致病疫霉(Phytophthora infestans)隶属藻物界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫霉属(Phytophthora)(林晓民等，2007)，主要侵染马铃薯(Solanum tuberosum)、番茄(S. lycopersicum)等50 多种茄科植物(娜仁等，2008)。由致病疫霉引起的马铃薯晚疫病，是所有引起粮食作物产量损失病害中最严重的一种真菌病害(杨艳丽等，2001)。哈茨木霉(Trichodermaharzianum)是一种优良的生防菌，具有广谱性、广泛适应性并对多种病原真菌具有抑制作用(杨艳丽等，2001; 杨春林，2009; Zimand et al., 1996; 陈方新等，2005)。

国内外有关致病疫霉菌生物防治和哈茨木霉防治真菌性病害的研究已有很多，Fakhouri 等从荧光假单胞菌(P. fluorescens)菌株G308 中分离的抗生素N-mercapto-4-formylcarbostyril，能够抑制致病疫霉的菌丝生长和孢子萌发(杨怀文等，2000)，从心黎等(2005)研究发现YX 拟青霉菌发酵液浓缩物能够抑制马铃薯晚疫病菌的菌丝生长和游动孢子释放，Siddiqui 等(2004)研究发现哈茨木霉有助于荧光假单胞菌产生2，4-二乙酰基间苯三酚抑制番茄爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica)。Cllet 等(1981)研究发现哈茨木霉能够产生β-1，3 葡聚糖酶和几丁质酶并引起寄主菌丝体的解体。目前国内外对于利用哈茨木霉发酵液提取物防治致病疫霉菌的研究较少，特别是利用哈茨木霉提取物对致病疫霉菌体内酶活性影响的研究还未见报道; 因此，本课题组在前期研究的基础上，采用哈茨木霉T28 发酵液不同浓度的乙酸乙酯提取物对致病疫霉菌丝体生长、孢子囊萌发和孢子囊释放游动孢子进行抑菌试验，并对致病疫霉菌体内生理代谢酶活性进行测定，从而确定提取物抑制致病疫霉菌的最佳浓度，并从提取物影响致病疫霉菌体生理代谢酶的角度，初步探讨其抑菌机制，为致病疫霉的生物防治奠定理论基础。

哈茨木霉菌株T28 于2009 年从以色列引进，致病疫霉菌株于2009 年在哈尔滨市黑龙江省农垦科学院经济作物研究所马铃薯试验地中受病害感染的马铃薯植株上分离，2 个菌株均保存于东北林业大学。

哈茨木霉菌株T28 发酵液乙酸乙酯提取物制备(以下简称提取物): 用加富PD 培养基(马铃薯200g，葡萄糖20 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄ 1.5 g，水1 000 mL)于25 ℃、120 r·min^-1 液体发酵7 天，将发酵液过滤除去菌体后，按发酵液∶乙醇= 1∶3(V /V)比例浸提3 次后合并，50 ℃ 水浴、搅拌，使之溶解。溶解后按溶液: 石油醚(亲脂性部分、沸点为60 ℃)= 1∶3(V /V)比例浸提3 次后合并，用分液漏斗分离水层和脂层。水层进行下一步萃取，溶剂分别为乙醚(弱极性部分)、乙酸乙酯(中等极性部分)。乙酸乙酯萃取部分经旋转蒸发至粉末状，用5 mL 吐温-80 溶解。

致病疫霉菌株采用加富PD 培养基液体发酵，方法同上。获得菌体用无菌水洗净，置于上述提取物的稀释液中，分别处理3，6，9，12，24，48 h，制备菌体组织液。测定SOD、CAT、POD、GSH-Px、HK、PK、LDH、SDH、MDH、ATP活性，MDA 含量。以10% 吐温-80 水溶液处理菌丝体作为对照。

将各提取物溶液分别均匀涂抹在番茄燕麦平板培养基(200 mL 番茄汁，20 g 琼脂，20 g 蔗糖，50 g 燕麦，4 g碳酸钙)表面，在平板中心接入直径为6 mm 致病疫霉菌片，以不涂抹提取物的作为对照。置于20℃生化培养箱中黑暗条件下恒温培养。采用十字交叉法(王树桐，2004)，每隔12 h 测量菌落横纵直径，每个处理重复3 次。计算抑制率，计算抑菌率的公式如下:

抵制率(%)=${对照菌落直径-处理菌落直径 \over 对照菌落直径}$× 100。

采用凹载玻片孢子萌发法(Pappas et al., 1979)。取在番茄燕麦培养基上培养10 天的致病疫霉菌，用毛刷将孢子囊刷至装有5 mL 无菌水的平板中，得到孢子囊悬浮液，将浓度调制在10 × 10 倍显微镜视野下50 个左右孢子囊。将孢子囊悬浮液与提取物(对照加入等体积的吐温-80)按体积比1∶1混合，将凹载玻片放入盛有湿润滤纸的无菌培养皿内，4 ℃ 黑暗培养3 h，每个处理重复3 次，每个重复检查5 个视野，在显微镜下观察孢子囊数及孢子囊芽管萌发状况，芽管生长长于孢子囊直径视为孢子萌发(从心黎等，2005)。计算孢子囊萌发的平均百分率和各提取物对孢子囊萌发的抑制率，相关公式如下:

孢子囊萌发率(%)=${孢子囊萌发数 \over 总孢子囊数}$× 100，

相对抑制率(%)=${对照孢子囊萌发率-处理孢子囊萌发率 \over 对照孢子囊萌发率}$× 100。

方法同上。在显微镜下观察孢子囊总数和空孢子囊数，计算孢子囊释放游动孢子的平均百分率和提取物对游动孢子释放的抑制率。

孢子囊释放率(%)=${空孢子囊数 \over 总孢子囊数}$× 100，

相对抑制率(%)=${对照孢子释放率-处理孢子囊释放率 \over 对照孢子释放率}$× 100。

酶液制备: 分别称取不同时间处理的菌体1 g，按质量体积比加入50 mmoL 冷磷酸缓冲液(缓冲液pH 值分别是，SOD 酶液加入pH7.8，CAT、POD 酶液加入pH7.0，HK、PK、LDH 酶液加入pH7.6，其他酶液加入pH7.4)10 mL，液氮研磨，4 ℃、10 000 r·min^-1(ATP为1 000 r·min^-1，冷冻离心5 min)冷冻离心20 min，上清液即为酶液(张芹，2003)。各种酶活性、MDA 含量测定均采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒，按说明书进行测定。

采用SPSS 软件进行数据处理和分析。

不同浓度提取物对致病疫霉菌丝生长、孢子囊萌发、游动孢子释放均有抑制作用(表 1)，5 mL 浓缩液、10 倍稀释液、100 倍稀释液的提取物对致病疫霉菌具有较好的抑制效果; 而当稀释倍数达到或超过500 倍时，提取物对致病疫霉菌的各项抑制率均有明显的降低，抑制效果较差。

表1 不同浓度的提取物对致病疫霉的抑菌性^① Tab. 1 Inhibiting activity of different concentration extracts on P. infestans

表 1 不同浓度的提取物对致病疫霉的抑菌性① Tab.1Inhibiting activity of different concentration extracts on P. infestans 浓度Density 菌丝生长抑制率Iinhibiting rate of mycelial growth 孢子囊萌发相对抑制率Relative inhibiting rate of sporangium germination 游动孢子释放相对抑制率Relative inhibiting rate of spore released zoospores 浓缩液Concentrate 68.78a 71.19a 76.25a 10×稀释液10×Diluent 68.22a 71.83a 72.98ab 100×稀释液100×Diluent 67.89a 70.94a 70.13b 500×稀释液500×Diluent 26.56b 11.82b 10.91c 1 000×稀释液1 000×Diluent 6.41c 3.78c 3.62d ① 不同字母表示差异显著(P＜ 0.05) 。Different letters in the same column mean significant difference at 0.05 level.

