百里杜鹃国家森林公园位于贵州西北部黔西、大方两县交界处，是迄今为止中国已查明的面积最大的天然杜鹃林带(陈训等，2010)。糙叶杜鹃(Rhododendron scabrifolium)是公园内主要的早花树种，在自然条件下分布稀少，移栽成活率和扦插成活率低，且受凝冻、干旱等灾害天气的影响较大(李苇洁等，2008 ; 黄承玲等，2011)，因此阻碍了糙叶杜鹃的资源保护和推广应用。目前，国内外针对糙叶杜鹃的研究仅见于对其花期调控、扦插技术等方面(周兰英等，2008 ; 李朝婵等，2011)，糙叶杜鹃扦插过程中插穗的内源激素、内部营养和氧化酶活性变化研究尚未见报道。本文通过对插穗生根过程中茎段的内源激素、营养物质含量和相关氧化酶活性变化进行研究，探讨其扦插生根机制。

以2011年7月20日采于贵州百里杜鹃国家级森林公园内的野生糙叶杜鹃半木质化茎段为试材，在全光自动喷雾实验室进行扦插。

取生长健壮、无病虫害的糙叶杜鹃半木质化茎段，把茎段修剪成5~10 cm 长的插穗，每插穗保留2~3片叶，并将留下的叶片保留1 /3以减少蒸腾作用。用枝剪轻敲插穗基部1 /3处，以利于插穗产生愈伤组织和吸收生长激素，增强生根效果。扦插基质采用泥炭土和珍珠岩(1:3)，扦插穴盘浇透水后将处理后的插穗置入。间隙喷雾的时间扦插前2周为20 s·(10 min)^-1，2周后为20 s·(30 min)^-1，以后根据具体情况调整喷雾的时间间隔，使湿度保持在90 % 以上，温度保持在(25 ± 2)℃。每周做好观察并记录插穗的生根情况，扦插60天后统计数据。数据采用 SPSS 软件进行差异显著性分析。

生长激素为1 000，2 000 mg·L ^-1KNAA和1 000，2 000 mg·L ^-1KIBA。试验设定9种处理方法，每个方法处理64根插穗。数据采用 MS Excel和SPSS 软件进行分析。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定 IAA，GA₃，ABA 及 ZR 4种植物内源激素的含量，内源激素的测定在中国农业大学作物化学控制实验室进行; 可溶性糖含量、全氮含量、SOD，POD，CAT 采用李合生(2000)的方法测定; 多酚氧化酶(PPO)活性采用李忠光等(2005)改进的方法测定。

经方差分析，2 000 mg· L ^-1KNAA + 2 000mg·L ^-1KIBA 处理的平均不定根数和生根率与其他处理和对照均存在极显著差异(表 1)。 2 000mg·L ^-1KNAA + 2 000 mg·L ^-1KIBA 处理生根率最高，处理后的插穗生根率达到78.65 %，平均不定根数为37.97根，糙叶杜鹃半木质化插穗的生根效果最好。

表 1 不同激素处理对糙叶杜鹃生根状况的影响 ^① Tab.1 Effect of hormones on rooting of Rhododendron scabrifolium

表 1 不同激素处理对糙叶杜鹃生根状况的影响 ① Tab.1 Effect of hormones on rooting of Rhododendron scabrifolium 激素处理 Hormone treatment 平均生根数 Mean number of roots 生根率 Rottingrate(%) ①大、小写字母分别表示 α = 0.01和 α = 0.05水平的差异显著性。 The capitals and small letters mean nonsignificant or significant at α = 0.01 and 0.05 levels，respectively． 1 000 mg·L -1KIBA 12.12 Fe* 32.76 Gf 2 000 mg·L -1KIBA 18.18 Ed 46.14 Ed 1 000 mg·L -1KNAA 26.45 CDc 38.42 Fe 2 000 mg·L -1KNAA 37.58 Aa 66.17 Dc 1 000 mg·L -1 KIBA + 1 000 mg·L -1KNAA 27.23 Cc 46.32 Ed 1 000 mg·L -1 KIBA + 2 000 mg·L -1KNAA 34.23 Bb 71.81 Bb 2 000 mg·L -1 KIBA + 1 000 mg·L -1KNAA 25.34 Dc 67.53 Cc 2 000 mg·L -1 KIBA + 2 000 mg·L -1KNAA 37.97 Aa 78.65 Aa 对照Control 3. 21Gf 17. 89Hg

