引用本文
李琰, 杨钰琪, 陈培, 冯俊涛, 张兴. 2013. 培养基成分对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响[J]. 林业科学, 49(5): 71-76.
Li Yan, Yang Yuqi, Chen Pei, Feng Juntao, Zhang Xing. 2013. Effects of Medium Components on the Growth and Secondary Metabolites Contents in Adventitious Roots of
Tripterygium wilfordii. Scientia Silvae Sinicae, 49(5): 71-76. DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130510
培养基成分对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
李琰1, 2,
杨钰琪1, 2,
陈培1, 2,
冯俊涛2,
张兴2
1. 西北农林科技大学生命科学学院 杨凌 712100;
2. 西北农林科技大学无公害农药研究服务中心/陕西省生物农药工程技术研究中心 杨凌 712100
收稿日期：2012-05-07；修回日期：2012-07-08
基金项目：公益性行业(农业)科研专项(200903052)；陕西省“13115”科技创新工程重大科技专项(2009ZDKG-01)
通讯作者：张兴
摘要：以NT为基本培养基,以雷公藤不定根为材料,研究NT培养基中氮总量、硝态氮和铵态氮之比、磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐浓度对雷公藤不定根生长及雷公藤甲素和总生物碱含量的影响。结果表明：适合雷公藤不定根生长的培养基中氮含量为NT培养基的1.7倍,NO3-/NH4+为9：1,PO43-浓度、K+浓度、Ca2+浓度、Mg2+浓度为NT培养基的2倍,Fe2+浓度不变。NT培养基中原有的Mg2+浓度、总氮浓度及其比例，1.7倍的PO43-浓度，1.3倍的K+浓度，2/3的Ca2+浓度，1/3的Fe2+浓度比较适合雷公藤甲素的积累。而对雷公藤总生物碱的积累各成分的最佳浓度为:NT培养基中原有的PO43-,K+,Ca2+,Mg2+浓度,将硝态氮全部换成铵态氮以及1/3的Fe2+浓度。
关键词：
雷公藤 不定根 组织培养 雷公藤甲素 雷公藤总生物碱
Effects of Medium Components on the Growth and Secondary Metabolites Contents in Adventitious Roots of Tripterygium wilfordii
Li Yan1, 2,
Yang Yuqi1, 2,
Chen Pei1, 2,
Feng Juntao2,
Zhang Xing2
1. College of Life Science, Northwest A&F University Yangling 712100;
2. Research and DevelopmeNTCenter of Biorational Pesticide Northwest A&F University/Shaanxi Province Technology and Engineering Center of Biopesticide Yangling 712100
Abstract: In this paper the adventitious root of Tripterygium wilfordii was used as experimeNTmaterial to study effects of differeNTcomponents in NTmedium on the growth, triptolide and total alkaloid contents of the adventitious roots. The components include total nitrogen, the ratio of nitrate nitrogen and ammonium nitrogen, and differeNTconcentrations of PO43-, K+, Ca2+, Mg2+, Fe2+ etc. Additionally, this study was also to explore the change patterns of secondary metabolites and total alkaloid of the adventitious roots. The results showed that the optimal NTmedium composition for the root growth was 1.7 strength of nitrogen, 9：1 of NO3-/NH4+, and 2 strengths of PO43-, K+, Ca2+ and Mg2+, without change in Fe2+ conentration. The basic NTMg2+ concentration, total nitrogen concentration and the NO3-/NH4+ ratio, 1.7 strength of PO43-, 1.3 strength of K+, 2/3 strength of Ca2+ , and 1/3 strength of Fe2+ were relatively favorable for the accumulation of triptolide. As for the accumulation of total alkaloids, the optimal componeNTcomposition was the basic NTPO43- , K+, Ca2+ and Mg2+concentration, but completely replacing the nitrate nitrogen with ammonium nitrogen, and 1/3 strength of Fe2+.