提取物对致病疫霉菌体保护酶活性有显著的影响(表 2)。致病疫霉菌体被提取物处理后，其SOD、CAT、POD 活性均从3 h 开始升高，12 h 达到最大值，此时分别为对照组的2.78 倍、0.88 倍和2.2倍。12 h 之后SOD、CAT、POD 活性开始下降，48 h降到最小值，此时分别为对照组的10.97%、13.05%和2.54%。

表2 提取物处理时间对致病疫霉SOD、CAT和POD 活性的影响 Tab. 2 Effects of the extraction treating time on the activity of SOD、CAT and POD of P. infestans

表 2提取物处理时间对致病疫霉SOD、CAT和POD 活性的影响 Tab.2ffects of the extraction treating time on the activity of SOD、CAT and POD of P. infestans mean ± SD 处理时间Processing time / h SOD 活性Activity of SOD /(U·g-1 min-1) CAT 活性Activity of CAT /(U·g-1 s-1) POD 活性 Activity of POD /(U·g-1 s-1) 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 3 16.721 ± 0.215 a 9.425 ± 0.336 c* 0.029 ± 0.002 a 0.029 ± 0.002 b 1.591 ± 0.121 a 1.608 ± 0.126 c 6 17.634 ± 0.231 b 23.576 ± 0.201 d * 0.037 ± 0.002 b 0.039 ± 0.002 c 1.609 ± 0.135 a 1.849 ± 0.138 d * 9 18.790 ± 0.264 c 33.762 ± 0.369 e* 0.044 ± 0.003 c 0.045 ± 0.003 d 1.859 ± 0.179 b 2.504 ± 0.194 e* 12 19.874 ± 0.282 d 55.159 ± 0.548 f* 0.060 ± 0.004 d 0.053 ± 0.004 e* 2.220 ± 0.186 c 4.881 ± 0.199 f* 24 21.790 ± 0.288 e 8.799 ± 0.173 b * 0.066 ± 0.003 de 0.036 ± 0.005 bc* 3.980 ± 0.197 d 1.598 ± 0.101 b * 48 22.761 ± 0.271 f 2.495 ± 0.025 a* 0.069 ± 0.003 e 0.009 ± 0.001 a* 5.721 ± 0.233 e 0.145 ± 0.037 a* ① * : 组之间的差异显著性(P＜ 0.05) Significant difference among groups(P＜ 0.05).不同字母表示组内差异显著(P＜ 0.05) Different letters mean significant difference within group at 0.05 level. 下同 The same below.

提取物对致病疫霉菌体GSH-Px 酶活性及MDA含量的影响显著(表 3)。经提取物处理后，致病疫霉菌体GSH-Px 活性低于对照组，从3 h 开始上升，6h 达到最大值; 之后开始下降，9 ～ 12 h 之间下降速度最快，12 h 之后下降速度变缓，48 h 时降至最低，此时是对照组的2.37%。处理组不同时间的GSHPx活性存在显著性差异。对照组GSH-Px 活性随时间的增长而提高。

表3 提取物不同时间处理对致病疫霉GSH-PX 活性和MDA 含量的影响 Tab. 3 Effects of extract at different processing time on the content of GSH-PX and MDA of P. infestans

表 3提取物不同时间处理对致病疫霉GSH-PX 活性和MDA 含量的影响 Tab.3Effects of extract at different processing time on the content of GSH-PX and MDA of P. infestans mean ± SD 处理时间 Processing time / h GSH-PX 活性 Activity of GSH-PX /(kU·g-1 DW MDA 含量 Content of MDA /(nmol·g-1) 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 3 1.447 9 ± 0.111 5 a 1.234 8 ± 0.103 7 d * 0.747 ± 0.068 a 0.975 ± 0.082 a* 6 1.765 4 ± 0.135 6 b 1.563 3 ± 0.125 8 e* 0.759 ± 0.069 a 1.075 ± 0.091 b * 9 2.255 3 ± 0.182 6 c 1.515 3 ± 0.123 9 e* 0.775 ± 0.068 b 1.463 ± 0.127 c* 12 2.401 3 ± 0.195 7 d 0.736 9 ± 0.075 9 c* 0.799 ± 0.073 c 2.099 ± 0.156 d * 24 2.646 5 ± 0.199 2 e 0.586 2 ± 0.060 3 b * 0.822 ± 0.077 d 2.098 ± 0.148 d * 48 3.109 3 ± 0.232 1 f 0.073 7 ± 0.005 8 a* 0.830 ± 0.080 e 2.127 ± 0.174 d *

