昆虫取食或人工机械损伤植株均能诱导植物防御相关基因的表达(Mithöfer et al., 2005)，但防御基因表达的类型并不完全相同；触摸或降雨等机械刺激，并不引起植物产生类似昆虫取食后诱导的防御反应(Heil et al., 2006)。机械刺激是诱导植物产生防御反应的激发子之一，植物对这类激发子的识别能力，是区分昆虫取食活动引起的机械伤害与人工机械伤害的基础。

针刺、触摸、风力等机械刺激均会诱导植物细胞内游离Ca²⁺浓度升高(Braam, 2005)。在植物细胞的质膜上存在着种类众多对机械刺激敏感的Ca²⁺通道，植株对机械刺激的感知与跨膜Ca²⁺流密切相关(Plieth et al., 2002; Toyota et al., 2008)。植物细胞对机械刺激的感知，与H⁺流和活性氧的产生密切联系，二者是联系Ca²⁺信号与机械刺激诱导的下游信号的纽带(Monshausen et al., 2009)。H⁺流的变化是植物细胞对机械刺激感知的重要机制，可将感知的机械刺激信号转化为胞内信号，从而调节基因转录的作用(Lapous et al., 1998)。多种环境刺激均引起植物细胞Ca²⁺的内流及活性氧的产生，说明这2种不同的胞内第二信使分子在感受外界环境的变化过程中经常起到协同作用，存在密切联系(Gus-Mayer et al., 1998; Legué et al., 1997)。

沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)为豆科(Leguminosae)沙冬青属，是亚洲中部荒漠地区唯一的常绿灌木，是园林绿化、防风固沙等方面一种重要的荒漠资源植物(夏恩龙等，2006)。沙冬青自然分布区遭受多种地上害虫的危害，导致沙冬青现存种群数量减少，如果虫害在引种地大面积暴发，就可能导致引种失败(许胜利等，2006)。因此，加强沙冬青害虫发生规律及其防治策略的研究，对珍稀濒危植物沙冬青的资源保护和引种栽培，发挥其生态和景观效益都具有重要的理论和实践意义。

“非损伤微测系统”可以在不接触被测样品的情况下获取进出样品的各种分子/离子流速及其运动方向的信息，是研究生物膜运输系统的有力工具(Newman, 2001)。本试验借助于非损伤微测技术及激光共聚焦显微镜，研究沙冬青细胞感受机械刺激后，细胞Ca²⁺流、H⁺流及H₂O₂之间的信号关系。目的在于揭示沙冬青细胞对机械刺激这类非生物激发子的识别机理，阐明Ca²⁺，H⁺，H₂O₂等相关信号物质在沙冬青细胞对机械损伤早期识别中的作用。

1 材料与方法 1.1 试验材料

沙冬青种子在超净工作台上用0.1%升汞消毒15 min，无菌水冲洗3次。去除种皮，将种子接种在固体B₅培养基(6-BA 1 mg·L^-1，NAA 1 mg·L^-1，20 g·L^-1蔗糖，pH5.8)中，暗培养。待子叶展平后将下胚轴剪成0.8~1 cm的小段接种在B₅培养基上(成分同上)，持续黑暗，进行愈伤组织的诱导。

诱导出来的愈伤组织进行沙冬青悬浮细胞的培养：愈伤组织接种于液体B₅培养基(6-BA 1 mg·L^-1, NAA 1 mg·L^-1，20 g·L^-1蔗糖，pH5.8)中，摇床运行条件为：160 r·min^-1，25 ℃，持续黑暗。每隔12天按照1:10(v/v)的比例对细胞进行1次继代培养。试验的前3天对所用细胞进行继代培养，以保证试验用细胞处于指数生长期。

为了消除细胞培养液对测量结果的影响，试验前对B₅培养基中培养的沙冬青悬浮细胞进行离心洗涤。5 mL沙冬青悬浮细胞300 r·min^-1离心5 min后，去除上清；然后分别加入5 mL测试液，对细胞离心洗涤2次；最后加入5 mL测试液平衡2 h后备用。

