糖分的积累是果实品质形成的关键，蔗糖不仅为植物的生长发育提供物质和能量，也可作为一种信号物质调节碳水化合物代谢和控制同化物分配，进而影响植物的生长发育(谢虹，2003; 陈俊伟等，2002)。许多学者从蔗糖代谢相关酶的活性变化来探讨果实糖积累的机制，也通过试验证明蔗糖能改善果实品质，对酶活性具有调节作用(王永章等，2001; 齐红岩等，2005; 龚荣高等，2004; 李月芳，2007; 唐瑭，2009; 苑智华等，2008)。

Ca²⁺在植物体中发挥着重要作用，可调控植物体内的多种生理生化过程。研究Ca²⁺是否在某一生理过程中起作用，除了研究外界刺激是否引起胞内Ca²⁺浓度发生变化外，还需结合Ca²⁺螯合剂(FGTA)等处理，研究是否受抑制、延缓或促进了其相应的生理反应。在目前国内的研究中，喷钙能提高果实中各营养元素的含量(车玉红，2005)，可提高香蕉(Musa paradisiaca)的果实品质(杨苞梅等，2010)，提高桃(Prunus persica)、番茄(Lycopersicon esculentum)果实可溶性糖含量(关志华等，2009; 李明泽等，2009; 田世恩等，2011; 王萌等，2009)。

淀粉是板栗(Castanea mollissima)种仁主要的贮藏物质，板栗果实发育与碳水化合物代谢密切相关，蔗糖合成与淀粉积累直接关系到栗仁的发育进程和品质(陈在新等，2005; 2011; 王凤才等，1991)。在板栗果实发育时期，系统地研究外源蔗糖和钙对板栗生长发育过程中蔗糖及淀粉合成的作用及相关酶活性的研究尚未见报道。本试验以板栗“燕山早丰”为试材，研究喷施蔗糖、EGTA和氯化钙对板栗果实生长发育中糖和淀粉的积累及相关酶活性的影响，深入研究板栗果实生长发育中糖积累、淀粉合成及相关酶活性的调控技术，有助于深入了解外源物质对板栗栗仁营养物质积累规律和生理代谢机制的影响，对板栗的产量和品质调控具有重要的理论意义和应用价值。

试验地位于河北省迁西县西荒裕村，年均气温10.9 ℃，最冷月平均气温-6.5 ℃，最热月平均气温25.4 ℃。年平均降水量744.7 mm，其中5—10月降水量占全年降水量的88%。年平均相对湿度59%，年平均无霜期176天，全年日照2 581.5 h。

供试材料为6年生板栗“燕山早丰”嫁接苗，砧木2年，株行距为2 m×3 m。选取树势一致无病虫害、结果正常的树体进行试验。调控喷施时期为幼果期(花后20天)，设0.3%氯化钙、5 mmol·L^-1 EGTA，4%蔗糖共3个处理，以喷清水为对照(CK);每隔7天喷1次，共喷3次;3株为1小区，3次重复。

1) 果实生长发育规律研究   (1)刺苞横纵径测定以雌花柱头反卷为花后0天，每个处理均选取长势、大小均匀一致的10个刺苞进行挂牌标记，并依照当地板栗的胚胎发育过程，从板栗花后10天开始，每隔10天进行1次测量，直到果实成熟。

(2)刺苞质量测定   随机选取各处理植株中的10个刺苞，用游标卡尺测量板栗刺苞横纵径，记录并取平均值，计算其果形指数(横径/纵径)，用1/1 000天平测定鲜苞质量，计算刺苞的平均相对生长速率(RGR): RGR=1/w×dw/dt。式中，w为原有物质的质量，dw/dt为瞬间增量。每10天测定1次鲜苞质量，所取的果实在各处理植株上另采。

2) 可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量测定方法   分别于花后30，40天每次采集20个刺苞样品，50，60，70，80，90天每次采集10个刺苞样品，用于可溶性总糖、蔗糖和淀粉含量，蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、ADPG焦磷酸化酶(AGPPase)、水溶性淀粉合成酶(SSS)、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)活性测定，样品采后立即放入冰盒带回，于-80 ℃低温保存。

