林业科学  2013, Vol. 49 Issue (3): 51-55   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130307
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文章信息

谭健晖
Tan Jianhui
马尾松优良种源苗木对人工低温胁迫的生理生化反应
Physiological and Biochemical Responses of Pinus massoniana Superior Provenance Seedlings under Artificial Low Temperature Stress
林业科学, 2013, 49(3): 51-55
Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(3): 51-55.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130307

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收稿日期:2012-04-03
修回日期:2012-07-15

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谭健晖

马尾松优良种源苗木对人工低温胁迫的生理生化反应
谭健晖    
广西壮族自治区林业科学研究院 南宁 530002
摘要:以不同抗寒能力的2个马尾松优良种源针叶为材料,测定其叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量、脯氨酸含量、内源保护酶系统以及膜脂反应产物等生化指标,分析各指标与抗寒能力的关系。结果表明:抗寒性强的种源具有较强的光合代谢能力,叶绿素含量随温度的下降呈现总体升高趋势;根据4和0℃时可溶性糖和游离脯氨酸含量的变化趋势可判断抗寒性大小,正值较强负值较弱;可溶性蛋白质含量变化幅度大则抗寒能力较差;SOD对0℃以上低温敏感,属冷害敏感型调节酶,0℃以上低温前达到的活性越高,持续的时间越长,抗寒性越强;POD对0℃以下低温敏感,属冻害型调节酶,0℃以下低温时活性升高越快,持续时间越长,抗寒性越强。SOD的启动时间早,POD启动晚。MDA含量越低,峰值出现的时间越晚其抗寒性越强。以上6个指标在低温逆境胁迫下相互协调,共同发生作用。
关键词马尾松    种源    抗寒性    保护酶    
Physiological and Biochemical Responses of Pinus massoniana Superior Provenance Seedlings under Artificial Low Temperature Stress
Tan Jianhui    
Guangxi Forestry Science Academy Nanning 530002
Abstract: The needles of two superior provenances, with different cold tolerance, of Pinus massoniana were used as the materials to measure photosynthetic metabolism, nitrogen metabolism, endogenous protective enzyme system and membrane lipid reaction, and to examine relationships between these physiological and biochemical indices and the cold resistance. Chlorophyll content generally increased with the decrease of temperature, indicating a highly cold-resistant P. massoniana trees associated with high capability of photosynthesis. The changing trend of soluble sugar and proline contents at 0℃ and 4℃ temperatures could be used to estimate the cold resistance of P. massoniana. Their positive and negative values respectively represented strong and poor cold-resistance. Soluble protein content was inversely correlated with the cold resistance, and the higher content associated with poorer cold-resistance. Superoxide dismutase (SOD) was a chilling-sensitive regulating enzyme and peroxidase (POD) was a freezing-sensitive regulating enzyme. Trees had stronger resistance to cold when their SOD as well as POD activities increased and could remain at high level for longer time under the stress of low temperature. Under the stress, the activity of SOD started earlier than that of POD. However, trees with a stronger cold-resistance had lower content of malondialdehyde (MDA) and their MDA peak level arrived later. The six indices measured in the current study interacted with each other under the stress of low temperature.
Key words: Pinus massoniana    provenance    cold resistance    protected enzyme    