Key words:
Tripterygium wilfordii adventitious root tissue culture triptolide total alkaloids
雷公藤甲素和雷公藤生物碱是从雷公藤(Tripterygium wilfordii)根皮中分离提取得到的一类次生代谢产物(Brinker et al.，2005; Tao et al.，1995)，这类化合物不仅是一类很好的免疫抑制药物以及治疗类风湿性关节炎的有效成分(林绥等，2009; Li et al.，2010; Johnson et al.，2011)，也是重要的杀虫有效成分(周琳等，2006; 罗都强等，2001; Swingle et al.，1941)。在解决临床用药和生物农药的开发方面，研究雷公藤甲素和雷公藤生物碱的药源问题中起着不可替代的作用。这些有效成分人工合成困难(Fu et al.，2006; Aoyagi et al.，2008)，价格昂贵，市场需求量大，而且资源日益遭到破坏，限制了市场开发新药以及生物农药的使用。因此，利用室内工厂化生产雷公藤次生代谢产物为解决这一问题的一条有效途径(于树宏等，1998;Ramachandra et al.，2002)。笔者前期探讨了利用植物组织培养方法生产雷公藤次生代谢产物的可能性(李琰等，2008; 2009; 2010)。本试验主要研究NT培养基中主要成分氮总量、硝态氮和铵态氮之比、磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐浓度对雷公藤不定根生长和次生代谢产物甲素及总生物碱积累的影响，为进一步进行工厂化生产雷公藤次生代谢产物提供技术参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
利用雷公藤根系诱导愈伤组织进一步建立的悬浮细胞。悬浮细胞经多次继代培养，诱导使其形成不定根，经过驯化培养的不定根作为供试材料。
1.2 试验方法
试验以NT培养基为标准，总氮量对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响试验中，保持NO3-/NH4+ 比例不变，浓度梯度设为0、标准浓度的1/3，2/3，标准浓度(CK)，4/3，5/3，2倍，7/3，8/3，3倍10个水平; NO3-/NH4+ 之比对雷公藤不定根生长和雷公藤甲素及生物碱含量的影响试验中，总氮量以NT培养基为标准，NO3-/NH4+ 之比分别0：10，1：9，3：7，5：5，7：3(CK)，8：2，9：1，10：0 8个水平;其余磷酸盐、钾盐、钙盐、镁盐、铁盐浓度对雷公藤不定根生长和雷公藤甲素及生物碱含量的影响试验中依次设为0、标准浓度的1/3，2/3，标准浓度(CK)，4/3，5/3，2倍7个水平(其余成分以NT培养基为标准)，按试验设计在培养基配制时分别添加不同质量浓度的物质。
以上培养基，分别添加1.0 mg·L-1 2，4-D+0.5mg·L-1 KT+4.0 mg·L-1 NAA，蔗糖均为30 g·L-1，pH 用PHS-2C 型酸度计高压灭菌前调至5.8。培养容器为250 mL 三角瓶，每瓶加入100 mL培养液，120 ℃高压灭菌30 min，每瓶接种量为每升培养基8~12 g新鲜不定根，每个处理设5 次重复。培养室温度(25±1)℃，摇床转速120 r·min-1，继代培养45~50 天收获。将不定根用蒸馏水冲洗干净，并冷冻干燥至恒质量，计算不定根增长量，将其粉碎过60 目筛后备用。
不定根增长量计算方法为：不定根增长量=收获量/瓶-接种量/瓶
1.3 次生代谢产物含量的测定
参照文献(李琰等，2009)的方法进行。
2 结果与分析
2.1 培养基中总含氮量对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
雷公藤不定根增长量随着培养基中总氮浓度的升高而升高(表 1)，当总氮浓度为50 mmol·L-1时，不定根增长量最高，然后随着总氮浓度的增加反而对其生长不利。而雷公藤甲素和总生物碱含量及产量的最大值是在30 mmol·L-1，也即NT培养基的标准浓度。说明NT培养基中的总氮浓度适合不定根中雷公藤甲素和总生物碱的积累，而对于雷公藤不定根的生长需要的总氮浓度为NT培养基1.7倍。
表 1 NT培养基中总氮量对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响①
Tab.1 Effects of total nitrogen on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
表 1 NT培养基中总氮量对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响①
Tab.1 Effects of total nitrogen on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
| 总氮量 Total nitrogen/(mmol·L-1) |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0 |