提取物处理过的菌体其MDA 含量出现先快速增高，后趋于平稳的趋势，48 h 达到最高值，此时是对照组的2.56 倍。12，24和48 h 的MDA 含量之间无显著性差异。

提取物对致病疫霉菌体内参与糖代谢酶的含量有显著影响(表 4)。经提取物处理后，菌体HK、PK和LDH 酶活性从3 h 开始下降，48 h 降到最低值，此时分别是对照组的7.01%、1.05%和11.51%。对照组HK、PK和LDH 酶活性从3 h 开始呈缓慢上升趋势，48 h 升高到最高值。处理组和对照组之间存在显著性差异。

表4 提取物处理时间对致病疫霉HK、PK和LDH 活性的影响 Tab. 4 Effects of the extraction treating time on the activity of HK、PK and LDH of P. infestans

表 4提取物处理时间对致病疫霉HK、PK和LDH 活性的影响 Tab.4Effects of the extraction treating time on the activity of HK、PK and LDH of P. infestans mean ± SD 处理时间 Processing time / h HK 活性 Activity of HK /(U·g-1 min-1) PK 活性Activity of PK /(U·g-1 min-1) LDH 活性Activity of LDH /(U·g-1 min-1) 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 3 0.109 1 ± 0.021 2 a 0.092 1 ± 0.018 7 a* 0.027 0 ± 0.003 0 a 0.022 5 ± 0.003 2 a* 0.861 7 ± 0.085 3 a 0.861 0 ± 0.085 7 a 6 0.110 6 ± 0.028 5 b 0.077 3 ± 0.015 5 b * 0.028 2 ± 0.003 0 b 0.019 9 ± 0.002 1 b * 0.874 6 ± 0.088 1 b 0.756 2 ± 0.077 5 b * 9 0.112 5 ± 0.034 9 c 0.061 4 ± 0.013 5 c* 0.029 8 ± 0.004 3 c 0.010 0 ± 0.000 9 c* 0.892 4 ± 0.091 8 c 0.672 1 ± 0.071 3 c* 12 0.115 6 ± 0.045 6 d 0.038 3 ± 0.011 1 d * 0.032 1 ± 0.005 5 d 0.005 7 ± 0.000 6 d * 0.914 4 ± 0.093 4 d 0.350 6 ± 0.036 6 d * 24 0.119 4 ± 0.059 5 e 0.011 0 ± 0.008 4 e* 0.033 0 ± 0.007 5 e 0.004 5 ± 0.000 5 e* 0.930 7 ± 0.095 3 e 0.160 0 ± 0.014 7 e* 48 0.119 9 ± 0.057 2 e 0.008 4 ± 0.005 1 f* 0.038 3 ± 0.009 4 f 0.004 0 ± 0.000 5 e* 0.931 6 ± 0.095 5 e 0.107 2 ± 0.009 0 f*

提取物对致病疫霉菌体内参与TCA 代谢酶含量的影响显著(表 5)。经提取物处理后，菌体MDH和SDH 酶活性从3 h 开始下降，3 ～ 12 h 下降速度较快，之后缓慢下降，48 h 降到最低值，此时分别为对照组的2.58%和2.35%。对照组MDH和SDH酶活性从3 h 开始上升直至48 h 达到最大值。处理组与对照组之间存在显著性差异。

表5 提取物处理时间对致病疫霉MDH和SDH 活性的影响 Tab. 5 Effects of the extraction treating time on the activity of MDH and SDH of P. infestans

