林业科学  2013, Vol. 49 Issue (3): 43-50   PDF    
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130306
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文章信息

黄勇
Huang Yong
基于SRAP分子标记的小果油茶遗传多样性分析
Analysis of Camellia meiocarpa Genetic Diversity Based on SRAP Markers
林业科学, 2013, 49(3): 43-50
Scientia Silvae Sinicae, 2013, 49(3): 43-50.
DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130306

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收稿日期：2012-06-04
修回日期：2012-09-25

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黄勇. 2013. 基于SRAP分子标记的小果油茶遗传多样性分析[J]. 林业科学, 49(3): 43-50.
Huang Yong. 2013. Analysis of Camellia meiocarpa Genetic Diversity Based on SRAP Markers. Scientia Silvae Sinicae, 49(3): 43-50.  DOI: 10.11707/j.1001-7488.20130306
基于SRAP分子标记的小果油茶遗传多样性分析
黄勇    
福建省林业科学研究院 国家林业局南方山地用材林培育重点实验室 福州 350012
收稿日期：2012-06-04；修回日期：2012-09-25
基金项目：“十一五”国家科技支撑计划项目( 2009BADB1B01; 2009BADA8B04; 2006BAD01A1706) ; 中国林业科学研究院公益性科研基
摘要：利用SRAP分子标记,从126对引物组合中筛选出11对引物,对小果油茶全分布区的19个居群514个样品进行遗传多样性分析。结果表明: 11对引物组合总共扩增出226条谱带,平均每对引物组合扩增20.55条谱带,其中多态性条带为226,占条带总数的100%。19个居群的遗传距离为0.021 6~0.164 5,显示了较近的亲缘关系。UPGMA聚类结果表明,除了福建6个居群和江西3个以外,其余地理位置相近的居群未能聚在一起。多态性比率(PPB)、Nei’s基因多样度(H)及Shannon信息指数(I)变化幅度分别为84.96%~95.58%,0.321 3~0.388 7及0.473 2~0.567 6; 从物种层次来看,PPB,H,I分别为100%,0.422 3及0.612 6,揭示小果油茶具有丰富的遗传多样性。AMOVA分子变异分析显示,在小果油茶总的遗传变异中,居群内占86.58%,而居群间仅占13.42%。
关键词： 小果油茶    SRAP标记    遗传多样性    
Analysis of Camellia meiocarpa Genetic Diversity Based on SRAP Markers
Huang Yong    
Key Laboratory of Southern Mountain Timber Forest Cultivation of State Forestry Administration Fujian Academy of Forestry Fuzhou 350012
Abstract: In the present study, 11 pairs of SRAP primers were selected from 126 combinations and applied to analyze genetic diversity of 514 samples from 19 populations of Camellia meiocarpa in its whole distribution area. The results showed that a total of 226 fragments was amplified, and the average amplified fragments of each primer pair were 20.55. There were 226 polymorphic bands, and the percentage of polymorphic bands (PPB) was 100%. The genetic distance between 19 populations ranged from 0.021 6 to 0.164 5, indicating that their genetic relationship was very close. The UPGMA clustering showed that the all populations, apart from 3 populations of Jiangxi Province and 6 populations of Fujian Province, were not clustered together according to their geographical locations. The PPB, Nei’s genetic diversity index(H) and Shannon’s information index(I) of different populations were 84.96%-95.58%, 0.321 3-0.388 7 and 0.473 2-0.567 6, respectively. At species level, the three parameters were 100%, 0.422 3 and 0.612 6, respectively, showing rich genetic diversity at both population and species levels of C. meiocarpa. The molecular variance analysis displayed the genetic variation mainly existed within populations (86.58%) and few among them (13.42%) in all genetic variation.
Key words: Camellia meiocarpa    SRAP markers    genetic diversity    

DNA分子标记是基于DNA分子多态性而建立起来的一种标记方法，广泛地应用在植物遗传多样性研究、遗传图谱构建及基因定位、分子标记辅助选择等领域(王志林等，2001)。近年来，由于SRAP标记技术具有易于操作、花费少、多态性强及标记分布均匀等特点，已经越来越多地应用在植物遗传多样性研究方面(Ahmad et al., 2004; Budak et al., 2004;张艳欣等，2010; 李永杰等，2012; 韩欣等，2012)。小果油茶(Camellia meiocarpa)主要分布在福建、江西、广西、湖南及贵州等地，其分布面积及年产量在山茶属(Camellia)油用物种中位居普通油茶(Camellia oleifera)之后，排行第2 位。与普通油茶相比较，小果油茶具有结实量高且稳定、果皮薄、出籽率高、含油率较高、抗逆性较强及居群效应好等优点，是一个很有开发利用前景的油用树种。

