗寒性，它是测定植物离体器官组织抗寒性的一种常用与可靠的生理方法(Lyons，1973)。在试验温度区间内，随着温度的降低，广玉兰离体叶片的相对电导率增加，这与周建等(2008)的研究结果一致; 不同类型广玉兰离体叶片的相对电导率的变化趋势基本一致，但其变化值差异较大，类型Ⅴ的相对电导率增幅最小，其次为类型Ⅳ，相对电导率值和增幅也较小; 类型Ⅰ的相对电导率值和增幅均最大。在同样低温处理条件下，电解质渗出的多少与植物品种抗寒性强弱具有一定相关性，抗寒性强的品种，电解质渗出相对少一些(Hawkins et al.，1994 ; 徐晓薇等，2004)。由此可知: 6个类型广玉兰的抗寒性强弱依次为类型Ⅴ、类型Ⅳ、类型Ⅵ、类型Ⅱ、类型Ⅲ、类型Ⅰ。

低温半致死温度(LT₅₀)作为植物抗寒性的生态指标，主要反映了温度和水分与抗寒性之间的数量关系。朱月林等(1988)用电解质外渗率达到50 %的低温点作为植物的半致死温度(LT₅₀)，它是相对电导率———温度的 S 形曲线上表现为曲线的拐点所对应的温度，它能较直观且准确地反映植物的抗寒力和所能容忍的低温极限。研究者利用半致死温度(LT₅₀)确定了菊花(Dendranthema × grandiflorum)不同品种(许瑛等，2008)、刚竹属(Phyllostachys)4个竹种(徐传保等，2011)等植物的抗寒性。本试验研究结果表明: 不同类型广玉兰的低温半致死温度(LT₅₀)的高低次序为类型Ⅴ < 类型Ⅳ < 类型Ⅵ < 类型Ⅱ < 类型Ⅲ < 类型Ⅰ。

叶片微观结构研究结果表明: 广玉兰叶片上、下表皮细胞呈长圆形或近长方形，下表皮上被有针状表皮毛，栅栏组织由1层纵向排列的方形细胞组成，海绵组织细胞近圆形; 类型Ⅴ和类型Ⅳ的栅海比较大，分别为2.73和1.83，类型Ⅰ的最小，为1.41 ; 不同类型广玉兰叶片组织细胞结构紧密度(CTR 值)大小依次为类型Ⅴ > 类型Ⅳ > 类型Ⅵ >类型Ⅱ > 类型Ⅲ > 类型Ⅰ。叶片厚度在一定程度上反映出植物的抗性强弱，一般情况下抗性强的植物具有小而厚的叶片，这种变化可减小叶片表面空气的流动，提高植物叶片的热稳定性，对保持植物正常的光合作用和呼吸作用非常重要(王启明等，1993)。所研究的6个类型广玉兰叶片，无论从叶片大小，还是叶片厚度分析，类型Ⅴ属于叶片小而厚的一类，其叶片长度为15.71 cm、叶片宽度为6.78 cm、叶片厚度为200.12 μm。叶片一般由表皮、叶肉和叶脉3种基本结构组成，其中表皮又有上表皮和下表皮之分，叶肉组织分为栅栏组织和海绵组织，两者之比为栅海比(陆时万等，1991)。本研究中6个类型广玉兰叶片表皮细胞最厚的是类型Ⅴ，为63.10 μm; 最薄的是类型Ⅲ，仅为25.14 μm，较厚的表皮细胞有利于延长物质进出叶肉组织的时间，缓解冷空气对叶肉组织的影响(蔡永立等，2001)。栅栏组织使叶片具有较高的紧实度，低温环境下对叶片具有良好的“围墙效应”(王启明等，1993)，海绵组织主要参与下表皮细胞上气孔的通气作用，所以栅海比大，植物抵抗力也较强。

从广玉兰6个类型的相对电导率、低温半致死温度和叶片组织细胞结构的分析结果可知，类型Ⅴ和类型Ⅳ的抗寒性相对较强，类型Ⅰ的抗寒性较差，类型Ⅱ、类型Ⅲ和类型Ⅵ的抗寒能力居中。因此，在向更高纬度引种时，以类型Ⅴ和Ⅳ为宜。