0.39±0.03 g |
11.71±0.49 f |
4.57±0.35 i |
1.69±0.06 d |
0.66±0.05 h |
| 10 |
0.75±0.03 f |
22.90± 1.23 d |
17.18±0.61 h |
1.96±0.10 c |
1.47±0.05 f |
| 20 |
1.01±0.03 e |
28.26± 1.96 c |
28.44±0.91 e |
2.31±0.12 b |
2.33±0.07 d |
| 30(CK) |
1.37±0.02 ab |
39.14± 1.91 a |
53.75±0.60 a |
2.97±0.08 a |
4.08±0.05 a |
| 40 |
1.40±0.03 a |
33.49±1.82 b |
46.88±0.89 b |
2.82±0.08 a |
3.94±0.08 a |
| 50 |
1.43±0.02 a |
28.72± 1.37 c |
40.98±0.44 c |
2.37±0.04 b |
3.39±0.04 b |
| 60 |
1.37±0.03 ab |
23.18± 1.26 d |
31.84±0.58 d |
1.96±0.08 c |
2.69±0.05 c |
| 70 |
1.30±0.04 bc |
17.58± 1.10 e |
22.86±0.63 f |
1.30±0.05 e |
1.69±0.05 e |
| 80 |
1.25±0.02 c |
16.70±0.70 e |
20.82±0.35 g |
1.11±0.03 e |
1.39±0.02 f |
| 90 |
1.14±0.03 d |
14.96±0.75 ef |
17.00±0.46 h |
0.81±0.02 f |
0.92±0.03 g |
| ①表中数据为3次重复的平均值。不同字母表示经Duncan 氏新复极差测验差异显著(P＜0.05)。Data in the column are the means of three repetitions. Different letters in the columns show significant difference at P＜0.05 by Duncan’s multiple test. 下同。The same below. |
|
2.2 硝态氮和铵态氮之比对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
以NT为基本培养基，对保持总氮浓度不变NO3-/NH4+ 比例不同的8个处理中(表 2)，培养基中只有铵态氮存在时不仅限制了不定根的生长，也抑制不定根中雷公藤甲素的形成，但有利于不定根中总生物碱的形成，此时总生物碱含量为正常标准的1.3倍，总生物碱含量随着硝态氮浓度的增加成下降趋势。而后，随着硝态氮浓度的增加，雷公藤甲素含量和产量最大值出现在NT培养基中2种氮源比例为7：3时，而最有利于不定根生长的硝态氮和铵态氮之比为9：1，NO3-/NH4+ 之比为5：5时总生物碱产量达最大值。培养基中只有硝态氮时，不仅不利于不定根的生长，也不利于雷公藤甲素和总生物碱的积累。
表 2 NT 培养基中NO3-/NH4+之比对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.2 Effects of NO3-/NH4+on the growth and secondary metabolites contents of T． wilfordii adventitious root
表 2 NT 培养基中NO3-/NH4+之比对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.2 Effects of NO3-/NH4+on the growth and secondary metabolites contents of T． wilfordii adventitious root
| NO3-/NH4+ |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0：10 |
0.43±0.03 g |
2.26±0.23 e |
0.98±0.07 g |
3.82±0.07 a |
1.65±0.12 e |
| 1：9 |
0.65±0.04 f |
11.84±0.66 d |
7.66±0.49 f |
3.55±0.07 b |
2.29±0.15 d |
| 3：7 |
0.96±0.02 e |
30.19±1.78 c |
28.98±0.60 c |
3.41±0.06 bc |
3.28±0.07 b |
| 5：5 |
1.31±0.03 cd |
35.50±0.89 b |
46.39±1.09 b |
3.24±0.09 c |
4.24±0.10 a |
| 7：3(CK) |
1.37±0.02 bc |
39.61±1.90 a |
54.40±0.83 a |