林木遗传基础的丰富程度是考察林木新品种选育潜力的主要参考依据(张蕊等，2009; 周炎花等，2011)。小果油茶目前是以栽培为主，伴有野生及半野生2 种状态，其为异花虫媒授粉树种，长期天然杂交繁殖及适应不同的生境，导致了杂种后代的性状类型异常丰富，植株个体间的差异也相当明显。因此小果油茶育种潜力很大，这也为进一步选育出具有特异、优质、高产及高抗等性状的优良种质提供了良好育种材料。本研究利用SRAP技术对不同地理居群的小果油茶进行DNA多态性分析，探究小果油茶的居群遗传结构及居群间亲缘关系，为后续小果油茶的种质资源开发、保存利用及种质创制打下良好的前期基础。

1 材料与方法 1.1 供试材料来源

选择具有代表性的19 个小果油茶地理居群作为取样点，涵盖了其整个分布区。随机选取供试样株，样株之间相距100m以上。除了广西融水、江西崇仁和江西黎川居群的样株为28 株，以及浙江仙居居群较小只选取了9 株外，其余居群的供试样株至少为30 株，且树龄均超过60 年。供试样株生长良好、无病虫害，能反映出居群的总体水平。每个采样株均用GPS进行定位，取样居群在选定前均对其来源背景作了充分的调查。以幼嫩叶片作为试验材料。采样点的基本情况及地理位置见表 1。

表1 采样点的基本情况 Tab. 1 The general situation of sample sites
1.2 SRAP-PCR扩增体系及程序

SRAP引物是由上海生工公司合成，浓度为10μmol·L -1。PCR扩增反应条件参照普通油茶的SRAP反应体系并通过试验探索加以改良(郑婷婷等，2010)。具体的扩增反应体系为:10mmol·L -1上、下游引物各为0.8 μL，Taq聚合酶为1.0U，dNTPs为2.5mmol·L -1，模板DNA为50ng·μL -1，10 × Buffer为2 μL以及50mmol·L -1Mg2+，不足部分用去离子水来补足以达到20 μL。

PCR扩增反应在ABI2720Thermal CyclerPCR扩增仪上进行，参照郑婷婷等(2010)的PCR扩增程序。

1.3 引物筛选

参照Budak等(2004a;2004b)所发表的引物序列(表 2)，在126 对SRAP引物组合中，最终采用了11 对条带明显、可重复及高多态性的引物。

表2 SRAP 扩增引物组合序列 Tab. 2 The SRAP sequences that are applied in this study
1.4 数据统计与分析

选取可重复且清晰可辨SRAP扩增条带，在同一位点上有带记为“1”，无带记为“0”，组成1和0的原始矩阵。计算各个参数指标(Riaz et al., 2001;Uzun et al., 2009; 陈丽静等，2009)。多态性信息含量PIC必须求平均值，即PIC = ΣPICj /m，式中，m为各引物组合的多态性条带数(NPB)，PICj为第j 个位点的多态性信息含量; 标记指数MI = NPB × PIC。

等位基因数(Na)、Shannon信息指数(I)、Nei’s基因多样性指数(H)等参数及聚类分析分别在POPGENE version1.32 及NTSYS2.10 软件中运算(Nei，1987; Yeh et al., 1999; Goulart et al., 2005;Sneath et al., 1973; Comlekcioglu et al., 2008)。

应用TFPGA软件中的Mantel’s检测小果油茶居群之间的遗传距离与地理空间(包括地理距离和海拔)的关系(Miller，1997); 利用GenAlEx6 软件进行居群间的AMOVA分析(Peakall et al., 2006)。

