2012, Vol. 48
文章信息
- 王雪, 接伟光, 蔡柏岩
- Wang Xue, Jie Weiguang, Cai Baiyan
- 不同生境黄檗AM真菌菌群结构分析
- Community Composition of the AM Fungi of Phellodendron amurense in Different Habitats
- 林业科学, 2012, 48(9): 99-107.
- Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(9): 99-107.
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文章历史
- 收稿日期：2012-02-18
- 修回日期：2011-06-30
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作者相关文章
2. 黑龙江东方学院食品与环境工程学部 哈尔滨 150086
2. Insitute of Food and Environment Engineering, Heilongjiang East University Harbin 150086
丛枝菌根(arbuscular mycorrhizal，AM)真菌是自然界中普遍存在的一种寡营养活体微生物，能够侵染绝大多数的陆生植物根系而形成菌根(Violi et al., 2008; Daei et al., 2009; Taheri et al., 2010)，具有提高植物对营养元素的吸收，提高植物的抗逆性，提高苗木移栽成活率等作用(Bedini et al., 2007; Andrés et al., 2009; Gyuricza et al., 2010)。AM真菌的分布是世界性的，但在不同的土壤气候带，由于环境因子的不同，AM真菌的多样性存在差异。
黄檗(Phellodendron amurenso)又名黄菠萝，属芸香科阔叶乔木，是我国东北阔叶红松林的重要伴生树种，为珍贵的药用植物和用材树种，被列为国家二级保护植物(阎秀峰，2003)。目前，国内外关于黄檗AM真菌的研究并不多，仅涉及到接种AM真菌对黄檗药用成分影响方面的研究(范继红等，2006)，以及黄檗菌根真菌初步鉴定(接伟光等，2007)等。本研究分析了3种不同生境下黄檗根系AM真菌侵染情况，并利用PCR-DGGE技术分析不同生境下黄檗根系AM真菌菌群组成及多样性，揭示其菌群变化规律。该方法能减少传统分类鉴定的误差，并通过指纹图谱直接再现群落结构，克服传统方法的局限性，可为今后收集、保护及利用这类微生物资源，以及为黄檗菌根功能菌群的研究奠定基础。
1 材料与方法 1.1 材料黄檗根系于2008年8月分别采自3种不同的生境。1)东北林业大学校内林场(简称林大)，位于黑龙江省哈尔滨市内，处于亚欧大陆东部的中高纬度，地理坐标为45°41'N，126°37'E。该样地属于典型的城市人工林，主要树种有红松(Pinus koraiensis)、落叶松(Larix spp.)、樟子松(P.sylvestris var.mongolica)、水曲柳(Fraxinus mandshurica)、黄檗、胡桃楸(Juglans mandshurica)以及椴(Tilia)、榆(Ulmus)、杨(Populus)、桦(Betula)等。2)东北林业大学帽儿山实验林场(简称帽儿山)，位于黑龙江省尚志市，属于长白山支脉张广才岭西北部小岭的余脉，地理坐标为45°20'—45°25'N，127°30'—127°34' E，该样地为东北东部山区较典型的天然次生林区。境内天然次生林类型多样，木本和草本植物达千余种。土壤类型为暗棕壤，有机质含量丰富。3)伊春市带岭区凉水国家级自然保护区(简称凉水)，位于黑龙江省伊春市，地处小兴安岭山脉的东南部，地理坐标为47°7'39″—47°14'22″N，128°48'30″—128°55' 50″E，区内既有处于演替顶极状态的原始阔叶红松林、冷云杉林和兴安落叶松林，又有处于不同演替阶段的次生林，几乎囊括了小兴安岭山脉的所有森林植被类型。土壤主要为温润地区针阔混交林下发育的暗棕林，为典型的低山丘陵地貌。3个样地的土壤理化性状见表 1。