蔗糖含量采用间苯二酚比色法测定(韩振海，2006)，可溶性总糖和淀粉含量采用蒽酮比色法测定(张志良，2001)。

3) 相关酶及其活性测定方法   在研究果实生长发育规律的同时，采集样品用于蔗糖合成酶(SS)、蔗糖磷酸合成酶(SPS)、ADPG焦磷酸化酶(AGPPase)、水溶性淀粉合成酶(SSS)、颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS)活性测定。酶液提取参照Douglas等(1988)和Tsai-Mei等(1985)的方法，SS活性测定参照Douglas等(1988)的方法。SPS活性测定方法与SS相同，用F-6-P代替果糖。AGPP酶活性的测定参照Nakamura等(1989)的方法。SSS、GBSS活性测定参照孙哲(2010)的方法进行。

试验中的UDPG，F-6-P，PGM和G-1-P等生化试剂均购自美国Sigma公司。试验中可溶性糖等指标及相关酶活性的测定值30～40天为板栗板栗果实的含量，50～90天的测定值均为栗仁的含量。试验数据采用Origin 8.5和SPSS 18.0数据处理系统进行统计分析，通过Duncan’s多重比较进行差异显著性分析。

由图 1可知: 在整个果实发育过程中，各处理和对照组刺苞的横径、纵径均呈逐渐增加的趋势，与对照组差异不明显，但平均单苞质量产生了较大差异。花后90天时蔗糖处理的板栗刺苞平均单苞质量较对照组提高了5.15%; EGTA处理使板栗平均单苞质量降低了42.20%。氯化钙对栗仁发育影响不显著。另外，蔗糖处理组栗仁出现期为花后50天，对照组种仁于花后60天出现，这表明蔗糖对栗仁发育起了很重要的作用。蔗糖处理可以促进栗仁的形成，可增加刺苞质量;喷施0.3%氯化钙对果实发育并没有促进作用，喷施5 mmol L^-1 EGTA对果实发育尤其对种仁的形成及发育不利。

	图 1 板栗果实生长曲线 Fig. 1 The effects of different treatments in development course of Chinses chestnut

由图 2A可见: 花后50天只有蔗糖处理组板栗出现栗仁，蔗糖含量为0.090 8 mg·g^-1。由于子房在花后30天左右才开始膨大，子房未膨大之前非常细小，同柱头大小基本相同，需要的取样量太大，与刺苞也不好分离，因此补充了从花后30天开始的数据。花后30～50天左右板栗果实开始膨大，但未出现栗仁，在栗仁出现后，板栗果皮开始逐渐变硬，成熟时形成褐色硬壳，不便于进行测量，因此文中可溶性糖等指标及相关酶活性的测定值30～40天为板栗果实的含量，50～90天的测定值均为栗仁的含量。不同处理板栗果实的蔗糖含量均呈现下降趋势。在整个果实发育期间，经蔗糖处理的板栗果实的蔗糖含量基本上均高于对照及其他处理，经EGTA处理的板栗果实的蔗糖含量明显均低于对照及其他处理。花后90天蔗糖含量从高到低的顺序为蔗糖处理组＞氯化钙处理组＞CK＞EGTA处理组，蔗糖处理比CK增加21.34%，氯化钙处理比CK增加12.77%，EGTA处理比CK降低37.79%，EGTA会降低板栗果实的蔗糖含量，影响板栗果实发育。

	图 2 不同处理对板栗果实发育中蔗糖、可溶性总糖、可溶性淀粉含量的影响 Fig. 2 The effects of different treatments on the sucrose，soluble sugar, soluble starch content in development course of Chinese chestnut 小写和大写字母分别表示在5%和1%的水平上Duncan新复极差检测结果。 Small and capital letters indicate the results of Duncan’s test at 5% and 1% level, respectively.

