2013, Vol. 49
文章信息
- 李永, 朴春根, 贺伟, 常聚普, 王海明, 郭立民, 谢守江, 郭民伟
- Li Yong, Piao Chungen, He Wei, Chang Jupu, Wang Haiming, Guo Limin, Xie Shoujiang, Guo Minwei
- 2个欧美杨品种树皮内生真菌多样性及优势种群动态变化
- Predominant Species Dynamic and Diversity of Fungal Endophytes in Barks of Populus×euramericana
- 林业科学, 2013, 49(6): 90-96
- Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(6): 90-96.
- DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130613
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文章历史
- 收稿日期：2012-12-19
- 修回日期：2013-01-30
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作者相关文章
2. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 100091;
3. 濮阳市林业科学院 濮阳 457000;
4. 菏泽市林木保护站 菏泽 274002
2. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry Beijing 100091;
3. Puyang Academy of Forestry Puyang 457000;
4. Heze Forest Protection Station Heze 274002
内生真菌是指在生活史的某段时期生活于植物组织内部，对宿主没有造成明显病害症状的真菌，它在植物组织中普遍存在(Petrini，1991; 孙剑秋等，2008)。内生真菌因其独特的生活环境，与宿主植物关系极为密切: 一方面植物为内生真菌提供光合产物和矿物质; 另一方面内生真菌的代谢产物能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力(白红霞等，2006)，因此植物内生真菌的研究日益增多(白红霞等，2006;窦学娥等，2008; 孙剑秋等，2008; 刘小莉等，2009)。
杨树(Populus spp.)具有生长快，适应性强，易繁殖，材质好，用途广等优点，是我国北方用材林、防护林和城市绿化的主要树种(高建社等，2004;白红霞等，2006)。近年来华北平原大面积推广栽培优良品种欧美杨107杨(Populus × euramericana cv. 74/76)(以下简称107杨)，但近几年107杨、欧美杨中林46杨(P. × euramericana cv.‘Zhonglin46’)(以下简称中林46杨)发生欧美杨溃疡病，对欧美杨的发展造成威胁(贺伟等，2009)。如何有效地控制病害已成为生产上迫切需要解决的问题，利用植物内生菌控制病害已成为病害防治的一个新途径。杨树内生真菌研究方面，金静等(2004)利用组织分离法对毛白杨(P. tomentosa)，陕林4号杨(P. deltoides cv.‘Lux’× P. cathayana‘1062’)和北京杨(P. × beijingensis)3个品种树体空间层次的真菌种类，数量及季节动态进行分析;白红霞等(2006)对内蒙古地区杨树内生真菌多样性进行调查。赵桂华等(2008)研究了南林351杨(P. deltoides ‘harvard’× P. deltoides cv. ‘lux’)、土耳其杨(P. deltoides ‘S307-26’)和天演杨(P. ×euramericana)内生真菌种类情况。Martín-García(2012)比较欧洲本土的黑杨(P. nigra)和欧美杨I-214(P. × euramericana cv. I-214)细枝内生真菌种类，但未开展树干树皮内生真菌及优势种群相关研究。本研究选择在华北地区大面积推广的优良速生欧美杨品种107杨和中林46杨作为研究对象，研究2个杨树品种干部树皮内生真菌的物种多样性、群落组成及其优势种群季节动态变化规律，了解潜在植物病原真菌、生防真菌和促生真菌等有益微生物，为杨树病虫害防治、有益微生物的开发利用奠定基础。