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随机选取3种不同生境下相近林龄的黄檗各10株，每株为一样点，每个样点按东西南北4个方位，除去表层杂物后，挖10 ~ 20 cm深的土壤剖面，收集其中鲜黄色的根系即为黄檗根系。分别将每10个样点采集的黄檗根系充分混匀，各自组成1个混合样品，其中一部分根样采集后立即放入FAA固定液中保存; 其余根样带回实验室洗净后，立即提取其DNA，-70 ℃保存备用。
1.2 AM真菌侵染率测定统计3种不同生境下黄檗菌根侵染率和根系的菌根侵染强度，公式如下:菌根侵染率(F，%) =菌根侵染的根段数/检测的根段总数×100%，根系的菌根侵染强度(M，%)=侵染根长/总根长×100%。
1.3 DNA的提取根样DNA的提取参照董秀丽等(2006)的方法，稍作修改。
1.4 Nested-PCR扩增AM真菌18S rDNA NS31/Glo1区分别将上述3种不同生境下黄檗菌根DNA适当稀释后作为扩增模板，进行Nested-PCR，反应体系和反应程序参照文献(Schwarzott et al., 2001; 龙良鲲等，2005; 蔡柏岩等，2009)的方法，稍加修改。
取PCR扩增产物各5 μL，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.5 DGGE分析DGGE分析条件参照蔡柏岩等(2009)的方法，稍加修改。
1.6 DGGE图谱分析利用Gel-Pro Analyzer 4.5软件对DGGE图谱的丰度、优势度和多样性指数3个指标进行统计分析。
1.7 DGGE条带的序列分析DGGE条带的序列分析参照蔡柏岩等(2009)的方法。
2 结果与分析 2.1 AM真菌侵染率采用碱解离-酸性品红染色法对不同生境下黄檗根系AM侵染情况进行测定，侵染率如图 1。
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图 1 3个样地AM真菌侵染率 Fig.1 The infection percent of AM fungi in three sites |
由图 1可知: 3个采样地点的黄檗根系均被AM真菌侵染，且侵染率均很高，其中林大地区黄檗AM真菌侵染率最高，达96.72%;其次是帽儿山地区，为94.10%;凉水地区黄檗AM真菌侵染率最低，为91.33%。根系的菌根侵染强度与菌根侵染率呈正相关，林大根系的菌根侵染强度较高。由此可见，不同生境下的黄檗根系AM真菌的侵染率差异较为明显，城市人工林地区菌根的侵染率明显高于天然次生林和天然原始林，天然原始林地区菌根的侵染率最低。
2.2 Nested-PCR及DGGE分析使用该法提取的菌根DNA，无需检测，适当稀释后即可作为模板，进行Nested-PCR。
在靶模板DNA量很少的情况下，通过NestedPCR的放大作用可很好的扩增出目标产物，以获取大量目标产物。从各样品的Nested-PCR扩增结果(图 2)可知:经第1次PCR扩增后，AM真菌DNA的拷贝数较低，难以在琼脂糖凝胶上观察到目的条带(1.8 kb)。而通过第2次PCR扩增，可得到大量目标产物(0.59 kb)，为能够扩增出适宜进行DGGE分析的目标产物，进行了第3次PCR扩增，得到大量目的片段(0.27 kb)。
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图 2 3样地菌根Nested-PCR扩增结果 Fig.2 Amplification of mycorrhizal from three sifes by Nested-PCR M.DL2000 Marker; 1-3:第1次PCR First PCR; 4-6:第2次PCR Second PCR; 7-9:第3次PCR Third PCR |
第3次PCR扩增产物经纯化后，进行DGGE分析，结果如图 3所示。不同样品的DGGE条带数目、各个条带的强度和迁移率均存在一定程度的差异，表明PCR-DGGE技术可以对黄檗AM真菌群落结构进行分析，能够反映不同生境下AM真菌的遗传多样性。