2.96±0.07 d |
4.07±0.06 a |
| 8：2 |
1.44±0.03 ab |
32.67±1.13 bc |
47.16±0.82 b |
2.40±0.05 e |
3.47±0.06 b |
| 9：1 |
1.52±0.02 a |
14.79±0.69 d |
22.47±0.30 d |
2.30±0.08 e |
3.49±0.05 b |
| 10：0 |
1.29±0.02 d |
12.16±0.95 d |
15.73±0.25 e |
2.09±0.07 f |
2.71±0.04 c |
|
2.3 磷酸盐浓度对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
培养基中不添加磷酸盐时，不仅制约了雷公藤不定根的生长，2种次生代谢产物的合成也受到一定的限制(表 3)。在本试验中，不定根增长量及雷公藤甲素含量和PO43-浓度成正相关，总生物碱的含量及产量的最高值出现在NT培养基中原有的PO43-4浓度，PO43-4浓度过高或者过低均不利于不定根中总生物碱的积累。当PO43-4浓度加倍时，总生物碱含量仅为正常标准的一半，此时雷公藤甲素含量是正常标准的1.2倍。
表 3 NT培养基中磷酸盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.3 Effects of PO43- on the growth and secondary metabolites contents of T. wilfordii adventitious root
表 3 NT培养基中磷酸盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.3 Effects of PO43- on the growth and secondary metabolites contents of T. wilfordii adventitious root
| PO43- |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0 |
1.06±0.03 e |
12.88±0.57 e |
13.69±0.41 g |
1.49±0.05 d |
1.58±0.05 g |
| 1.7 |
1.25±0.01 d |
25.88±1.22d |
32.34±0.26 f |
1.59±0.04 d |
1.99±0.02 f |
| 3.3 |
1.30±0.02 cd |
30.50±2.00 c |
39.54±0.64 e |
2.02±0.07 c |
2.62±0.04 d |
| 5(CK) |
1.36±0.02 bc |
39.78±1.15 b |
54.11±0.80 d |
3.20±0.11 a |
4.35±0.06 a |
| 6.7 |
1.38±0.02 b |
41.95±1.46 b |
58.03±0.64 c |
2.72±0.09 b |
3.77±0.04 b |
| 8.3 |
1.42±0.03 ab |
43.05±1.19 b |
60.99±1.08 b |
2.05±0.09 c |
2.90±0.05 c |
| 10 |
1.46±0.03 a |
47.61±1.45 a |
69.35±1.45 a |
1.61±0.04 d |
2.35±0.05 e |
|
2.4 钾盐浓度对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
对不同K+盐浓度的7个处理，当培养基中缺乏钾盐时，不仅限制了雷公藤不定根的生长，也限制2种次生代谢产物的合成。随着K+浓度的升高，不定根增长量、雷公藤甲素及总生物碱含量也逐渐升高，在本试验中，不定根增长量和K+浓度成正相关，雷公藤甲素含量最高是在K+浓度为19.2 mmol·L-1时，而适合总生物碱积累的K+最佳浓度是NT培养基的标准浓度(表 4)，说明雷公藤不定根的生长需要较高的K+浓度，而不定根中雷公藤甲素和总生物碱的形成需要的K+浓度较低。
表 4 NT培养基中钾盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.4 Effects of K+ on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
表 4 NT培养基中钾盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.4 Effects of K+ on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
| K+浓度 K+ concentration/(mmol·L-1) |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0 |
1.03±0.04 d |
1.67±0.05 e |
1.72±0.07 g |
1.67±0.05 e |
1.72±0.07 |