表 5提取物处理时间对致病疫霉MDH和SDH 活性的影响 Tab.5Effects of the extraction treating time on the activity of MDH and SDH of P. infestans 处理时间 Processing time / h MDH 活性 Activity of MDH /(U·g-1 min-1) SDH 活性 Activity of SDH /(U·g-1 min-1) 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 3 9.485 3 ± 0.177 2 a 9.513 0 ± 0.183 1 a 11.201 7 ± 0.183 6 a 11.347 8 ± 0.186 5 a 6 11.761 5 ± 0.194 1 b 7.472 2 ± 0.145 5 b * 14.752 2 ± 0.234 8 b 9.321 4 ± 0.141 6 b * 9 17.211 2 ± 0.273 5 c 5.753 2 ± 0.126 3 c* 18.477 9 ± 0.286 4 c 6.214 3 ± 0.143 2 c* 12 23.065 2 ± 0.347 5 d 2.496 1 ± 0.067 9 d * 21.354 5 ± 0.311 1 d 3.070 6 ± 0.095 4 d * 24 29.384 7 ± 0.385 8 e 1.683 9 ± 0.023 2 e* 25.732 4 ± 0.363 5 e 1.553 6 ± 0.068 2 e* 48 33.443 1 ± 0.363 4 f 0.861 4 ± 0.068 0 f* 27.084 9 ± 0.377 2 f 0.635 8 ± 0.029 9 f*

提取物对致病疫霉菌体内参与能量代谢酶活性有显著影响，处理组ATP酶活性总体低于对照组表 6)。经提取物处理的菌体，其ATP酶活性从3h 开始上升，9h 时达到最大值，之后快速下降，48 h降到最小值，此时分别是对照组的15.03%和1.34%。对照组ATP酶活性呈缓慢上升趋势，48 h达到最大值。处理组与对照组之间存在显著性差异。

表6 提取物处理时间对致病疫霉ATP活性的影响 Tab. 6 Effects of the extraction treating time on the ATPactivity of P. infestans

表 6提取物处理时间对致病疫霉ATP活性的影响 Tab.6Effects of the extraction treating time on the ATPactivity of P. infestans mean ± SD 处理时间Processing time / h K + -Na + -ATP活性 Activity of K + -Na + -ATP/(μmolPi·g-1 h-1) Ca2 + -Mg2 + -ATP活性Activity of K + -Na + -ATP/(μmolPi·g-1 h-1) 对照组 CK 处理组 Treatment group 对照组 CK 处理组 Treatment group 3 0.536 7 ± 0.063 7 a 0.518 9 ± 0.061 6 d 0.582 5 ± 0.070 1 a 0.508 8 ± 0.051 7 d * 6 0.563 3 ± 0.066 5 a 0.562 2 ± 0.065 9 e 0.635 7 ± 0.069 5 b 0.580 8 ± 0.068 4 e* 9 0.635 7 ± 0.069 3 b 0.574 8 ± 0.067 3 e* 0.642 5 ± 0.069 7 b 0.620 2 ± 0.068 7 f* 12 0.692 2 ± 0.069 0 b 0.391 7 ± 0.037 5 c* 0.680 1 ± 0.071 5 c 0.345 7 ± 0.032 5 c* 24 0.801 6 ± 0.074 8 c 0.109 0 ± 0.010 1 b * 0.741 8 ± 0.075 7 d 0.164 7 ± 0.021 5 b * 48 0.831 8 ± 0.085 1 c 0.012 5 ± 0.001 3 a* 0.837 5 ± 0.056 2 e 0.011 2 ± 0.001 1 a*

通过哈茨木霉菌株T28 发酵液不同浓度的乙酸乙酯提取物对致病疫霉抑制作用以及经提取物处理后致病疫霉菌体生理代谢酶的变化研究，得出以下结论: 哈茨木霉菌株T28 发酵液乙酸乙酯提取物的100 倍稀释液对致病疫霉菌具有较好的抑制作用，并且能够降低致病疫霉菌体内多种酶(SOD、CAT、POD、GSH-Px、HK、PK、LDH、SDH、MDH、ATP)活性，提高提高菌体MDA 含量。