1.2 机械刺激细胞的方法

测量前，首先使细胞粘附在玻璃底培养皿(glass bottom dishes，P35G-1.5-10-C, MatTek Corporation)底部，以避免测量过程中由于中间进行药物处理或测定过程中电极的往返运动造成细胞的移动。玻璃底培养皿使用前需要进行处理：玻璃底培养皿用酒精浸泡2 h后，去离子水反复冲洗，然后在烘箱中50 ℃ 2 h烘干。玻璃底培养皿的底部滴约10 μL浓度为0.000 8 mg·mL^-1的多聚赖氨酸(Poly-L-lysine，P7890-25MG，sigma)水溶液，5 min后用移液器吸走多聚赖氨酸，用去离子水清洗玻璃底培养皿的底部3次，然后50 ℃ 2 h烘干，室温储藏在干燥器中备用。用50 μL测试液洗涤后的沙冬青悬浮细胞滴在玻璃底培养皿的中部，约20 s后用测试液洗涤皿底部3次，去除没有粘附的细胞。

细胞贴壁后，玻璃底培养皿加入3 mL相应离子的测试液，放入非损伤微测系统的载物台上。通过调节系统的铅制螺杆并结合显微镜的焦距调节，使离子选择性电极的尖端靠近被测细胞。然后，通过扫描离子选择电极系统自带的ASET软件并结合显微成像系统，精确调节选择离子电极的尖端距离被测细胞2~5 μm。

首先进行5 min稳态Ca²⁺或H⁺流的测量。然后通过计算机键盘调节微电极的控制系统移动离子选择微电极，使电极的尖端向细胞移动10 μm刺激细胞后，再向后移动10 μm，使电极尖端重新回到机械刺激细胞前的位置，完成1次机械刺激。每次测量对细胞机械刺激10次，刺激完成后平行移动微电极10 μm，同时保证电极尖端距离被测细胞2~5 μm，继续进行35~40 min Ca²⁺或H⁺离子流的测量。

1.3 离子流的测定方法

Ca²⁺，H⁺离子流的测定采用非损伤微测技术中的扫描离子选择电极技术(SIET)(SIET系统型号为BIO-IM-008，Younger USA Sci.&Tech. Corp.，USA)。扫描离子选择电极方法的具体操作步骤如下：提前拉制好并经过二甲基三甲基硅胺硅烷化处理的毛细管(尖端直径2~4 μm，XYPG120-2；Xuyue Sci. and Tech. Co., Ltd.)的后端灌入距离毛细管尖部长度约1 mm的相应测定离子的灌充液(Ca²⁺: 100 mmol·L^-1 CaCl₂；H⁺: 40 mmol·L^-1 KH₂PO₄和15 mmol·L^-1 NaCl，pH7.0)；然后通过离子选择性微电极制备装置在毛细管的前端吸入长度约20 μm的相应液态离子交换剂(LIXs)(Ca²⁺：Sigma21048；H⁺：Sigma95293，Sigma-Aldrich, Louis, MO63103, USA)；制作好的离子选择性电极套入Ag/AgCl电极线基座(XYEH01-1; Xuyue Sci. and Tech. Co., Ltd.)，使氯化好的银丝与灌充液接触；参比电极为MI-402(Microelectrodes, INC.)。测量前对制作好的离子选择性电极进行校正。Ca²⁺校正液为：0.05和0.5 mmol·L^-1的CaCl₂；H⁺校正液为：pH 5.5和pH 6.5的蒸馏水(用1 mol·L^-1 HCl和1 mol·L^-1的NaOH调节)。2种离子测试液的成分为：(0.1 mmol·L^-1 KCl，0.1 mmol·L^-1 CaCl₂，0.1 mmol·L^-1 MgCl₂，0.5 mmol·L^-1 NaCl，0.2 mmol·L^-1 Na₂SO₄，0.3 mmol·L^-1 MES，0.1% Sucrose，pH5.8)。只有能斯特斜率大于25 mV(Ca²⁺电极)或50 mV(H⁺电极)的离子选择性电极被使用。