2 000 mg·L ^-1KNAA 单独处理插条生根率为66.17 %，平均不定根数为37.58根，2 000 mg·L ^-1KIBA 单独处理插条生根率为46.14 %，平均不定根数为18.18根，这表明混合处理提高生根效果。混合处理对可以有效促进糙叶杜鹃半木质化枝条生根，生根基质为珍珠岩和泥炭土(3:1)。许多研究者认为不同的植物茎段扦插采用不同的外源激素处理，使不同植物扦插的茎段产生不定根(Knight et al.，2005 ; Kulka，2008 ; Dash et al.，2011)。有研究认为外源激素在生根过程中与内源激素的浓度变化密切相关(Satisha et al.，2008)。

有研究认为对于难生根的杜鹃种类的扦插，只有 IAA和插穗生根潜力密切相关(Yoo et al.，2008)。 IAA 含量在扦插生根过程中呈现为“升高—降低—再升高”的趋势。插穗前期 IAA 升高的原因可能是使用生长激素处理，导致 IAA 含量升高。在愈伤生长时消耗部分内源 IAA，新根生出后自身合成内源 IAA，从而使内源 IAA 含量上升(图 1A)。

	图 1 糙叶杜鹃半木质化茎段扦插过程中内源激素 IAA(A)，GA3(B)，ZR(C)，and ABA(D)含量的变化 Fig. 1 Endogenous hormones IAA(A)，GA3(B)，ZR(C)，and ABA(D)content during rooting of treatment and Control semi-hardwood stems cuttings of R． sacbrifolium

处理插穗的赤霉素(GA₃)含量在7月23日—8月12日上升(图 1 B)，8月12后内源 GA₃呈下降趋势，可能是新根突破表皮生长消耗一定的 GA₃含量，可见 GA₃对糙叶杜鹃根原基分化起着重要作用。处理插穗内玉米素核苷(ZR)含量的变化是先升高后下降，再缓慢升高，而对照插穗 ZR 含量呈缓慢降低趋势。由此可见，生长激素处理的插穗在产生愈伤组织时消耗部分内源 ZR，因此 ZR 含量降低，在不定根产生后自身合成内源 ZR，内源 ZR 含量上升。

脱落酸(ABA)是植物体内天然的抑制性植物激素，抑制细胞分裂，诱导气孔关闭，减少蒸腾，防止水分流失(Zhang et al.，1987)。 ABA 调节重要的生理过程，如对干旱胁迫和休眠的反应(Bassaganya-Riera et al.，2010)。处理插穗 ABA 含量明显低于对照 ABA 含量，说明低浓度的 ABA 在插穗愈伤组织的形成过程中起到一定作用。

有研究认为 IAA / ABA 的比值与生根率呈正相关关系，可以作为生根难易的标准(郑均宝等，1991)，在本研究中处理过的半木质化插穗生根远高于对照生根，与前人的研究相一致。由图 2可知: 处理后的插条 IAA / ABA 比值均高于对照，说明生长激素处理提高插穗的生根能力。在生根过程中 IAA / ABA 比值较小(小于1)可能是糙叶杜鹃扦插较难生根的主要原因之一。

	图 2 生根过程中 IAA / ABA 的变化 Fig. 2 Changes of IAA / ABA during rooting

营养物质状况对扦插生根具有重要的意义，碳水化合物是插穗生根过程中体内生长素的主要调节者，是不定根形成和生长所需能量的来源(Correa et al.，2005)。插穗生根时需要一定的营养物质，一般碳水化合物和氮素化合物利用较多(王新建等，2009)。由图 3可知:糙叶杜鹃处理插穗生根过程中可溶性糖含量变化呈“上升—下降—上升”的变化趋势，而对照的可溶性糖含量变化先上升后下降。在扦插的前期，与对照相比较，经处理的插穗受外源激素处理可溶性糖含量增加，可能是由于淀粉等物质分解速度加快导致可溶性糖含量上升(孙红梅等，2011)，其中对照比扦插前可溶性糖增加13.7 %，处理插穗比扦插前可溶性糖增加41.4 % 。后期不定根的产生期可溶性糖含量呈下降趋势，可能是生根需要消耗大量的营养物质(李朝婵等，2012)。插穗不定根产生后可溶性糖含量有所上升，原因可能为生根后形成的新植株自身合成糖类物质。

	图 3 糙叶杜鹃生根过程中可溶性糖含量的变化 Fig. 3 Soluble sugar content during rooting of R． sacbrifolium