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图 3 3个地点黄檗菌根样品DGGE图谱 Fig.3 DGGE profile of root samples of P.amurense in three sites 1.林大菌根Linda mycorrhiza; 2.帽儿山菌根Maoershan mycorrhiza; 3.凉水菌根Liangshui mycorrhiza. |
DGGE是根据DNA解链行为的不同，分离具有相同长度但是碱基对序列不同的DNA。各泳道中被分离的每一个条带理论上可代表样品AM真菌群落中的一个种属，条带的浓度代表了菌群数量的多少。由图 3可见:在不同样品之间有共同的条带，如条带LG3，说明不同生境下的黄檗菌根中可能都侵染了这种AM真菌，但共有条带的强度也有所不同，表明该AM真菌含量不同。各个样品具有各自特有的条带，如条带LG12只在林大菌根中很亮，条带MG1只在帽儿山地区菌根中有分布，表明有些AM真菌只出现在个别生境下的黄檗菌根中。
2.3 DGGE图谱分析 2.3.1 DGGE图谱的丰度在微生物多样性的分析中，丰度代表一定区域的物种数，反映到DGGE指纹图谱上则代表某个样品中所有条带数量的总和，DGGE指纹图谱的条带数量在一定程度上反映了群落中优势微生物组成的多样性。通过Gel-Pro Analyzer 4.5软件对不同生境黄檗菌根样品18S rDNA NS31/Glo1区DGGE图谱(图 3)进行泳道分析，发现3种样品DGGE带谱在条带数量上存在较大的差异。林大、帽儿山和凉水3地菌根样品分别分离出14，13和10条比较清晰的条带，即丰度分别为14，13和10，表明林大地区黄檗菌根中AM真菌菌群的数量多于帽儿山和凉水地区。
2.3.2 DGGE图谱条带的优势度优势度代表某一特定位置处条带的量占该样品中总体条带量的百分比，与条带的明亮程度和条带的峰面积成正比，反映了各物种种群数量的变化情况(魏薇，2007)。图 4显示:不同样品中各条带的优势度值有不同程度的变化，并且在不同样品中，同一水平位置处的条带的优势度值不同。
图 4显示不同菌根样品中不同条带优势度值的变化情况。林大菌根DGGE条带中LG5条带的优势度值最高，为15.95%，LG10的优势度值最低，为1.40%;帽儿山菌根DGGE条带中MG2的优势度值最高，为19.55%，MG12的优势度值最低，均为1.10%;凉水菌根中YG2的优势度值最高，为19.41%，YG10的优势度值最低，为4.66%。
2.3.3 DGGE图谱条带的多样性指数多样性指数表示环境中的生物多样性情况，多样性指数的高低反映优势菌群种类的多少，这与种群数量的多寡和种群个体分配均匀度的高低情况有关。林大、帽儿山、凉水地区菌根样品AM真菌Shannon-Wiener指数分别为3. 29，3. 24和3. 21，这说明凉水地区黄檗菌根样品中的AM真菌种群数量最少，同时种群的丰富度也最低，种群个体分配均匀性最低; 而林大地区黄檗菌根样品中，AM真菌种群数量最多，种群个体分配均匀性最高，在该系统中的生物多样性也最高。
由以上试验结果及表 1可知:城市人工林地区菌根的侵染率、丰度、优势度、多样性指数均高于天然次生林和天然原始林，且天然原始林地区菌根各项检测指标最低，这主要是由土壤理化性质所决定的。土壤理化性质是影响AM真菌侵染的重要因素之一，土壤养分对AM真菌多样性具有重要影响，肥力高的土壤中，AM真菌侵染率较低。其中，土壤速效磷的含量，土壤有机质以及土壤pH对AM的形成以及繁殖体数量有直接影响。土壤中的有机质、有效磷和氮素的积累量较少，在酸碱性适中的条件下，有利于AM真菌的活动。Michelini等(1993)研究了矿质营养、有机质含量、土壤pH值等对AM真菌发育的影响，发现不同地区侵染状况显著不同，区域特征与菌根侵染之间有显著的相关性。同时，其他环境因子也影响植物对AM真菌的选择。另外，在不同的生境中，AM真菌可能形成了不同的生态型以适应不同的环境。
2.4 DGGE条带测序及系统发育分析为了更全面地研究不同生境下黄檗AM真菌菌群结构，本试验将DGGE图谱中的全部条带进行回收。回收液直接用于PCR扩增，经检测，长度约为270 bp，与AM真菌18S rDNA的NS31/Glo1区序列大小一致。将其纯化后重新进行DGGE，经多次试验，最终选取了全部DGGE条带所对应的阳性克隆，测序结果见表 2。