马尾松(Pinus massoniana)是我国南方重要的工业用材及采脂树种,在我国林浆纸(板)一体化及木材深加工产业和松脂产业中发挥着重要作用。全国马尾松协作组从“六五”开始,先后开展了南方14个省(区)的马尾松全分布区内81 个马尾松地理种源试验,在全国多点多年度种源试验中评选出一批生长优良、干型通直且表现稳定的优良种源,其中广西桐棉和广西古蓬种源(以下分别简称桐棉种源和古蓬种源)名列前茅。这2 个种源生产潜力巨大,已在福建、江西、湖南、广东、贵州、重庆等地大规模地推广应用,为马尾松的遗传改良和良种推广应用做出了重要贡献(杨章旗,2003)。广西的优良种源和优良家系在引种区表现出了较大的生长优势和不同于当地种的生长特性,如桐棉种源每年抽梢2 ~3次,休眠期推迟等,深受引种地区的喜爱。然而,由于这2 个优良种源自然分布于北热带和南亚热带地区,低温成为其向北推广的首要限制因子。笔者课题组曾以2 个种源为材料,应用人工控温法,研究系列低温梯度下针叶的内源IAA,ABA,ZR和GA3等激素的动态变化规律,发现内源GA3含量、k 值和ZR /ABA值可以作为评价马尾松优良种源抗寒性的指标(杨章旗等,2009)。在此研究的基础上,本文继续深入研究人工低温胁迫下的生理代谢和保护酶的变化规律,为马尾松低温伤害和抗性机制研究提供参考,并为南方马尾松的遗传改良和推广应用提供科学依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验于2009年12月20日-2010年1月16日在广西壮族自治区林业科学研究院生理实验室的人工培养箱内进行。研究材料为古蓬种源和桐棉种源,2种源原产地的地理位置和气候因子参见文献(杨章旗等,2009),种子采自忻城县古蓬镇和宁明县桐棉乡,营养杯苗木培育在广西壮族自治区林业科学研究院试验苗圃内进行,营养土为黄心土,营养杯规格为8cm ×12cm,各种源分别选择苗龄1 年且生长较一致的苗木30 株,苗高50 ~55cm,地径0.8cm左右。

1.2 试验方法 1.2.1 低温处理方法

试验前将苗木浇足水,移至室内放置3 天,将不滴水的苗木用托盆置于人工培养箱内。光照设定为: 光照7:00-19:00,黑暗19:00-7:00,光照强度设定为5700lx。相对湿度为65% ~85%。室温为9 ~15℃,苗木放入人工培养箱前进行第1 次取样,将这次取样定为对照,文中以10℃表示。人工降温梯度为:(10±2)℃,(4±2)℃,(0±2)℃,(-5±2)℃,(-10±2)℃。温度降到设定温度后48h进行取样,采样后恒温24h,进行下一个降温处理。

1.2.2 测定项目及方法

丙酮-乙醇法测定叶绿素含量,考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白质含量,蒽酮法测定可溶性糖含量,愈创木酚法测定POD活性,氮蓝四唑比色法测定SOD活性,磺基水杨酸法测定游离脯氨酸含量。以上6 个指标的测定方法参照李合生(1999)。硫代巴比妥酸法测定丙二醛含量,测定方法参照赵世杰(1994)

上述生化指标测定重复3 次,对异常的数据进行剔除。

1.3 数据处理

分别对叶绿素含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、SOD活性、POD活性、Pro和MDA含量与不同温度间进行双因素方差分析(SPSS13.0 软件)。

2 结果与分析 2.1 不同种源的叶绿素含量在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶叶绿素含量的变化趋势相差较大(图 1),抗寒性较强的古蓬种源总体上呈“W”型变化趋势,而抗寒力较弱的桐棉种源随着温度的下降叶绿素含量不断下降。古蓬种源在0℃以上低温时叶绿素含量较低,在0℃时有一急剧上升过程并基本接近抗寒性较差的桐棉种源,之后缓慢上升,在-10℃时超过桐棉种源。10℃时桐棉种源叶绿素含量出现最高值,之后随着温度的下降含量不断下降; 而古蓬种源的最高值和最低值分别出现在-10和4℃。各处理的叶绿素含量差异达显著水平(表 1)。-10℃时,古蓬种源的叶绿素含量比10℃时增加了28.12%,桐棉种源则降低了36.45%。2 种源的叶绿素含量随着低温胁迫的加剧出现不同的变化,是否由于极限低温导致光合作用异常有待进一步研究。

图1 降温过程针叶叶绿素含量变化 Fig.1 Chlorophyll content in different provenance during decreasing of temerature