2 结果与分析 2.1 小果油茶SRAP-PCR扩增多态性

经过SRAP引物筛选，获得能够扩增出清晰且可重复条带的11 对引物组合。如表 3 所示，11 对引物中，平均每对的扩增数为20.55 条，累计扩增数为226 条带; 其中引物组合M8E11 扩增的条带最多，高达36 条，而引物组合M1E1和M1E4 扩增的条带最少，均为11 条;11 对引物所扩增多态性比率高达100%。图 1 为引物组合Me1Em4 对部分样品的SRAP-PCR扩增结果。

图1 引物组合Me1Em4 对部分样品的PCR 扩增电泳 Fig.1 PCR amplification patterns by primer Me1Em4 in part samples 1 － 30． 贵州黎平样品Liping in Guizhou; 31 － 45． 福建建宁样品Jianning in Fujian．

表3 SRAP 引物对小果油茶供试样品的PCR 扩增结果① Tab. 3 SRAP-PCR amplification results of C． meiocarpa samples

从参数指标PIC(多态性信息含量)来看，各引物组合总体上相差不大，PIC的均值为0.4288; 其中引物组合M1E4 的PIC值最大，为0.4533，引物组合M8E11 的PIC值最小，为0.4118。参数指标MI(标记指数)反映了引物的扩增效率，各引物组合的MI值相差较大; 引物M8E11 的MI值最高，高达14.8265，表明其扩增效率在各引物中是最高的; 引物M1E1 的MI值最低，仅为4.774，与引物M8E11的差值高达10.0525，表明其扩增效率最低。引物组合M1E4 产生有效等位基因数Ne、Shannon信息指数I及Nei’s基因多样度H 最高，依次为1.8333，0.6455和0.4533; 引物组合M1E1 则最低，依次为1.5866，0.5449和0.3618。

2.2 小果油茶各居群SRAP遗传多样性分析

基于SRAP分子标记所检测的结果表明，小果油茶居群间的遗传多样性水平存在差异。由表 4 可以看出，P1居群的多态性位点比率(PPB =95.58%)、Shannon信息指数(I =0.5676)和Nei’s基因多样度(H =0.3887)3 个参数值为最高，而P6居群则最低(PPB =84.96%，I =0.4732，H =0.3213)。由于这3 个参数值均能有效地揭示居群的遗传多样性状况，由此表明P1居群的遗传多样性最高，P6居群的遗传多样性则最低，而其他居群的遗传多样性水平则介于二者之间。

表4 基于SRAP 的小果油茶居群间的遗传多样性水平① Tab. 4 The genetic diversity among different populations of C． meiocarpa based on SRAP analysis

从观测等位基因数及有效等位基因数2 个遗传参数指标来看，P1居群同样为最多，分别为1.9558及1.6734，而P6居群同样为最少，分别为1.8496及1.5531。在小果油茶的物种水平上，多态性位点比率(PPB)、Shannon信息指数(I)和Nei’s基因多样度(H)依次为100%，0.6126和0.4223，由此说明了小果油茶的遗传多样性在地理居群和物种2 个层次上均呈现出较高的水平。

2.3 小果油茶居群的遗传分化分析

对19 个居群进行基因分化分析(表 5)，可知，不同居群之间的Gst(基因分化系数)值为0.1343，由于多年生植物、远缘杂交植物及虫媒授粉植物的Gst总体水平值分别为0.19，0.22 及0.264(Nybom，2004; 张德全等，2008)，因此小果油茶的Gst值明显低于以上3 类植物。

表5 小果油茶居群的遗传分化分析 Tab. 5 Genetic differentiation analysis of C． meiocarpa populations

居群的总遗传多样性Ht值高达0.421，从而表明小果油茶的遗传多样性水平较高，且大多数的遗传变异存于居群内，即居群内占86.58%，而居群间仅占13.42%。

由不同引物组合扩增而产生的基因流相差较大，其中最大的为引物组合M8E7，其基因流(Nm)高达23.0636，最小的为引物组合M1E1，其基因流(Nm)为1.6490，二者差值高达21.4146。19 个不同居群之间的基因流较高(Nm =3.2235)，显示了不同居群间存有较为频繁的基因流动。

2.4 小果油茶居群的AMOVA分子变异分析

AMOVA分子变异分析(表 6)表明，在小果油茶总的遗传变异中，87.75% 的遗传变异发生在居群内，而只有12.25% 的变异发生在居群间。从而表明小果油茶居群内变异远远大于居群间，即其遗传变异主要来源于居群内，这一结论与小果油茶居群遗传分化研究结果(表 5)相同。