由图 4可知: 糙叶杜鹃插穗内全氮的含量变化，无论对照还是处理，都是在8月12日达到峰值，其中对照插穗比扦插前全氮含量增加45.9 %，处理插穗比扦插前全氮含量增加19.6 % 。8月12日之后开始缓慢下降，处理插穗全氮含量低于对照，可见插穗在生根过程中氮素含量的降低有利于糙叶杜鹃插穗不定根的形成。

	图 4 糙叶生根过程中全氮含量的变化 Fig. 4 Total N content during rooting of R． sacbrifolium

Kruas等(1918)认为 C / N 的比值与植物生根率有呈正相关关系。在本研究中处理过的半木质化插穗生根率远高于对照，由图 5可知:处理后的插穗 C / N 比值均高于对照，这与扦插生根率相吻合。8月12日后 C / N 下降，是由于可溶性糖大量消耗而全氮含量变化不大。在生根后，C / N 又开始略有上升，这与插穗生根成为完整的植株后本身的生理代谢有关，说明可溶性糖开始大量合成。

	图 5 糙叶杜鹃生根过程中 C / N 的变化 Fig. 5 Change of C / N ratio during rooting

植物扦插时茎段组织离开母株，在这种胁迫条件下会产生活性氧胁迫，活性氧的累积主要是由大量的超氧自由基所致，超氧化物歧化酶对清除超氧自由基起着重要作用(田敏等，2005)，因此 SOD 活性与植物扦插生根过程有着密切的关系。由图 6可知，针对糙叶杜鹃扦插前期 SOD 活性逐渐增强，21天时处理和对照的活性达到最大，之后略有下降。处理插穗的 SOD 活性明显高于对照，且处理的 SOD 活性在14天时就已经超过对照的最大值，这说明激素处理提高了插穗的 SOD 活性。扦插初期，插穗离开母株的逆境状态导致 SOD 活性升高;之后随着不定根产生和生长，逆境状态逐渐缓和导致 SOD 活性逐渐降低。

	图 6 糙叶杜鹃插穗 SOD 活性变化 Fig. 6 Dynamic of SOD activity in cuttings of R． scabrifolium

POD 是广泛存在于植物细胞中的氧化酶，它的变化与生根密切相关。本研究中，糙叶杜鹃插穗POD 酶活性呈现出规律性的变化，整体呈现出上升的趋势(图 7)。处理插穗的 POD 活性高于对照，表明激素处理可以提高插穗 POD 活性，而 POD 活性的提高有利于不定根的形成。在扦插后35天时，处理插穗的 POD 活性达到最高值。本研究与宋金耀等(2001)针对毛白杨(Populus tomentosa)研究的2个 POD 活性峰值较为一致。

	图 7 糙叶杜鹃插穗 POD 活性变化 Fig. 7 Dynamic of SOD activity in cuttingsof R． scabrifolium

CAT 是植物体所有组织普遍存在的一种抗氧化酶，能够有效清除植物体内多余的H₂O₂，保护膜结构(黄玉山等，1997)。处理的糙叶杜鹃插穗 CAT 活性变化呈“下降—上升—下降—上升”的趋势，而对照的 CAT 酶活性低于处理(图 8)，扦插生根后期糙叶杜鹃的CAT 活性维持在较高的水平。

	图 8 糙叶杜鹃插穗 CAT 活性变化 Fig. 8 Dynamic of CAT activity in cuttings of R． scabrifolium

由图 9中可知: 在扦插生根前期处理的糙叶杜鹃插穗 PPO 活性显著高于对照，生根中期对照 PPO 活性高于处理，在生根前后两者的 PPO 活性相差不大。在扦插前期处理和对照的 PPO 活性升高的原因可能是插穗的基部等酚类物质的渗出部位存在活跃的氧化等生理活动，因此活性升高，其中处理的 PPO 活性在14天达到最大值，比对照提前7天。在生根后期 PPO 活性也在升高，说明较高的 PPO 活性有利于糙叶杜鹃插穗不定根的生成。

	图 9 糙叶杜鹃插穗 PPO 活性变化 Fig. 9 Dynamic of PPO activity in cuttingsof R． scabrifolium

应用植物生长调节剂可有效使难生根树种生根(Henrique et al.，2006)，采用 KIBA 处理落羽杉(Taxodium distichum)插穗，取得较好的生根质量和生根率(King et al.，2011)，但 IBA 对柳杉嫩枝扦插没有作用(Jull et al.，1994)。本研究经过2 000mg·L ^-1KNAA + 2 000 mg·L ^-1KIBA 处理后的野生糙叶杜鹃插穗生根效果最好，生根率达到78.65 % 。采用外源生长激素处理杜鹃半木质化茎段可以有效促使其生根，且生根率相当高，这与前人的研究一致(Geng et al.，2007 ;Chen et al.，2009)。