表1 不同种源降温过程中生化指标多重比较 Tab. 1 Post hot test of variance on leaf traits among different young plantation
2.2 不同种源的可溶性蛋白含量在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶可溶性蛋白质含量的变化趋势大体相似(图 2),大致呈“M”型变化趋势。抗寒性较强的古蓬种源变化虽有起伏但变化幅度较小,而抗寒力较弱的桐棉种源的变化幅度较大,在4℃时出现最高峰值。古蓬种源可溶性蛋白质含量的最高值和最低值分别出现在10和10℃,桐棉种源可溶性蛋白质含量的最高值出现在4和0℃。各处理的可溶性蛋白含量差异达显著水平(表 1)。-10℃时,2 种源的的可溶性蛋白含量均比10℃时降低,古蓬种源和桐棉种源分别下降78.39%和8.33%。

图2 降温过程中可溶性蛋白质含量 Fig.2 Protein content in different provenance during decreasing of temperature
2.3 不同种源的可溶性糖含量在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶可溶性糖含量的变化趋势不同(图 3),抗寒力较弱的桐棉种源呈现出升高-下降-升高-下降的双峰变化趋势,变化幅度较大,峰值分别出现在4和-5℃。而抗寒性较强的古蓬种源呈单峰变化趋势,峰值出现在4℃,可溶性糖含量在低温来临前直线上升后缓慢下降,极端低温时可溶性糖仍保持较高含量。各处理的可溶性糖含量差异达显著水平(表 1)。-10℃时,古蓬种源的可溶性糖的含量比10℃时增加38.47%,桐棉种源则降低了17.17%。

图3 降温过程中可溶性糖含量变化 Fig.3 Soluble sugar content in different provenance during decreasing of temperature
2.4 不同种源SOD活性在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶SOD活性的变化趋势相似(图 4),大致呈“M”字型变化趋势,峰值分别出现在4和-5℃,但古蓬种源的变化起伏较大,2个种源出现最高峰值的温度不同,古蓬种源出现在4℃,而桐棉种源出现在-5℃,极端低温下桐棉种源的SOD活性高于古蓬种源。各处理的SOD活性差异达显著水平(表 1)。-10℃时,古蓬种源的SOD活性比10℃时降低10.23%,桐棉种源则提高27.95%。

图4 降温过程中SOD 活性变化 Fig.4 SOD activity in different provenance during decreasing of temperature
2.5 不同种源的POD活性在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶POD活性的变化趋势大体相似,在4℃出现下降后活性不断上升,但桐棉种源-10℃时出现了下降(图 5),抗寒性较强的古蓬种源POD活性在降温过程中均低于抗寒力弱的桐棉种源,只在-10℃时略高于桐棉种源,并在-10℃出现最高值。不同种源POD活性的最低值均出现在4℃,最高值出现的温度不同,桐棉种源出现在-5℃,而古蓬种源出现在-10℃,古蓬种源在零下低温POD活性不断直线上升且没有下降的趋势。各处理的POD活性差异达显著水平(表 1)。-10℃时,古蓬种源的POD活性比10℃时提高273.75%,桐棉种源则降低11.68%。

图5 降温过程中POD 活性变化 Fig.5 POD activity in leaves of different provenance during decreasing of temperature
2.6 不同种源的Pro含量在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶Pro含量的变化趋势不同,桐棉种源的Pro含量呈现出上升-下降-上升变化趋势,古蓬种源呈不断上升的变化规律(图 6)。桐棉种源Pro含量在0℃时出现直线升高并达到最高峰值,而后出现下降,之后缓慢升高。古蓬种源的Pro含量除4℃外均高于桐棉种源。各处理的Pro含量差异达显著水平(表 1)。10℃时古蓬种源的Pro含量略高于桐棉种源,古蓬和桐棉2 种源的Pro含量最高值分别比10℃时提高140.95%和193.27%。

图6 降温过程中游离脯氨酸含量变化 Fig.6 Proline content in different provenance during decreasing of temperature
2.7 不同种源的MDA含量在降温过程中的变化

随着温度的降低,不同种源的针叶MDA含量的变化趋势不同,桐棉种源呈现出上升-下降-上升-下降的双峰变化趋势,古蓬种源呈现出下降-上升-下降的变化规律(图 7)。桐棉种源MDA含量在4℃出现直线上升含量升高至最高峰值,0℃含量下降之后再出现升高,并在-5℃时达到第2峰值; 古蓬种源MDA含量在4℃时降至最低值,之后不断升高,并在-5℃时达到最高峰值。各处理的MDA含量差异达显著水平(表 1)。在10℃时,桐棉种源MDA含量高于古蓬种源,古蓬和桐棉2 种源的MDA含量最高值分别比10℃时提高62.59%和103.36%。