本研究选取2个欧美杨树品种(107杨、中林46杨)为研究对象进行干部树皮内生真菌研究，分别在2010—2012年的四季进行样品采集，具体时间为2010年7，10月; 2011年1，4，7月和10月; 2012年的1月和4月。
采样地点为河南省濮阳市。濮阳市位于中纬地带，常年受东南季风环流的控制和影响，属暖温带半湿润季风型大陆性气候，年平均气温13.3 ℃，年平均降水量502.3～601.3 mm，海拔50 m。试验林地为5～6年生的107杨和中株46杨(树干直径为15～17 cm)混交人工林(35°53' N，115°05' E)，采集样品为距地面1.2 m位置的干部树皮。采样方式为随机3点采样，每点每品种采集3株(每株7 cm×4 cm组织块)，每品种各采集9株。采集的样品用无菌袋单独包装，并做好记录，带回实验室立即分离培养。
1.2 内生真菌分离和培养首先用自来水冲洗9个样品，然后将样品剪成0.8 cm×1 cm的小块，每个样品分别随机选取3个组织块，用于内生真菌的分离。消毒程序: 无菌条件下(超净工作台中操作)，4%次氯酸钠消毒5 min，灭菌水冲洗3次(每次45 s)，用无菌滤纸吸干后，切成2 mm×2 mm组织块。随机选取56个组织块放在加有链霉素(50 mg·L-1)的PDA平板上，每平板接入4个小组织块。封口后置于28 ℃培养7～14天，定期观察内生真菌菌落生长情况，挑取尖端菌丝转接于PDA斜面纯化培养。取少量冲洗消毒材料最后1次的无菌水涂抹新的培养基平板，置于28℃培养箱中培养，未有杂菌生长，则此分离方法所得到的真菌即为内生真菌。
1.3 DNA的提取与序列测定采用液氮/沸水反复冻融方法提取基因组DNA(林彩丽等，2009)。从培养5～7天的菌落边缘取3 mm×3 mm的菌丝块转入200 μL DNA提取液中，经液氮/沸水反复冻融3次，氯仿/异戊醇抽提1次，吸取上清，加入2倍体积无水乙醇，12 000 r·min-1离心12 min沉淀DNA，制备好的DNA置-20 ℃保存备用。
PCR扩增引物为通用引物(ITS1/ITS4)，PCR扩增程序和条件参照White等(1990)。取3 μL扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳，120 V(5 V·cm-1)1 h，用DL 2000作DNA分子量标准，并在凝胶成像分析系统(vilber3000)中成像分析。PCR扩增产物直接送北京博迈德科技发展有限公司切胶纯化双向测序。
1.4 菌种的鉴定及系统发育关系分析真菌鉴定依据形态特征和ITS序列分析相结合的方法。首先通过观察真菌的菌丝、无性或有性孢子、产孢结构等的形态特征，参照《真菌鉴定手册》(魏景超，1979)鉴定到属。然后分别利用NCBIBlast工具和EMBL Fasta工具进行序列分析比对，验证形态特征鉴定结果的可靠性。菌株ITS序列与参比序列同源性大于97%视为相同的种，而同源性在95%～96.9%视为相同的属(By et al.，2011)。应用CLUSTAL W程序对ITS序列进行对位排列，然后利用MEGA 4.0构建基于ITS序列的系统发育树有根树(NJ，Bootstrap检验1 000次重复检验，自展值小于50未显示)。107杨内生菌系统进化树上，Coprinus radians(担子菌)作为组外对照，中林46杨内生菌系统进化树上以Acaromyces ingoldii(担子菌)为组外对照。
1.5 统计分析方法本研究统计方法参照文献(孙剑秋等，2008;Petrini et al.，1982; Pielou，1975)，即定殖率(colonization rate，CR)是指样本中受内生真菌侵染的组织块数占全部样本组织块数的百分数。分离率(isolation rate，IR)是指从样本组织块中得到的菌株数与全部样本组织块数的比值。相对频率(relativefrequency，RF)是指样本中分离到的某种内生真菌的菌株数占分离到总菌株数的百分数。多样性指数(H')是根据Shannon-Weiner指数公式计算，$H' = -\sum\limits_{i = 1}^k {{P_i} \times \ln {P_i}} $，其中k是指某种植物内生真菌种类的总数，Pi是指某种内生真菌的菌株数占全部内生真菌菌株数的百分数。相似性系数(CS)是根据Sorenson系数公式计算，CS=2j/(a+b)，其中j是2种植物共同具有的内生真菌种类数，a是一种植物内生真菌的种类数，b是另一种植物内生真菌的种类数。