本研究通过对插穗生根过程中内源激素含量动态变化的研究来探讨其扦插生根机理。糙叶杜鹃扦插生根过程中，较高的内源 IAA 含量及较低的内源 ABA 含量有利于生根，GA₃含量与插穗愈伤组织的诱导、不定根的形成呈现为正相关性。插穗在产生愈伤组织时需消耗部分内源 ZR，在不定根产生后自身合成内源 ZR。处理插穗的 IAA / ABA 比值均高于对照，在生根过程中 IAA / ABA 比值较小是糙叶杜鹃扦插难生根的主要原因之一。 Hausman(1993)认为高浓度的 IAA和不定根的形成密切相关，但是低浓度也会促使根的形成。同时，许多研究表明激素在植物生根过程中起着重要作用(Nag et al.，2001)。

可溶性糖含量的变化与植物抗逆性密切相关，它既可以作为渗透调节物质和防脱水剂，也可作为抗氧化剂对植物起到一定的防护作用。插穗生根时需要一定的营养物质，一般脂肪利用较少，而碳水化合物和氮素化合物则利用较多(王新建等，2009 ;孙红梅等，2011)。本研究中在扦插的前期，处理插穗可溶性糖含量上升，不定根的发生期需要消耗大量的营养物质，因此可溶性糖含量呈下降趋势。不定根形成后插穗自身合成糖类物质，插穗内可溶性糖含量有呈缓慢上升趋势。糙叶杜鹃插穗在生根过程中氮素含量的降低有利于糙叶杜鹃插穗不定根的生成。

大量研究表明，逆境会影响植物的酶促系统。其中 POD，SOD，CAT 酶共同组成植物体内一个有效的活性氧清除系统，三者协调一致的共同作用，能有效地清除植物体内的自由基和过氧化物，因此 SOD 活性与植物扦插生根过程有着密切的关系。糙叶杜鹃处理插穗的 SOD 活性明显高于对照，说明外源激素处理提高插穗的 SOD 活性。扦插初期插穗离开母株的逆境状态导致 SOD 活性升高，之后随着不定根产生和生长逆境状态逐渐缓和导致 SOD 活性逐渐降低。

植物插穗的 POD 活性关系到其插穗愈伤组织形成能力，是植物插穗生根的标志之一，POD 对生根起促进作用(宋金耀等，2001)。植物在逆境胁迫时，可以诱导植物组织 POD 活性的升高，这主要是植物对逆境胁迫的响应。本研究中处理的糙叶杜鹃插穗 POD 活性在前期处于升高的趋势，印证了 POD 活性在受胁迫时升高的观点。 CAT 能有效地阻止H₂O₂等的积累，限制自由基对膜脂过氧化的启动及危害(Scandalios，1993)。本研究中处理的糙叶杜鹃 CAT 活性变化呈“降低—升高—降低—升高”的趋势，生根后期糙叶杜鹃的 CAT 活性维持在较高的水平，可能与生根后呼吸作用的加强有关。

杜鹃属植物中普遍存在酚类物质，酚类的存在导致其扦插茎段基部褐化现象，无性系插穗的生根率、质量与插穗内各种酚类呈负相关关系(麻文俊等，2011)。在酚类褐化中，PPO 起着催化酚类物质的氧化的作用，由此影响着植物扦插的生根状况，高活性的 PPO 有利于不定根的形成(Trebst，1995)。同时 PPO 还参与其他生化合成途径，参与光合作用，调节叶绿体中有害的光氧化反应速度，还参与其中电子传递起能量转换作用(付喜玲等，2009)。糙叶杜鹃插穗在扦插前期处理和对照的 PPO 活性升高的原因可能是插穗的基部等酚类物质的渗出使切口部位产生活跃的氧化等生理活动。PPO 活性的增加有利于根源基的发育和不定根的诱导，促进不定根的形成(王新建等，2009)。

植物插穗生根过程的机制较为复杂，影响糙叶杜鹃插穗生根的生理生化因素也是多方面的，对于野生杜鹃不同种类间生根差异和机理仍需要大量实践探索。目前杜鹃扦插繁殖系数低、生根周期长等仍是目前制约规模化繁殖的问题，因此深入研究杜鹃扦插繁殖的生根机理和生理代谢机制，建立缩短繁育周期技术体系，将会成为野生杜鹃推广的重要课题。