| 4.8 |
1.21±0.03 c |
3.64±0.08 e |
4.42±0.11 f |
2.23± 0.04 d |
2.71± 0.07 |
| 9.6 |
1.30±0.04 bc |
20.11± 1.00 d |
26.07± 0.81 e |
2.47± 0.04 c |
3.20±0.10 |
| 14.4(CK) |
1.36±0.03 ab |
39.56± 1.45 b |
53.93± 1.00 c |
3.04±0.07 a |
4.15± 0.08 |
| 19.2 |
1.37±0.03 ab |
46.13± 1.69 a |
63.36± 1.16 a |
2.87±0.07 b |
3.94± 0.07 |
| 24 |
1.42±0.03 a |
40.96± 1.29 b |
58.03±1.03 b |
2.21± 0.07 d |
3.13±0.06 |
| 28.8 |
1.44±0.02 a |
33.07± 1.02 c |
47.73± 0.69 d |
2.18±0.03 d |
3.15±0.05 |
|
2.5 钙盐浓度对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
钙盐浓度对雷公藤不定根的生长、2种次生代谢产物的形成均有较大的影响，在本试验中，不定根增长量和钙盐浓度成正相关，最适合雷公藤甲素积累的钙盐浓度为1.0 mmol·L-1，而NT培养基中的钙盐浓度则适合总生物碱的合成，当钙盐浓度加倍时，雷公藤甲素含量仅为正常标准的38%，总生物碱含量为正常标准的57%(表 5)。
表 5 NT培养基中钙盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.5 Effects of Ca2+ on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
表 5 NT培养基中钙盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.5 Effects of Ca2+ on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
| Ca2+浓度 Ca2+ concentration/(mmol·L-1) |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0 |
0.94±0.03 d |
8.22±0.29 e |
7.76±0.25 f |
2.65±0.08 c |
2.50±0.08 e |
| 0.5 |
1.08±0.03 c |
17.59±0.51 cd |
19.00±0.47 e |
2.68±0.06 c |
2.89±0.07 d |
| 1 |
1.29±0.04 b |
42.53±1.85 a |
54.72±1.72 a |
2.86±0.06 ab |
3.68±0.12 b |
| 1.5(CK) |
1.37±0.02 a |
40.10±2.71 a |
55.07±0.61 a |
3.03±0.08 a |
4.16±0.05 a |
| 2 |
1.41±0.03 a |
29.32±1.65 b |
41.34±0.88 b |
2.74±0.07 b |
3.86±0.08 b |
| 2.5 |
1.44±0.02 a |
20.03±0.82 c |
28.85±0.40 c |
2.24±0.06 c |
3.23±0.05 c |
| 3 |
1.45±0.03 a |
15.45±0.55 d |
22.41±0.41 d |
1.73±0.02 de |
2.52±0.05 e |
|
2.6 镁盐浓度对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
雷公藤不定根的生长需要较高浓度的Mg2+，在本试验中，不定根增长量和Mg2+浓度成正相关，NT培养基中的Mg2+浓度则适合雷公藤甲素和总生物碱的合成，Mg2+浓度过高或者过低均对其合成不利，当Mg2+浓度为NT培养基的2倍时，雷公藤甲素含量仅为正常标准的一半(表 6)。
表 6 NT培养基中镁盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.6 Effects of Mg2+ on the growth and secondary metabolites contents of T. wilfordii adventitious root
表 6 NT培养基中镁盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.6 Effects of Mg2+ on the growth and secondary metabolites contents of T. wilfordii adventitious root
