Ca²⁺是植物细胞中重要的信号物质，参与许多逆境下生理信号的转导。植物干旱胁迫下产生的Ca²⁺信号，可通过与钙调蛋白等钙受体结合，放大信号并进行震荡传递，以此调节气孔关闭及活性氧的产生(Knight et al.，1997; Shinozaki，1997; 宗会等，2001)，作出抵御逆境的有利反应。外源Ca²⁺能通过钙受体-三磷酸肌醇途径与植物体内钙信号产生偶联，从而发挥其生理调节作用(Han et al.，2003; Tang et al.，2007)。毛竹(Phyllostachys edulis)是我国南方重要经济树种，但生长进程中特别是秋季笋芽分化期经常会遭遇季节性干旱，致使毛竹的生长和竹笋的产量受到较大影响。目前，有关毛竹干旱胁迫的研究较少，主要集中在干旱对毛竹出笋(李龙有等，1987)、新竹生长(毛美红等，2012)和苗期生理特性影响(应叶青等，2011)等方面，而对于Ca²⁺调控毛竹的抗旱机制未见报道。本研究利用激光共聚焦显微技术研究干旱胁迫条件下毛竹根尖内Ca²⁺浓度的变化，探讨了外源Ca²⁺对毛竹抗旱相关酶防御系统的影响，为进一步研究Ca²⁺信号影响毛竹的抗旱生理机制奠定基础，并为施用外源钙缓解毛竹干旱胁迫提供理论依据。

以种子培育毛竹实生苗用于根系Ca²⁺分布的观测。毛竹种子采自桂林同一单株，按GB2772-1999方法检验，净度为98.99%，千粒质量为13.645 g，含水量为12.2%。挑选饱满有光泽的毛竹种子剥掉种皮，温水(25 ℃)浸泡24 h，置于发芽盒内蒸馏水润湿的滤纸上，在恒温培养箱中培养(28 ℃ 16 h/25 ℃ 8 h，湿度70%)，每天定时补充水分，更换滤纸，剔除霉烂和生长状态不良的幼苗。15天左右，幼根约1.5 cm时，用于PEG水培试验。

将前期按上述方法萌发并移栽于营养钵、生长相对一致的3年生毛竹实生苗用于盆栽试验。

试验处理分为水培和土培处理。水培试验选用PEG6000溶液模拟干旱，设置对照(0% PEG)、轻度胁迫(5% PEG)、中度胁迫(12.5% PEG)和重度胁迫(20% PEG)等4种处理，每个处理设置3重复，每重复3盆，干旱胁迫时间设置为5，10，15和20 min。

盆栽试验于2011年5月进行，设置对照(不添加试剂)、添加外源Ca²⁺处理(CaCl₂)以及添加4种钙信号阻断剂处理，包括乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)，肝磷脂(heparin)，三氯化镧(LaCl₃)和氯丙嗪(CPZ)等。土壤水分控制在最大田间持水量的40%(称质量法控制)，各种添加剂使用依据相关文献(刘娥娥等，2002; 高洪波等，2005)，以土壤含水量为基数进行换算，每个处理设置3个重复，每个重复5盆。试验用样品选择每隔5天采样1次，连续采6次，于早上8点半随机取毛竹功能叶片放入冰盒带回实验室进行相关指标的测定。

Ca²⁺的观察采用荧光标记和激光共聚焦显微镜观察技术。选取各试验处理后毛竹根尖进行Ca²⁺荧光标记。标记方法参照相关文献(肖玉梅等，2004; Zhang et al.，1998)，并有所改进。先将Fluo-3/AM(Molecular Probe，美国)溶于无水二甲基亚砜，使其浓度达到1 mmol·L^-1，然后在体视显微镜下切下毛竹根尖(约5 mm)置于2-乙磺酸(MES)缓冲液中(含20 μmol·L^-1Fluo^-3AM)，进行避光孵育(4 ℃，2 h/25 ℃，1 h)。最后将冲洗干净的根尖放在载玻片上，并加0.5 mL的缓冲液，用于激光共聚焦显微镜(LSM510)进行观察和扫描(激发波长488 nm，LP540 nm荧光收集)。扫描结果中Ca²⁺荧光的强弱及位置分别代表着Ca²⁺浓度大小及分布。