表6 19 个居群的分子变异分析 Tab. 6 Analysis of molecular variance among 19 populations
2.5 小果油茶居群间的遗传距离及聚类分析

通过对19 个小果油茶居群的遗传距离统计分析(数据省略)，结果显示19 个居群的遗传距离在0.0216 ~0.1645 之间，平均值为0.0988; 居群间的遗传相似度位于0.8483 ~0.9786 之间，平均值为0.9062。P4居群和P6居群的遗传距离最大，为0.1645，说明其遗传差异最大; 而P16居群和P17居群的遗传距离最小，为0.021，即其遗传差异最小。

根据遗传一致度(Nei et al., 1978)对19 个小果油茶居群进行UPGMA聚类分析(图 2)，可知: 在阀值0.894 处，19 个小果油茶居群聚成2 大类，类群Ⅰ为P5，P6，P10，P12及P15居群，其余居群划为类群Ⅱ; 在阀值0.906 处，又可把类群Ⅱ划为3 个亚类群，其中P7，P8，P9，P16，P17，P18，P19以及P11居群组成亚类群Ⅰ，P3居群归为亚类群Ⅱ，而P1，P2，P4，P13以及P14居群划为亚类群Ⅲ。从聚类图可知，在19 个小果油茶居群中，除了福建的6 个居群和江西3 个居群的聚类结果显示出一定的地理分布特征外，其余居群并未按其地理特征进行归类; Mantel检验也呈现出同样结果(Mantel，1967)。从而表明遗传距离与地理空间(海拔及地理距离)并没有显著相关。

图2 基于SRAP 分析的19 个居群聚类 Fig.2 The cluster dendrogram based on SRAP analysis for 19 populations 居群编号见表 1。Population codes see Tab. 1.
3 结论与讨论 3.1 小果油茶的遗传多样性与基因流

若以遗传参数多态性位点比率(P)、Shannon信息指数(I)和Nei’s基因多样度(H)为衡量遗传多样性的标准，可知，P1居群最高，而P6居群则最低，其他居群的遗传多样性位于二者之间。在小果油茶的物种水平上，P，I和H 依次为100%，0.6126和0.4223，高于同样运用SRAP标记的墨西哥落羽杉(Taxodium mucronatum)(周冬琴等，2012)、大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)(唐琴等，2012)及烟草(Nicotiana)(刘艳华等，2009)，同样也高于山茶属茶树(Camellia sinensis)(郭春芳等，2008; 刘本英等，2008; 王旭等，2011)，揭示了小果油茶的遗传多样性在居群和物种2 个层次上均较为丰富。

遗传分化及AMOVA分子变异分析结果均有效地揭示了小果油茶的遗传变异主要来源于居群内，这个结论与其他木本植物(虫媒授粉)的研究结果(曾杰，2002)相类似。

居群间的基因流动形成基因流(gene flow)，种子植物群体间的最主要基因流是通过种子或花粉传播而产生(Grant，1991)。当基因流Nm ＜1 时，反映出居群间的隔离程度较大，基因流动不足以抵制因遗传漂变而引起的居群分化(Allendorf，1983); 而基因流Nm＞1 时，反映出居群间存在频繁的基因交流，从而防止因遗传漂变引起的遗传分化，有利于保持遗传稳定性(Slatkin，1987)。

小果油茶居群间的Nm为3.2235，说明不同居群间存在较为频繁的基因流动，这将有利于发挥其均质化的作用，从而有效地抑制其居群间的遗传分化(黄玮等，2008)。因此小果油茶不同居群间的遗传分化程度较低，其基因分化系数仅为0.1343，而张德全等(2008)所统计的虫媒授粉植物的基因分化系数平均值为0.264，与之相比，明显偏低。

3.2 小果油茶居群间遗传距离与地理距离的相关性

遗传距离及遗传一致度体现了不同地理居群间的亲缘关系。结果显示19 个居群遗传距离为0.0216 ~0.1645，平均值为0.0988; 而遗传一致度为0.8483 ~0.9786，平均值为0.9062。表明小果油茶居群间遗传差异较小，亲缘关系相近。