图7 降温过程中的丙二醛含量变化 Fig.7 MDA content in different provenance during decreasing of temperature
3 结论与讨论

叶绿素在光合作用中直接参与光能的吸收及能量的转化,是顺利进行光合反应的前提。绝大部分叶绿素的生物合成需要酶的参与,温度影响酶的活性,进而影响叶绿素的合成(潘瑞炽等,1994)。研究表明: 逆境抑制叶绿素的形成,干旱胁迫导致叶绿素含量下降,抗性强的植物叶绿素含量减少的幅度较少(史吉平等,1995; 黄建昌,1994; 张成军,2003; 阎勇等,2007),另一些研究则认为干旱胁迫下叶绿素含量升高(王晶英等,2006; 任红旭等,2001; 华春等,2009)。本试验中,随着低温胁迫的加剧不同抗寒性种源的叶绿素含量变化趋势不同,其中抗性弱的桐棉种源叶绿素含量随温度的降低不断下降,抗性强的古蓬种源则随温度的下降不断升高。低温胁迫促进古蓬种源的光合潜力,即抗寒性强的马尾松具有较强的光合代谢能力,叶绿素含量随温度的下降呈现总体升高趋势。

低温对植物的直接伤害首先表现在对膜的伤害,可溶性物质的增加是植物抗寒反应之一。植物通过主动积累可溶性糖以及脯氨酸等渗透调节物质,降低渗透势,增加吸水和保水能力,保证植物水分代谢和生长发育(蒲高斌等,2011)。本研究表明: 可溶性糖和脯氨酸是马尾松低温胁迫条件下的保护物质,抗寒性强的古蓬种源可溶性糖和脯氨酸含量随着低温胁迫的加剧保持持续升高的趋势,其含量维持在较高水平,通过两者的不断累积,主动渗透调节能力得到加强,逆境下的适应性得到提高,从而增加抗寒能力; 而桐棉种源在0℃前后2 种物质含量均出现明显的下降,换言之,抗寒性弱的马尾松可溶性糖和脯氨酸在0℃出现转折点,该结论可用于比较马尾松的抗寒能力,即测定4和0℃时可溶性糖和脯氨酸的含量,若含量下降,其抗寒性较差,若含量升高,其抗寒性较强。

可溶性蛋白质含量代表氮代谢的水平,参与各种生理代谢过程,与植物的生长密切相关。可溶性蛋白质的增多可束缚更多的水份,提高细胞的持水力,同时可减少原生质因结冰而伤害致死的机会。本试验中抗寒性强的古蓬种源的变化幅度较小,而桐棉种源的变化幅度较大,表明抗寒性强的种源可溶性蛋白质含量变化幅度较小,抗性弱则变幅大。

大量研究表明: SOD与POD是植物对膜脂过氧化的酶促防御系统的重要保护酶,在低温等逆境胁迫下,可与活性氧和自由基发生超氧歧化反应,使细胞膜免遭破坏,防止膜脂过氧化(谭健晖等,2007;谭健晖,2007; Kanazaw et al., 2000; Mishra, et al., 1993; Choudhui,1988; Howel et al., 1981; 杨章旗,2011)。本试验中不同马尾松种源的SOD活性均呈“M”型变化,只是抗寒能力强的种源活性较强; POD活性先降低后升高,与SOD不同,抗寒种源POD活性较低,但在低于0℃的冰冻胁迫下直线升高,且表现为持续走高的趋势。本研究表明: 在低温胁迫过程中,SOD对零上温度较敏感,属于冷害敏感型酶,在0℃以上低温前的酶活越高,时间持续越长,则抗寒性越强; POD对0℃以上温度较敏感,属冻害型酶,0℃以上低温时活性升高越快,持续时间越长,则抗寒性越强; SOD的启动时间早,POD的启动晚,但在逆境胁迫下相互协调,协同作用共同抵抗低温。