由图 2B 可见: 不同处理板栗果实的可溶性总糖含量均呈现上升趋势，但不同处理的可溶性总糖含量在不同时期略有差异。在整个果实发育过程中经蔗糖处理后的板栗果实的可溶性总糖含量均显著高于对照，而EGTA处理后的可溶性总糖含量明显低于对照组，氯化钙处理与对照差异不显著。花后90天可溶性总糖含量从高到低的顺序为蔗糖处理组＞氯化钙处理组＞CK＞EGTA处理组。蔗糖处理比CK增加5.45%，氯化钙处理比CK增加了3.60%，EGTA处理比CK降低了36.00%。

由图 2C可见: 经蔗糖处理的板栗较其他组种仁出现时期早，于花后50天开始出现种仁，其他组则未出现种仁。蔗糖处理组花后60天的淀粉含量显著高于其他组。EGTA处理组淀粉含量一直处于较低的水平。对照与氯化钙处理的淀粉含量在整个果实发育期差异不显著。最终淀粉含量从高到低的顺序为蔗糖处理组＞氯化钙处理组＞CK＞EGTA处理组。蔗糖处理比CK增加3.45%，氯化钙处理比CK增加0.18%，EGTA处理比CK降低74.31%。Duncan’s多重比较分析表明，蔗糖处理在板栗收获时淀粉含量高于其他各处理的含量。

SS影响果实中糖分的积累，可能与蔗糖的含量有关，在果实发育期间，SS对糖代谢有重要的调控作用。SPS在糖积累和形成过程中具有非常重要的作用，决定并影响着果实的品质(于年文等，2011)。由图 3可知: 蔗糖处理组板栗果实发育过程中SS和SPS活性较其他组存在极显著差异，EGTA处理使SS和SPS酶活性明显低于对照，表明蔗糖对SS和SPS酶活性有一定的影响。在果实生长发育期内，随着果实生长发育的进程，淀粉大量积累，SS和SPS酶活性逐渐下降。花后60天时蔗糖处理的酶活性与同时期对照酶活性的差异最小; EGTA对SS和SPS活性有抑制作用。

	图 3 不同处理对板栗果实发育中SS，SPS酶活性的影响 Fig. 3 The effects of different treatments on the SS，SPS activity in development course of Chinese chestnut

AGPP在水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)等高淀粉植物中催化淀粉的合成，是植物淀粉合成过程中的关键酶(吴世文等，2010)。由图 4可知: 蔗糖处理组AGPP活性在花后70天最高，为2.64 μmol ADPG·g^-1FW min^-1。蔗糖处理组AGPP活性在果实发育的前期均高于对照，后期均低于对照，与对照差异显著。在整个果实发育期EGTA处理组板栗的AGPP活性与其他组均差异显著，酶活性一直处于较低水平，无较大起伏。由此可见: 蔗糖在板栗果实发育前期对AGPP活性的影响较大，后期影响逐渐减小;EGTA对AGPP在果实的整个发育期均有抑制作用。

	图 4 不同处理对板栗果实发育中AGPP，SSS，GBSS酶活性的影响 Fig. 4 The effects of different treatments on the AGPP, SSS, GBSS activity in development course of Chinese chestnut

SSS是催化淀粉合成的一个重要酶，催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应，使淀粉链延长(Denyer，1995)，GBSS活性的高低直接影响淀粉的合成。蔗糖处理组SSS和GBSS活性在花后70天达到最大，使SSS酶活性较对照提高12.03%，GBSS提高6.58%，此时正是栗仁淀粉大量合成的关键时期，蔗糖增强了SSS和GBSS活性，因此促进淀粉的合成与积累。在整个果实发育期，EGTA处理组酶活性一直处于较低水平，明显低于对照，氯化钙处理组与对照差异不显著。结果表明: 蔗糖对AGPP，SSS和GBSS活性有调节作用，促进淀粉的合成与积累，对提高板栗产量和品质起着重要的作用; EGTA抑制了AGPP，SSS和GBSS活性，影响板栗的正常生理活动，对板栗淀粉合成不利。

本试验研究了喷施0.3%氯化钙，5 mmol·L^-1EGTA和4%蔗糖3种外源物质对板栗果实发育状况的影响。结果表明: 喷施蔗糖、氯化钙和EGTA对板栗横纵径均影响不大，且处理组之间差异不明显。但果实质量蔗糖处理较氯化钙和EGTA处理差异显著，且蔗糖处理组可加快栗仁形成，栗仁于花后50天出现，较其他处理早1周左右。EGTA处理组板栗质量从花后60天开始直至采收明显低于对照。