| Mg2+浓度 Mg2+ concentration/(mmol·L-1) |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0 |
0.92±0.05 d |
26.36±1.64 c |
24.16±1.25 e |
2.29±0.05 d |
2.10±0.11 e |
| 1.7 |
1.01±0.03 c |
29.62±0.71 bc |
29.92±0.89 d |
2.40±0.05 cd |
2.42±0.07 d |
| 3.3 |
1.26±0.02 b |
36.06±2.12 a |
45.32±0.55 b |
2.71±0.08 b |
3.41±0.04 c |
| 5(CK) |
1.37±0.02 a |
39.83±1.48 a |
54.43±0.92 a |
3.10±0.11 a |
4.23±0.07 a |
| 6.7 |
1.38±0.02 a |
31.97±1.16 b |
44.12±0.64 b |
2.85±0.05 b |
3.93±0.06 b |
| 8.3 |
1.40±0.03 a |
28.34±1.51 bc |
39.58±0.71 c |
2.48±0.04 c |
3.46±0.06 c |
| 10 |
1.43±0.03 a |
20.71±0.64 d |
29.61±0.55 d |
2.38±0.03 cd |
3.41±0.06 c |
|
2.7 铁盐浓度对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
对不同铁盐浓度的试验表明，NT培养基中铁盐浓度可使雷公藤不定根的增长量达到最大值，而正常标准的1/3可满足不定根中雷公藤甲素和总生物碱的积累，但铁盐浓度升高对雷公藤不定根的生长并没有太大影响，但严重影响了2种次生代谢产物的形成(表 7)。
表 7 NT培养基中铁盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.7 Effects of Fe2+ on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
表 7 NT培养基中铁盐对雷公藤不定根生长和次生代谢产物含量的影响
Tab.7 Effects of Fe2+ on the growth and secondary metabolites contents of T.wilfordii adventitious root
| Fe2+浓度 Fe2+ concentration/(mmol·L-1) |
增长量 Increment(DW)/g |
雷公藤甲素含量 Triptolide content/(μg·g-1) |
雷公藤甲素产量 Triptolide yield/μg |
总生物碱含量 Total alkaloids content/(mg·g-1) |
总生物碱产量 Total alkaloids yield/mg |
| 0 |
1.05±0.03 c |
28.16±1.26 d |
29.67±0.86 c |
2.99±0.13 c |
3.15±0.09 d |
| 0.03 |
1.21±0.03 b |
45.35±2.46 a |
55.03±1.14 a |
3.59±0.04 a |
4.36±0.09 a |
| 0.07 |
1.27±0.03 b |
41.77±1.46 ab |
52.91±1.28 a |
3.20±0.03 b |
4.06±0.10 b |
| 0.1(CK) |
1.36±0.02 a |
39.81±1.56 b |
54.15±0.80 a |
2.95±0.06 c |
4.01±0.06 b |
| 0.13 |
1.37±0.02 a |
33.65±0.65 c |
45.99±0.70 b |
2.55±0.06 d |
3.48±0.05 c |
| 0.17 |
1.37±0.03 a |
22.13±1.00 e |
30.32±0.59 c |
2.23±0.03 e |
3.05±0.06 d |
| 0.2 |
1.36±0.02 a |
12.68±0.54 f |
17.20±0.19 d |
1.99±0.04 f |
2.70±0.03 e |
|
3 讨论
培养基的组成成分对植物细胞培养和次生代谢产物的形成起着至关重要的作用，但是每种离体培养物的生长和代谢，所需要的营养成分的浓度常有所差异。为了适应不同培养物对生长和代谢对各种营养元素需求，研究人员设计出高盐、高氮、中盐、低盐等各种类型的基本培养基(上官新晨等，2006)，一般认为无机盐浓度较高时适合培养物的生长，无机盐浓度较低时适合次生代谢产物的形成。