MDA是膜脂过氧化的最终产物,其含量的变化直接反映了膜的伤害程度。本试验中桐棉种源的MDA含量在不同温度下均大于古蓬种源,且在4和-5℃下出现2 个峰值,古蓬种源只在-5℃时达到最高峰值,证明桐棉种源膜受伤害早且受伤害程度深。因此,MDA含量峰值出现越晚,数值越低,抗寒性越强。

马尾松在低温胁迫下,体内发生复杂的生理生化变化,不能单独以某种生化变化来判断马尾松抗寒性的强弱,需要综合考虑各种生化指标的大小、启动的快慢和持续时间的长短以及各指标的变化幅度等多种因素。综合本研究结论,抗寒性强的马尾松具有较高的叶绿素、可溶性糖和游离脯氨酸含量,较低的可溶性蛋白和MDA含量,以及较高的SOD活性。

参考文献(References)
[1] 华春,周泉澄,张边江,等.2009.毕氏海蓬子和盐角草幼苗对PEG6000模拟干旱的生理响应.干旱区研究,26(5):702-707.(1)
[2] 黄建昌.1994.草毒对干旱的生理反应.果树科学,11(2):114-116.(1)
[3] 李合生.1999.植物生理生化实验原理和技术.北京:高等教育出版社,1999,32-33.(1)
[4] 潘瑞炽,董愚得.1994.植物生理学.北京:高等教育出版社,318-333.(1)
[5] 蒲高斌,张凯,张陆阳.2011.外源ABA对西瓜幼苗抗冷性和某些生理指标的影响.西北农业学报,20(1):133-136.(1)
[6] 任红旭,陈雄,吴冬秀.2001.浓度升高对干早胁迫下蚕豆光合作用和抗氧化能力的影响.作物学报,27(6):11-18.(1)
[7] 史吉平,董永华.1995.水分胁迫对小麦光合作用的影响.麦类作物,(5):49-51.(1)
[8] 谭健晖,王以红,陈学政.2007.桉树无性繁殖衰退过程中的生理变化.北京林业大学学报:自然科学版,14(3):21-26.(1)
[9] 谭健晖.2007.插条母株年龄对巨尾桉幼林抗氧化生理的影响.林业科学,43(4):11-17.(1)
[10] 王晶英,赵雨森,王臻,等.2006.干旱胁迫对银中杨生理生化特性的影响.水土保持学报,20(1):197-200.(1)
[11] 阎勇,罗兴录,张兴思,等.2007.不同供水条件下玉米耐旱生理特性比较.中国农学通报,23(9):323-326.(1)
[12] 杨章旗.2011.低温胁迫下内源脱落酸对马尾松优良种源抗寒性的调节作用.广西植物,31(4):501-506.(1)
[13] 杨章旗,颜培栋,舒文波.2009.内源激素动态变化与马尾松优良种源抗寒性的关系.广西科学,16(1):87-91.(2)
[14] 杨章旗.2003.马尾松良种及速生丰产配套技术推广应用.广西林业科学研究,23(1):1-6.(1)
[15] 张成军.2003.辽东栎林中四种木本植物幼苗对土壤干旱的生理生态响应.东北林业大学博士学位论文.(1)
[16] 赵世杰,许长成,邹琦,等.1994.植物组织中丙二醛测定方法的改进.植物生理学通讯,30(3):207-210.(1)
[17] Choudhui M A. 1988.Free radical and leaf senescence. Plant Physiology Biochemical India,15 ( 1 ) : 18-29 .(1)
[18] Choudhui M A. 1988.Free radical and leaf senescence. Plant Physiology Biochemical India,15 ( 1 ) : 18-29 .(1)
[19] Howell G S,Dennis F G. 1981. Analyes and Unprevent of Plant Cold Hardness. NY: CRC Press,175-176 .(1)
[20] Mishra N P,Mishra R K,Singhal G S. 1993. Changes in the activitiesof antioxidant enzymes during exposure of intact wheat leaves to strong visible light at different temperatures in the presence of protein synthesis inhibitors. Plant Physiol,102( 3) : 903-910.(1)