通过SIET系统自带的ASET软件，控制运动控制器(CMC-4)来调节选择离子电极尖端接近细胞的表面约2~5 μm，利用预先设置好的程序使电极的移动距离为10 μm，测量2点间的电位差值，采样频率为0.2 Hz。

1.4 H₂O₂测定方法

通过H₂O₂特异的荧光探针H₂DCF-DA检测沙冬青细胞内的H₂O₂含量的变化(Shabala et al., 2001)。不发光的H₂DCF-DA进入细胞后，经酯酶的作用脱去二酯(DA)，生成不发光的H₂DCF，H₂DCF被H₂O₂氧化生成发荧光的DCF。H₂O₂含量与DCF荧光强度成正比，因此可以通过检测DCF的荧光强度，定性及定量监测细胞内H₂O₂的动态变化(Allan et al., 1997)。

细胞贴壁后，用3 mL含有50 μmol·L^-1的胞外Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃的测试液或3 mL含有50 μmol·L^-1 Diphenyleneiodonium chloride(DPI)的测试液预处理贴壁后的沙冬青细胞30 min；移液器吸出抑制剂，50 μmol·L^-1的H₂DCF-DA(Sigma)室温避光孵育5 min，倒掉H₂DCF-DA，测试液洗涤3次以去除残留染料。培养皿中加入3 mL含有相应浓度抑制剂(50 μmol·L^-1 LaCl₃或50 μmol·L^-1 DPI)的测试液，激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5)进行机械刺激前DCF荧光测量；用非损伤微测系统对该细胞进行机械刺激后，重新测量DCF荧光(机械刺激完成后10, 20 min后测量)。

激光共聚焦荧光显微镜设置为：激发波长488 nm，发射光波长510~530 nm，扫描速度512×512像素。沿Z轴进行层面厚度3 μm的层面扫描，用Lecia ApplicationSuit Adanvance Fluorescence软件采集荧光图像，三维重建图像获得每个细胞的最大荧光强度。

1.5 抑制剂处理方法

细胞用3 mL含有相应浓度抑制剂的测试液预处理30 min后，首先进行5 min稳态Ca²⁺或H⁺流的测量，然后对细胞进行机械刺激后继续进行35~40 min Ca²⁺或H⁺流的测量。试验所用的抑制剂终浓度分别为：50 μmol·L^-1 LaCl₃；100 μmol·L^-1 Verapamil；50 μmol·L^-1 Diphenyleneiodonium chloride (DPI)。

1.6 数据分析

离子流速的计算用Mageflux软件完成(http://xuyμe.net/mageflux)，离子内流为负值，外流为正值。连续的6个数据的平均值，反映了0.5 min内所测定的离子进出细胞的情况。每个处理重复6~9次，计算标准误。整合离子流是样品平衡后，测量时间内离子流速的积分，用Originpro(OriginLab Corporation，8.5.1 SR2)软件进行整合离子流的计算；不同处理的整合离子流进行方差分析，Tukey多重比较。

2 结果与分析 2.1 机械刺激后沙冬青悬浮细胞Ca²⁺流变化

沙冬青细胞经过机械刺激后，Ca²⁺流具有2个阶段的特点。首先Ca²⁺迅速内流，大约5 min后Ca²⁺内流速度达到最大值(159±66) pmol·cm^-2s^-1；随后Ca²⁺内流速度逐渐减弱，但在测量的时间内呈现持续的内流(图 1a)。

LaCl₃，Verapamil是2种不同类型的胞外钙通道阻断剂，50 μmol·L^-1 LaCl₃预处理沙冬青细胞后，基本抑制了机械刺激引起的Ca²⁺的内流；100 μmol·L^-1 Verapamil预处理沙冬青细胞后，仅部分抑制机械刺激引起的Ca²⁺的内流(图 1b)。