蔗糖对板栗重量影响较大，可能由于此时板栗处于幼果期喷施蔗糖保证了养分的充足供应，为栗仁的形成奠定了良好的基础，提高了碳水化合物含量，促进了碳水化合物的相互转化，增加淀粉的积累，使养分更多地向果实运输。

EGTA处理使栗仁形成受阻，形成空苞，这与很多学者在其他果树中的研究结果相似。充足的钙可提高光合强度，促进碳水化合物和蛋白质的合成，果实中低Ca²⁺含量会促进果肉瓦解(段学武等，2001)。EGTA能够通过螯合作用降低Ca²⁺浓度，减少果实中的钙含量，从而阻碍了Ca²⁺作用的发挥，使细胞的生理活动受阻。EGTA预处理降低了甘蔗(Saccharum sinensis)、甜瓜(Cucumis melo var. raticulalus)幼苗的相对生长量(高洪波等，2005; 翁笑艳等，2007)。果实中80%以上的钙都是在盛花后20天内吸收进入果实(Bernadac et al.，1996)，在板栗果实发育过程中钙离子可能与板栗授粉受精和种仁的形成有关，至于钙离子如何参与栗仁的形成需进一步研究。

叶面喷施蔗糖可显著提高青花菜(Brassica oleracea var. italica)叶片可溶性糖、蔗糖、淀粉等含碳化合物的含量(李月芳等，2007)，外源糖溶液可增加白桦(Betula platyphylla)叶片的可溶性糖和蛋白质含量(周玉梅等，2003)，EGTA 降低了辣椒(Capsicum annuum)幼苗叶片中可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸含量(张化生等，2007)。本研究中，外源蔗糖处理使板栗果实中的蔗糖、可溶性总糖、可溶性淀粉含量比对照分别提高，这可能是由于在栗仁形成的关键时期需要大量的糖来供给能量同时合成淀粉。当板栗进入种仁形成前期，各种生命代谢活动旺盛，碳水化合物相互转化速度加快，许多生理活性需要钙离子的参与，缺钙会影响板栗的正常生理活动，从而影响板栗淀粉的合成。

SS和SPS是蔗糖合成调节中的关键酶(Champigny，1995; Stitt，1989; Worrell et al.，1991)。在细胞发育过程中SS 能提供UDPG 构建细胞壁或者合成胼胝质，SS活性最高时，叶片合成的同化产物输入到库器官的速率最大(齐红岩等，2006)。在苹果(Malus pumila)中SS和SPS的活性受到蔗糖的调控，蔗糖抑制这2种酶活性(单守明，2004)。但蔗糖对水稻籽粒灌浆及蔗糖合成酶活性具有调节作用(谢虹，2003)，蔗糖处理显著提高了水稻籽粒中SS活性，而且SS活性随着蔗糖浓度增加而增加(唐瑭，2009)。在本研究中，蔗糖处理可提高板栗果实SS和SPS的活性，促使蔗糖含量增加，总糖含量也相应提高，差异达到显著水平。EGTA处理降低了SS和SPS活性，使蔗糖含量减少，影响了栗仁的形成，使板栗出现空苞现象，影响板栗产量。板栗果实生长的前期SS和SPS可能是蔗糖大量积累的前提，后期淀粉开始积累，此时SS，SPS活性也表现出降低的趋势，这可能为淀粉的积累提供了条件。

本试验蔗糖处理提高AGPP，SSS，GBSS活性，EGTA处理使AGPP，SSS，GBSS活性显著降低，氯化钙处理与对照无显著差异。表明外源喷施蔗糖处理可通过增强各种酶活性，提高板栗淀粉含量，可使酶活性提前进入活跃期，酶活性的增强，延长板栗淀粉合成时间。

综上所述，不同处理下板栗果实发育过程蔗糖、可溶性总糖、可溶性淀粉含量及相关酶活性变化的研究，证实了碳水化合物的变化在植物果实发育过程中的重要作用。至于Ca²⁺作为第二信使究竟如何参与果实发育，及其与其他信号因子(如蔗糖)之间的关系，还应进一步深入探讨。在明确它们对板栗淀粉积累影响的基础上，通过进一步探索蔗糖如何调节有关酶活性以提高板栗产量，改善板栗品质，对于板栗优质栽培具有重要的理论和指导意义。