酶活性和生化物质含量测定主要依据相关文献(邹琦，2000; 李合生，2000)。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)测定; 超氧化物歧化酶(SOD)活性用NBT法，酶活性单位定义为将NBT的还原一直到对照一般时(50%)所需的酶量，以样品(鲜质量)所含总蛋白量计算酶活性; 过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法，以样品(鲜质量)所含总蛋白量计算酶活性; 过氧化氢酶活性采用紫外吸收法测定。

数据分析采用SAS 9.1软件，绘图采用Sigmaplot软件进行。

1)毛竹根尖Ca²⁺分布特点毛竹的根尖结构从下至上依次可以分为根冠、分生区、伸长区和根毛区4个部分(图 1)。Ca²⁺荧光信号为绿色，绿色信号的强弱及分布区域代表Ca²⁺的多少及分布区域。

	图 1 毛竹根尖Ca2+分布(× 10) Fig. 1 The distribution of Ca2+ at the tip of Ph. edulis root( × 10)

图 1是激光共聚焦显微镜10倍物镜所拍摄图片，图 2是4倍物镜所拍摄的毛竹根尖不同层面的图片。由图 1可以看出: 根冠和伸长区分布有较多的Ca²⁺，分生区虽然也有Ca²⁺分布，但是明显较根冠和伸长区少。由图 2断层扫描结果同样可以看出: 分生组织区Ca²⁺荧光强度最弱(箭头所指)，根冠和伸长区的Ca²⁺荧光强度较强。

	图 2 毛竹根尖不同层面Ca2+分布 Fig. 2 The distribution of Ca2 + in the different sections of Ph. edulis root tip

2)干旱胁迫对毛竹根尖Ca²⁺分布的影响从处理15min的结果看，干旱胁迫越强，毛竹根尖细胞质中Ca²⁺分布越多，而细胞壁和细胞膜上分布减少，而对照毛竹根尖细胞的Ca²⁺主要分布在细胞壁及细胞核上(图 3A)。轻度胁迫时(5%PEG)细胞膜上的Ca²⁺浓度减弱，而细胞质中开始出现Ca²⁺(图 3B); PEG 浓度达到12.5%时这种现象更明显(图 3C); 重度胁迫时(20%PEG)，Ca²⁺已经比较均匀的充满了整个细胞质(图 3D)。干旱胁迫后Ca²⁺会汇集于细胞质中，干旱越严重，汇集越明显。

	图 3 处理15 min后毛竹根尖Ca2+分布 Fig. 3 The distribution of Ca2+ at the tip of Ph. edulis root under 20% PEG (15min) A. 对照Control;B. 5% PEG; C. 12. 5% PEG; D. 20% PEG

3)干旱程度和时间对毛竹根尖Ca²⁺荧光强度的影响随干旱胁迫程度加剧，毛竹根尖Ca²⁺荧光强度不断提高，以20%PEG处理的Ca²⁺强度最大，并且随胁迫时间延长Ca²⁺荧光强度呈现先上升后下降的趋势，各胁迫处理的荧光强度均在15 min时最强，而对照处理的Ca²⁺荧光强度随胁迫时间延长基本不变，保持在65个单位(图 4)。方差分析表明: 同一胁迫时间点上各不同干旱胁迫处理与对照的Ca²⁺荧光强度差异均达到极显著水平(P＜0.01)。这说明Ca²⁺对外界干旱胁迫作出了响应。另外，Ca²⁺荧光强度的大幅上升也暗示了胞外的Ca²⁺有可能通过各种通道进入了细胞内。

	图 4 干旱程度和时间对毛竹根尖的Ca2+强度影响 Fig. 4 The effect of drought stress level and stress time on the fluorescence intensity of Ca2+ at the tip of Ph. edulis root