本试验结果表明：NT培养基中硝态氮和氨态氮之比对不定根增长量影响最为明显。一般认为植物组织培养采用的是混合氮源，以铵盐或者硝酸盐作为唯一氮源时，往往不利于细胞的生长和次级代谢物的积累(张宗申等，2009)。本试验中也得到了印证，Moreno等(1995)在对紫草宁(shikonin)衍生物的合成试验中也取得类似的结果。邓建平等(2010)在对葡萄(Vitis amurensis)愈伤组织研究中发现，全硝态氮和全铵态氮对葡萄愈伤组织生长和白藜芦醇的形成都有不利影响。这一现象在宋经元等(2008)离体培养的铁皮石斛(Dendrobiumcandidum)原球茎以及杨善云等(2005)对沙打旺(Astragalus adsurgens)的组培根试验中也得到了证实。在组织培养中，虽然铵态氮是直接被利用，但细胞大量利用铵盐后，会引起培养基pH 值下降，对细胞造成毒害，从而抑制细胞的生长和代谢产物的形成(郭肖红等，2007)。Kim等(2002)也认为氮源的种类和浓度对细胞生长和次生产物合成的影响非常显著。
本试验发现：除铁盐外其他大量元素浓度是在NT培养基正常标准的2倍时，最有利于雷公藤不定根的生长，而不定根中次生代谢产物的合成所需要的无机盐浓度一般都较低。由此人们在离体培养设计培养基时，培养物的生长和次生代谢产物的形成时往往选用的培养基也不同。在紫草(Lithospermumerythrorhizon)细胞培养时采用的就是生长培养基MG-5和合成紫草宁的生产培养基M-9 的2 阶段培养法(Fujita et al.，1981)，这2种培养基中，生长培养基中无机盐的浓度远远高于生产培养基。芦韦华等(2012)在对新疆紫草(Arnebia euchroma)毛状根培养生产紫草素的研究中也采用了这种两步培养法，并取得了很好的效果。本试验中，利用不定根培养生产雷公藤代谢产物时，不定根生长和雷公藤甲素及生物碱的形成所需要的大量元素差异也比较大，因此，可采用在无机盐浓度较高的生长培养基上让雷公藤不定根先快速繁殖，然后再转到无机盐浓度较低的生产培养基上使其合成所需的代谢产物。但雷公藤不定根的生长和雷公藤甲素和生物碱的形成是多种营养元素共同作用的结果，雷公藤不定根培养的两步培养法中各种成分之间的交互作用以及生长培养基和生产培养的最优组合还需进一步研究。
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本文献在全文中的定位：
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在对紫草宁(shikonin)衍生物的合成试验中也取得类似的结果。
邓建平等(2010)在对葡萄(
Vitis amurensis)愈伤组织研究中发现，全硝态氮和全铵态氮对葡
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2009;
2010)。本试验主要研究NT培养基中主要成分氮总量、硝态氮和铵态氮之比、磷酸
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这2种培养基中，生长培养基中无机盐的浓度远远高于生产培养基。
芦韦华等(2012)在对新疆紫草(
Arnebia euchroma)毛状根培养生产紫草素的研究中也采用了这
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素需求，研究人员设计出高盐、高氮、中盐、低盐等各种类型的基本培养基(
上官新晨等，2006)，一般认为无机盐浓度较高时适合培养物的生长，无机盐浓度较低时适合次
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本文献在全文中的定位：
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全铵态氮对葡萄愈伤组织生长和白藜芦醇的形成都有不利影响。这一现象在
宋经元等(2008)离体培养的铁皮石斛(
Dendrobiumcandidum)原球茎以及
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离体培养的铁皮石斛(
Dendrobiumcandidum)原球茎以及
杨善云等(2005)对沙打旺(
Astragalus adsurgens)的组培根试验中也得到了证实。在组织培养
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本文献在全文中的定位：
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盐或者硝酸盐作为唯一氮源时，往往不利于细胞的生长和次级代谢物的积累(
张宗申等，2009)。本试验中也得到了印证
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时采用的就是生长培养基MG-5和合成紫草宁的生产培养基M-9 的2 阶段培养法(
Fujita et al.，1981)，这2种培养基中，生长培养基中无机盐的浓度远远高于生产培养基
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本试验中也得到了印证，
Moreno等(1995)在对紫草宁(shikonin)衍生物的合成试验中也取得类似的结果。
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2013, Vol. 49