图 2显示不同处理后，沙冬青悬浮细胞整合Ca²⁺流的变化情况。没有进行机械刺激的对照细胞Ca²⁺小幅外流，整合Ca²⁺流为(337±104) pmol·cm^-2；机械刺激后，大量Ca²⁺流入沙冬青细胞，整合Ca²⁺流达到(-3 128±1 159) pmol·cm^-2，与对照比差异显著(P < 0.05)。LaCl₃预处理细胞后，彻底抑制了机械刺激触发的Ca²⁺内流，整合Ca²⁺流为(-156±182) pmol·cm^-2，与对照比差异不显著；Verapamil预处理细胞后，沙冬青细胞整合Ca²⁺流为(-1 681±472) pmol·cm^-2，与对照比差异显著，表明Verapamil预处理部分抑制机械刺激引起的Ca²⁺的内流(图 2)。

2.2 机械刺激后沙冬青悬浮细胞H⁺流变化

机械刺激处理沙冬青细胞后，触发了H⁺振荡内流，开始时H⁺内流较快，随后逐渐减弱，但在测定时间内呈现持续内流(图 3)。为研究Ca²⁺信号与H⁺内流信号间的关系，试验采用了Ca²⁺通道抑制剂LaCl₃对沙冬青细胞进行了预处理。50 μmol·L^-1的LaCl₃预处理后，抑制了机械刺激触发的H⁺内流(图 3)。试验表明，机械刺激诱导的H⁺内流依赖于胞外Ca²⁺库中Ca²⁺内流。

为研究H₂O₂与H⁺内流的关系，试验采用50 μmol·L^-1的NADPH氧化酶专一性抑制剂DPI预处理沙冬青细胞。DPI预处理抑制了机械刺激引起的沙冬青细胞H⁺内流，证明机械刺激作为一种物理激发子，诱导沙冬青细胞H⁺内流依赖于H₂O₂的产生，活性氧信号作用于H⁺内流的上游(图 3)。

2.3 机械刺激后沙冬青悬浮细胞Ca²⁺流与H₂O₂的关系

为研究机械刺激沙冬青悬浮细胞后，对Ca²⁺与H₂O₂信号间的关系进行了抑制剂试验(图 4)。机械刺激沙冬青细胞10，20 min后，未经过LaCl₃预处理的对照细胞DCF荧光明显增强。由于不同的细胞间存在个体差异(细胞活力的差异)及荧光探针孵育的时间、探针的浓度不可能做到完全一致，这些因素均会导致H₂O₂的荧光反应在实施刺激之前，各处理细胞的DCF荧光本底不一致，但LaCl₃，DPI 2种抑制剂预处理沙冬青细胞后，均抑制机械刺激触发的DCF荧光的增强，并随机械刺激后测量时间的延长抑制程度进一步加强(图 4)。

3 结论与讨论

昆虫取食活动，一方面把昆虫口腔分泌物中的化学激发子引入植株的受害部位，另一方面对植物组织造成机械刺激。机械刺激作为一种有效的激发子，能诱导植物产生包括防御基因表达及释放伤诱导挥发物在内的多种防御反应(Mirabet et al., 2011)。但是相对于这些发生在植物遭受机械刺激后较晚时间发生的事件，目前对植物对机械刺激后几分钟、甚至数秒钟内发生的早期信号事件的研究并不多。

Ca²⁺作为植物体内最广泛存在的第二信使分子，多种外界刺激均诱导Ca²⁺内流，Ca²⁺内流是通过质膜上的Ca²⁺通道来完成的。不同的Ca²⁺通道具有不同的激活机制，质膜上存在着：电压门控钙(voltage-dependent)、配体门控(ligand-dependent)及应力激活(stretch-activated)3种类型的Ca²⁺通道(Richter et al., 2009)。在不同类型的Ca²⁺通道作用下，植物细胞感知外界环境刺激后，引起Ca²⁺内流并形成与外界环境刺激密切联系的钙指纹特征(Nakagawa et al., 2007; White et al., 2003)，从而把特异的环境信号转化为植物细胞可以正确“解码”的胞内Ca²⁺信号(Demidchik et al., 2007)。