UPGMA聚类结果显示，除了福建6 个小果油茶居群和江西3 个居群的聚类结果呈现了一定的地理分布特征以外，其余的居群均未按照其地理区域分布特征进行聚类。

已有学者认为林木居群间遗传差异的大小跟地理因子密切相关(Marchelli et al., 2001)，因此育种研究者也常常参照这一理论进行杂交亲本的选择。虽然已有研究显示，林木的遗传距离和地理因子之间存在着较为明显的相关性(Khalil，1984; Le Corre et al., 1997; Guo et al., 2006; 王玉山等，2011; 张振等，2012)，但另有一些学者却认为两者之间并非存在着必然的联系(Jordano et al., 2000; 赵扬等，2007; 田华等，2009; 沈俊岭等，2010)。相对于地理远距离所产生的种群遗传差异，异质化生境条件下的选择压力及遗传漂移(genetic drift)所形成的遗传差异则更大(Bhatt，1970)。本次研究结果表明小果油茶的遗传距离与地理距离之间并不相关，从而表明遗传漂变在小果油茶居群的自然分化中所产生的作用大于地理空间的隔离，这种遗传分化模式不符合Wright所提出的种群“距离决定隔离”(isolation by distance)的自然分化理论(Wright，1943)，从而也说明了Wright的自然分化理论并不是种群遗传分化的唯一解释(陆建英等，2008)。

3.3 小果油茶遗传资源现状及保护建议

从分布面积及产量来看，小果油茶作为在山茶属中仅次于普通油茶的第2 大油用树种，基于SRAP分子标记的分析结果显示其有着较高的遗传多样性水平，从而表明了小果油茶有着很高的种质资源保育价值及良好的发展利用前景。然而小果油茶的发展现状令人堪忧，在不少产区，大面积林分失管返荒或逐浙被其他树种更新，导致其分布面积逐年减少甚至已经灭绝，如广东的平远、乐昌、饶平和焦岭以及湖南的靖州、永州、道县和会同等地，据史料记载，这些地方同样为小果油茶的天然分布区，但由于经济效益等多方面的原因而最终导致小果油茶被其他树种所替代。不仅如此，其他产区也出现大量的小果油茶优质遗传资源受到破坏的现象。因此，目前小果油茶的种质资源发展状况应引起足够的重视，必须尽快制定出一系列适合于当地小果油茶种质资源合理保护及开发利用的对策。

小果油茶的保护措施需根据当地小果油茶的遗传多样性状况而定(Hogbin et al., 1999)。根据本文对小果油茶全分布区的遗传多样性的研究结果，可相应采取原位保护和迁地保护的措施。

原位保护可以节省大量的人力、物力及财力，所以应予以优先考虑。当地政府应推行各项鼓励政策以提高农民种植小果油茶的积极性。小果油茶全分布区主要有2 个分布条带: 一个分布条带是自湖北省东南部东南方向一直延伸至东南沿海的福建福州，横跨湖北、湖南、江西及福建4 省，这个分布区域面积较大，涵盖了福建全省、江西大部、湖南及湖北部分地区; 另一个条带分布在贵州东南部、湖南西南部及广西东北部，其分布区域虽较小，却分布非常集中。参照全分布区19 个居群的遗传多样性统计结果，在前一个分布区内，湖北(阳新)和湖南(平江)可各选取1 个居群进行原位保护，江西和福建由于分布面积较大，各选2 个遗传多样性较为丰富的居群加以保护，福建可选取建宁和清流居群，而江西则可选取黎川和宜春居群; 后一个分布区内贵州(黎平)、广西(融水)及湖南(通道)可各选取1 个居群作为种质资源进行原位保护。

目前我国油茶林地大多划归为个人所有，采取行政手段干预加以保护当地小果油茶遗传资源在实施上较为困难，因此通过迁地建立种质资源收集区不失为较为稳妥的保护措施。在主要分布的2 个条带上，各自选取若干个较为可靠的试验点加以实施。每个居群所选取的样本数(至少30 株)必须能够代表该区域的遗传多样性总体水平。

此外，还可以通过建立无性系资源收集圃等方式，进行特异育种材料的收集保存，为小果油茶后续的杂交育种提供优质的育种材料。

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基于SRAP分子标记的小果油茶遗传多样性分析
黄勇