2 结果与分析 2.1 内生真菌定殖率和分离率2010年7月至2012年4月期间，从濮阳采集的107杨和中林46杨(996个)表面消毒组织块中分离得到1 252株内生真菌菌株，其中107杨和中林46杨分别得到645和607株。在2个欧美杨品种中，107杨定殖率为99.3%，各季度的定殖率在98.2%～100%; 而中林46杨定殖率98.6%，各季度的定殖率为96.4%～100%。内生真菌分离率最高的是2012年4月份的107杨样品，在不同季度中，秋季和春季的分离率略高于夏季和冬季(表 1)。
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根据形态特征和分子生物学鉴定结果，从2个欧美杨品种分离到的1 252株内生真菌被鉴定为32个分类单元，隶属19个属，包括担子菌门2个分类单元，子囊菌门30个分类单元，其中座囊菌纲(Dothideomycetes)10个、散囊菌纲(Eurotiomycetes)3个、粪壳菌纲(Sordariomycetes)13个。2个欧美杨品种内生真菌组成存在一定差异，链格孢(A. alternata)、葡萄座腔菌(B. dothidea)等11个属，13个分类单元的内生真菌在2个品种中均能分离到，而仅在107杨中分离到的内生菌有10个分类单元，仅在中林46杨中分离到的内生真菌有9个分类单元。2个杨树品种内生真菌组成见表 2。
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欧美杨2个品种的优势种群有3个种类相同，即链格孢(A. alternata)、葡萄座腔菌(B. dothidea)和桑砖红镰孢(F. lateritium)。仅链格孢在8次采样中均可分离到，其在107杨和中林46杨的相对频率分别为10.7%～47.1%和10.4%～36.1%。葡萄座腔菌次之，107杨有7次采样分离到该菌，相对频率为20.5%～46.4%; 而中林46杨有6次采样分离到该菌，相对频率在10.3%～48.7%(图 1，2)。
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图 1 107杨内生真菌优势种群动态变化
Fig. 1 Seasonal variation of predominant fungal endophytes in barks of P. × euramericana cv. ‘74 /76’
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图 2 中林46杨内生真菌优势种群季节动态变化
Fig. 2 Seasonal variation of predominant fungal endophytes in barks of P. × euramerican cv. ‘Zhonglin 46’
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2个杨树品种内生真菌的多样性指数基本相同，107杨和中林46杨多样性指数分别为2.38和2.36，但季度多样性指数存在一定差异，107杨8个季度的多样性指数在1.26～1.89之间，107杨8个季度的多样性指数在1.39～1.74之间(表 3)。
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2品种内生真菌种类组成的总相似系数为0.52，2品种之间相似系数随季节变化而变化，其相似性系数在0.33～0.61范围内，其中2品种在秋季的相似性系数最高(0.61)(图 3)。
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图 3 相似性系数季节动态变化
Fig. 3 Similarity coefficient of the fungal endophyte communities
of two cultivars of P. × euramericana
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2杨树品种优势种群随季节也会发生一定变化。2010年夏季—2011年夏季107杨优势种群为链格孢，相对频率25%～44%之间变化，次之为葡萄座腔菌，相对频率为20%～33%。而2011年秋季和2012年春季，优势种群为葡萄座腔菌，2011年冬季为F. incarnatum-equiseti(图 1)。中林46杨优势种群变化更大些，2010年夏秋2季为链格孢，2010年冬季、2011年春秋季、2012年春季为葡萄座腔菌，2011年夏冬2季为间座壳属的种类Diaporthe conorum和Diaporthe sp.(图 2)。