1)外源Ca²⁺对细胞膜透性的影响相对电导率和MDA的含量变化能很好的表征细胞膜是否完好。随着干旱胁迫时间的延长，干旱胁迫处理(对照)以及干旱胁迫下添加外源Ca²⁺或抑制剂的处理，其电导率均呈现上升的趋势，处理25天后到达最大值;添加EGTA，heparin，LaCl3和CPZ等钙信号抑制剂处理，其各个时间点的相对电导率均显著高于对照(P＜0.05)，以heparin处理25天的相对电导率最高，超过对照10.1%。添加CaCl₂的处理的相对电导率与对照相比，前期(15天)差异不显著(P＞0.05)，15天后显著低于对照组(P＜0.05)(图 5)。这说明添加外源Ca²⁺一定时间后能显著降低膜透性，而钙信号的传导受到抑制后，膜透性增大，电导率显著上升。

	图 5 干旱胁迫下外源Ca2+及其信号抑制剂对毛竹叶片电导率的影响 Fig. 5 The effect of exogenous Ca2+ and its inhibitors on the electrical conductivity of Ph. edulis leaves under drought stress

随着干旱胁迫时间的延长，对照和其他处理的毛竹叶片MDA含量均呈上升趋势，处理25天时到达最大值。添加EGTA，GPZ和heparin等3种抑制剂处理，叶片MDA含量均显著高于对照(P＜0.05)，以EGTA处理25天时的MDA含量最高，达22.3 μmol·g^-1，超出对照10.2%; 添加LaCl₃抑制剂处理的MDA含量与对照相比差异不显著(P＞0.05)。添加外源CaCl2的处理MDA含量，各时间点上均低于对照和抑制剂处理的MDA含量，差异达极显著水平(P＜0.01)(图 6)。这说明外源Ca²⁺能一定程度缓解毛竹干旱胁迫引起的膜脂过氧化，产生较少的MDA，而多数钙信号抑制剂处理后会加剧膜脂过氧化，产生较多MDA，随处理时间延长，毛竹叶片的膜脂过氧化作用越明显，其膜结构和功能损坏越严重。

	图 6 不同处理对干旱胁迫下毛竹叶片MDA含量的影响 Fig. 6 The MDA content of Ph. edulis leaves with different treatment under drought stress

2)外源Ca²⁺和钙信号抑制剂对主要防御酶活性的影响随着干旱胁迫时间延长，对照和各处理的毛竹叶片的SOD活性均呈现上升趋势，处理25天时达到最大值。添加EGTA，heparin，LaCl₃和CPZ等4种钙信号抑制剂处理，其各个时间点的SOD活性均极显著低于对照和CaCl₂处理(P＜0.01)，以添加CPZ处理的SOD活性为最低，处理25天时仅有485 U·g^-1，为对照的72.1%。添加外源CaCl₂处理与对照间SOD活性差异显著(P＜0.05)(图 7)。这说明添加CaCl₂处理可能有利于干旱胁迫下毛竹叶片细胞膜SOD酶活性提高，而运用4种钙信号抑制剂阻断钙信号的传导后，则会显著降低细胞膜上SOD酶活性。

	图 7 不同处理对干旱胁迫下毛竹叶片SOD活性 Fig. 7 The of SOD cutivity Ph. edulis leaves with different treatment MDA content under drought stress

片POD活性均呈现先上升后下降的趋势，其中对照和CaCl₂处理的叶片POD活性均在15天时达到最大值，而EGTA，heparin，LaCl₃和CPZ等4种钙信号抑制剂处理的POD活性则在20天达到最大值，随后逐渐下降。对照和CaCl₂处理的叶片POD活性均高于4种抑制剂处理，15天时CaCl₂处理以及heparin，LaCl₃和CPZ抑制剂处理与对照间的差异均达到显著水平(P＜0.05)(图 8)，以CaCl₂处理的POD活性为最大值，达到102.98 U·g^-1 min^-1，超过对照11.4%; 以LaCl3处理POD活性为最小值，仅有56.4 U·g^-1 min^-1，为对照的65.5%。15天时，EGTA抑制剂处理与对照间的POD活性差异不显著(P＞0.05)。这说明heparin，LaCl₃和CPZ抑制剂对POD影响显著，EGTA影响则相对较小。