机械刺激沙冬青悬浮细胞后，触发的Ca²⁺内流来源于细胞质外体或测试液中的Ca²⁺。2种胞外钙通道抑制剂预处理沙冬青细胞后，机械刺激触发的Ca²⁺流却表现出截然不同的特征。LaCl₃彻底抑制机械刺激触发的Ca²⁺内流；但电压门控Ca²⁺通道阻断剂Verapamil仅部分抑制了机械刺激触发的Ca²⁺内流(图 1b)。结果表明：机械刺激激活了质膜上电压门控Ca²⁺通道及对电压不敏感的应力激活Ca²⁺通道，从而引起Ca²⁺内流。但考虑到LaCl₃的广谱型的特点，对不同类型的Ca²⁺通道均产生抑制作用(Apel et al., 2004; Besson-Bard et al., 2008)，因此沙冬青细胞经LaCl₃预处理后，彻底抑制了机械刺激触发的Ca²⁺内流。

由于试验手段的限制，本试验无法了解沙冬青细胞内Ca²⁺浓度的变化情况。细胞质自身对Ca²⁺具有很强的缓冲能力，可能延缓胞内Ca²⁺浓度的升高(Haley et al., 1995; Knight et al., 1991)；因此即使机械刺激后胞内Ca²⁺浓度出现升高，也可能是胞内Ca²⁺库中Ca²⁺的释放。持续机械刺激诱导的Ca²⁺周期性震荡内流是否能引起胞内Ca²⁺浓度产生不同振幅、频率的钙指纹特征尚有待于进一步研究。目前的研究认为，在质膜上存在多种机械刺激感受器(mechanoreceptors)(McAinsh et al., 2009)，这些机械刺激感受器的活化触发了质膜上多种通道蛋白的活性，从而引起Ca²⁺内流。

机械刺激首先诱导沙冬青细胞H⁺快速内流；但抑制剂试验表明，沙冬青细胞经过胞外Ca²⁺通道阻断剂LaCl₃预处理后，完全抑制了机械刺激触发的H⁺内流，说明机械刺激诱导的H⁺的内流依赖于胞外Ca²⁺内流(图 3)。质膜上NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理沙冬青细胞后，同样抑制了机械刺激触发的H⁺内流，证明了机械刺激触发的H⁺内流依赖于机械刺激后触发的细胞内H₂O₂的积累(图 3)。

DCF荧光试验进一步证明：Ca²⁺内流、H₂O₂积累及H⁺内流这些早期信号间的顺序关系(图 4)。机械刺激沙冬青细胞后，细胞内Ca²⁺内流对随后发生的事件起着关键的作用，机械刺激后胞内H₂O₂的积累、H⁺内流均依赖于Ca²⁺内流；同时H₂O₂的积累是机械刺激诱导的H⁺内流的上游信号事件。

H⁺内流引起细胞质酸化，多种悬浮细胞遭受生物或非生物胁迫后，诱导的细胞质酸化与细胞内活性氧的积累密切相关(Cazale et al., 1998; Okada et al., 2002; Pugin, 1997)；细胞内外酸碱度的变化，影响细胞内众多蛋白质的活性。如胞内pH变化可以调节质膜上多种离子转运蛋白的活性，番茄(Lycopersian esculentum)细胞质酸化后激发了多种防御相关基因的转录(Busa et al., 1984)。细胞内酸碱度的变化可以作为第二信使分子，对植物细胞的多种信号转导途径起到调节作用(Lapous et al., 1998)。H⁺流的变化是细胞对机械刺激感知的重要机制，起到将感知后的外部机械刺激信号转化为胞内信号从而调节基因转录的作用(Lapous et al., 1998)。