2.5 内生菌的系统发育关系基于ITS序列分析构建的系统进化树显示，2个杨树品种的内生菌系统发育树类似，内生菌被分成了6个大分支，其中1个分支为担子菌，另外5个分支均为子囊菌。在107杨内生菌进化树中，5个子囊菌的分支分别由座囊菌纲(Dothideomycetes)1和2、散囊菌纲(Eurotiomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)和Ascomycota sp.组成，担子菌Coprinus radionas作为组外对照构成该系统发育树的树根(图 4)。而2个品种发育树不同点就在于107杨内生菌发育树的Ascomycota sp.分支，在中林46杨内生菌发育树上被锤舌菌纲(Leotiomycetes)内生真菌代替，担子菌Acaromyces ingoldii作为组外对照构成系统发育树的树根(图 5)。
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图 4 基于ITS序列构建107杨内生真菌NJ系统发育树
Fig. 4 NJ tree of the fungal endophytes of P. × euramericana cv. ‘74 /76’based on ITS sequence
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图 5 基于ITS序列构建中林46杨内生真菌系统发育树
Fig. 5 NJ tree of the fungal endophytes of P. × euramerican ‘Zhonglin 46’based on ITS sequence
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赵桂华等(2008)研究发现，南林351杨、土耳其杨和天演杨组织分离的真菌优势种群为链格孢(A. alternata)。Martín-García等(2012)从欧美杨嫩枝上分离7种菌，其中包括链格孢A. alternata、A.infectoria。金静等(2004)从3种杨树分离鉴定67个属内生真菌，链格孢属、曲霉属(Aspergillus)是毛白杨、陕林4号杨和北京杨树皮内生真菌优势种群，而真菌群落季节变化趋势为5月、9月内生真菌的种类和数量稍高，3月和11月有所减少。本研究从欧美杨2个品种得到17个属、30个分类单元(均为子囊菌)，包括座囊菌纲10个、散囊菌纲3个、粪壳菌纲13个，说明欧美杨树皮内生菌具有丰富的物种多样性。2个欧美杨品种内生真菌优势种群包括链格孢、葡萄座腔菌(B. dothidea)、桑砖红镰孢(Fusarium lateritium)、间座壳菌(Diaporthe spp.)和F. incarnatum-equiseti，其中链格孢、葡萄座腔菌是最为常见的优势种群，而2品种多样性指数在春(4月)、秋(10月)2季稍高于夏(7月)、冬(1月)2季，这些研究结果与前人研究结果一致(金静等，2004;赵桂华等，2008; Martín-García et al.，2012)。
欧美杨2品种内生菌组成中，有些是重要的植物病原菌，在正常情况下，这些内生菌不会对植物造成危害，但遇到适宜条件，它们会转化成植物病原菌。如B. dothidea，F. solani是在107和中林46两个品种中较为常见的种类，B. dothidea 寄生在多种杨树上，是杨树溃疡病的病原菌，对杨树造成很大危害(张星耀，2003)。F. solani 也是重要的植物病原菌，它可以侵染很多种植物，如复叶槭(Acernegundo)、茄(Solanum melongena)根腐、川芎(Ligusticum sinense)根腐等病害都是该病菌侵染所致，而且危害相当严重(王勇等，2000; Demirci，2006; 冯茜等，2008)。
从植物内生菌中筛选具有生物防治动能的菌株的研究逐渐得到人们重视(Bailey et al.，2008;Hanada et al.，2008)。有研究指出，木霉(Trichoderma)可以通过营养竞争、抗生作用、促进植物生长或者诱导抗性等方式保护寄主(Howel 2003; Holmes et al.，2004; Bailey et al.，2008)。本研究获得包括木霉类在内的大量内生真菌资源，为进一步的生物防治菌株的筛选、开发与利用，以及真菌生物活性物质筛选打下坚实基础。
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