	图 8 不同处理对干旱胁迫下毛竹叶片POD含量影响 Fig. 8 The POD activity of Ph. edulis leaves with different treatment under drought stress

钙信号抑制剂和CaCl₂对毛竹叶片CAT的影响与对SOD影响较为相似。CAT活性随着处理时间均呈上升趋势，于25天时达到最大值。从第5天开始，4种钙信号抑制剂处理的CAT酶活性均极显著低于对照和CaCl₂处理(P＜0.01)。处理25天时EGTA抑制剂处理的CAT活性仅为3 395U·g^-1min^-1，为对照的60.2%。而从处理10天开始，CaCl₂处理的CAT活性均要显著高于对照(P＜0.05)(图 9)。这说明外源Ca²⁺能够有效提高细胞膜CAT活性，而添加钙信号抑制剂则会明显降低细胞膜CAT活性。

	图 9 不同处理对干旱胁迫下毛竹叶片CAT活性的影响 Fig. 9 The CAT activity of Ph. edulis leaves with different treatment under drought stress

Ca²⁺是维持植物细胞正常生理功能的重要离子。外界胁迫后，植物细胞内Ca²⁺浓度会急剧升高，形成胞内外的浓度差，从而产生钙信号。钙信号在转导过程中一方面依靠浓度的震荡传递，另一方面依靠其下游的功能蛋白，如钙调蛋白、Ca²⁺感应器以及蛋白激酶/蛋白磷酸酶级联系统等，放大其信号，调控植物生长以适应胁迫环境(刘贯山等，2003; Smyth et al.，2006; Rozi et al.，2003)。Ca²⁺浓度的改变是钙信号转导系统的中心环节，外界胁迫所引发的最初反应几乎都是引起Ca²⁺浓度的升高(Hetheington et al.，2004)。本研究发现干旱胁迫下毛竹根尖的Ca²⁺呈不均匀分布，根尖的根冠和伸长区分布有较多Ca²⁺，分生区分布较少; 一定程度干旱胁迫后引起细胞内Ca²⁺浓度大幅升高，并且在Ca²⁺富集在细胞质内。细胞内游离Ca²⁺浓度的增加可能是胞外Ca²⁺通过专用通道的开启进入胞内的结果(Grabov et al.，1998)。

植物在干旱胁迫下会诱导SOD，POD，CAT等保护酶活性，以有效地清除自由基，保持体内活性氧的平衡，降低膜脂过氧化和MDA 积累量，增强植物的逆境适应性或抗性(Bolwer et al.，1992; Smirnoff et al.，1993; Scandalios et al.，1993)。适量的外源Ca²⁺供给能提高植物体内SOD，POD和CAT的活性或使之保持较高水平(Gong et al.，1995; 高洪波等，2005; 惠竹梅等，2007)，降低电解渗解率和MDA含量(梁颖等，2001)，稳定细胞膜电位(安国勇等，2002)，缓解线粒体各项功能的伤害，以实现对逆境胁迫下植物细胞膜结构的保护(张召等，2012)。本试验中也发现干旱胁迫下毛竹叶片会诱导SOD，POD，CAT等保护酶活性，而且随干旱持续SOD，CAT活性都呈现上升趋势，POD则先上升后下降;添加外源Ca²⁺能显著提高POD，POD，CAT保护酶活性，降低电导率和MDA含量，而添加Ca²⁺信号抑制剂则使毛竹叶片的POD，SOD和CAT酶活性显著下降(仅EGTA对POD活性影响较小)，电导率和MDA含量显著上升。说明毛竹抗旱性的形成受到Ca²⁺信号调控，而调节抗氧化保护酶活性是重要途径之一。因此，毛竹栽培生产面临季节性干旱时，可以适量使用外源钙肥，以缓解干旱胁迫的症状并提高毛竹生产力。