目前，致病疫霉菌的生物防治备受关注，很多学者利用植物提取物和微生物的次生代谢产物抑制致病疫霉并取得了较好的抑制效果。杨怀文等(2000)报道了嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdusnematophilus)的80 倍发酵液可完全抑制晚疫病菌生长，640 倍的发酵液还有明显抑制效果。李玉华(2003)报道了40 倍浓度的嗜线虫杆菌代谢物为防治马铃薯晚疫病的最佳浓度，其防病效果与58% 甲霜灵锰锌可湿性粉剂500 倍液相当。王树桐等(2006)报道了知母(Anemarrhena asphodeloides)提取物对马铃薯晚疫病菌丝生长的抑制浓度为525 倍，对游动孢子释放的抑制浓度为800 倍; 对孢子萌发的抑制浓度为950 倍。本研究中哈茨木霉T28 发酵液乙酸乙酯提取物的100 倍稀释液对致病疫霉菌丝生长的抑制率为67.89%，对孢子囊萌发的相对抑制率为70.94%，对孢子囊释放游动孢子的相对抑制率为70.13%。

植物体被破坏的重要原因是活性氧自由基对组织伤害的逐渐积累，导致膜脂过氧化，引起代谢紊乱。SOD、CAT、POD、GSH-Px(孔治有等，2010; 计红芳等，2007; 宋增延等，2008)被认为是植物体重要的酶保护系统，MDA 是膜质过氧化的主要产物，以上这些物质的含量变化情况可以衡量膜系统被破坏的程度(计红芳等，2007; 陶晶等，2005; 刘厚诚等，2003)。很多研究发现: 在胁迫条件下，细胞内自由基清除剂活性下降，SOD、CAT、POD 的活性提高，GSH-Px 活性下降，MDA 含量上升(宋增延等，2008; 计红芳等，2007; 陶晶等，2005; 刘厚诚等，2003)。试验中4 种酶活性均出现先上升后快速下降的趋势，MDA 含量呈现先上升后平稳的趋势; 此结果可能是由于提取物对致病疫霉菌体造成了胁迫，使得菌体细胞保护酶活性和MDA 含量上升，致使细胞膜过氧化程度加剧，导致细胞膜被破坏，细胞质外露，直至菌体细胞趋于凋亡。

己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)是糖酵解反应过程中的关键酶，其活性的变化对维持机体血糖水平具有重要作用(郭彪等，2008)。乳酸脱氢酶(LDH)是机体无氧代谢的标志酶，可催化丙酮酸和乳酸之间的相互转化，其活力大小在一定程度上反映了无氧代谢能力的高低(管越强等，2010)。有研究表明: 在胁迫条件，糖酵解代谢途径受到干扰，致使HK、PK、LDH 酶活性显著下降或受到抑制(计红芳等，2009)。试验中，经提取物处理的菌体体内参与糖酵解途径的3 种酶活性随处理时间的延长而下降，造成致病疫霉糖代谢发生障碍，不能进行正常生命活动; 可能是由于提取物对HK、PK 与LDH 产生了显著的抑制作用，严重破坏了菌体糖代谢的正常进行。

琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、三磷酸腺苷酶(ATP)与肌体的能量代谢有密切关系。SDH 是细胞能量代谢的重要酶(李丽萍等，2010)，MDH(王闯等，2009)与线粒体的能量代谢有关，ATP酶是生物膜上的蛋白酶，能将代谢能量载体ATP催化水解为ADP和磷酸基团并释放能量，它在物质运送、能量转化以及信息传递方面具有重要的作用(黄征征等，2011)。试验中经提取物处理的菌体体内上述3 种酶活性随时间的延长而下降，破坏了三羧酸循环和能量代谢的正常运行; 造成这一结果的原因可能是由于提取物对SDH、MDH、ATP产生了显著的抑制作用，导致细胞生理活动不能正常的进行。

综上，哈茨木霉菌株T28 发酵液乙酸乙酯提取物100 倍稀释液对致病疫霉的具有较好的抑制效果，并且使致病疫霉处于受胁迫的状态下，致使其菌体生理代谢酶活性快速下降，细胞毒性物质MDA不断积累，最终导致糖代谢、三羧酸循环、能量代谢等生理活动不能正常进行。这一系列变化保持一致，也充分的反映了生命体各组织、器官间的协调性和整体性。通过研究，初步揭示了哈茨木霉菌株T28 发酵液乙酸乙酯提取物抑制致病疫霉生长的作用和机制，但对以上结果的验证和其他机制的揭示还需进一步更深入的研究。