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测序结果表明:所测序列片段长度约为234 bp，且测序结果与GenBank数据库中的已知菌种均具有较高的相似性，可以初步确定优势菌种的属。
2.4.1 林大地区黄檗菌根DGGE条带序列分析林大地区黄檗菌根DGGE条带比对结果显示:条带LG9所代表的菌群属于盾孢囊霉属(Scutellospora) AM真菌，它与该属的亮色盾巨孢囊霉(S.fulgida)相似性最高，达97%;LG1-LG8，LG10-LG14这13个DGGE条带代表的菌群均属于球囊霉属(Glomus) AM真菌，其中条带LG1所代表的菌群与缩球囊霉(G.constrictum)相似性达98%。其中，条带LG3和LG14比对结果均与Uncultured Glomus(EU152192)相似性最高，说明这2个条带所代表的菌种应归属同一菌种; 条带LG7和LG10比对结果均与Uncultured Glomus(AJ563862)相似性最高，归属同一菌种。经统计可知:林大地区黄檗菌根AM真菌菌种可初步归为12个不同的菌种。由测序结果可知:该地区黄檗根系AM真菌以球囊霉属为优势菌群。结合优势度分析结果可知:条带LG5所代表的菌群Uncultured Glomus(EU428762)为该地区黄檗根系AM真菌的优势种。
2.4.2 帽儿山地区黄檗菌根DGGE条带序列分析帽儿山地区黄檗菌根DGGE条带比对结果显示:条带MG8所代表的菌群属于多孢囊霉属(Diversispora) AM真菌; 条带MG11-1所代表的菌群与亮色盾巨孢囊霉(Scutellospora fulgida)相似性最高，达98%;条带MG13所代表的菌群与肉盘菌科(Sarcosomataceae)相似性达94%，该菌种不属于AM真菌，说明NS31/Glo1引物对也能扩增出非AM真菌，引物特异性有一定的缺陷; 条带MG1-MG7，MG9，MG10，MG11-2，MG12这11个DGGE条带代表的菌群均属于球囊霉属AM真菌。其中，序列MG6-1和MG6-2为条带MG6的2个阳性克隆测序结果，序列MG11-1和MG11-2为条带MG11的2个阳性克隆测序结果。由表 2可知:条带MG6虽然两个序列同属球囊霉属，但它们之间存在11个碱基差异，相似性为95%，而在MG11代表的菌群中含有2种不同种属的菌群，说明DGGE分离的单一条带中可能会含有不同的菌种。条带MG2和MG4比对结果都与Uncultured Glomus(DQ388618)相似性最高，说明这2个条带所代表的菌种应归属同一菌种; 条带MG6-2和MG7比对结果都与Uncultured Glomus(EU123442)相似性最高，归属同一菌种; 条带MG3和MG6-1比对结果都与Uncultured Glomus(AJ563899)相似性最高，归属于同一菌种。经统计可知:帽儿山地区黄檗菌根AM真菌菌种可归为11个不同的菌种。由测序结果可知:该地区黄檗根系AM真菌以球囊霉属为优势菌群。结合优势度分析结果可知:条带MG2所代表的菌群Uncultured Glomus(DQ388618)为该地区黄檗根系AM真菌的优势种。
2.4.3 凉水地区黄檗菌根DGGE条带序列分析凉水地区黄檗菌根DGGE条带比对结果显示:条带YG9所代表的菌群属于盾孢囊霉属AM真菌，它与该属的亮色盾巨孢囊霉相似性最高，达97%;YG1 -YG8，YG10这9个DGGE条带代表的菌群均属于球囊霉属。其中，条带YG2和YG6比对结果都与Uncultured Glomus(AJ563899)相似性最高，说明这2个条带所代表的菌种应归属同一菌种; 条带YG4和YG7比对结果都与Uncultured Glomus (AM946807)相似性最高，归属同一菌种。经统计可知:凉水地区黄檗菌根AM真菌菌种可归为8个不同的菌种。由测序结果可知:该地区黄檗根系AM真菌以球囊霉属为优势菌群。结合优势度分析结果可知:条带YG2所代表的菌群Uncultured Glomus(AJ563899)为该地区黄檗根系AM真菌的优势种。
在DGGE图谱(图 3)中处于同一水平位置的条带，经测序、比对，结果也不完全一致。条带LG2和MG2在GenBank数据库中比对结果相同，碱基序列一致; 条带LG9和YG9在GenBank数据库中比对结果相同，碱基序列一致; 而条带LG7和MG9在GenBank数据库中比对结果与测序长度完全相同，但序列有18个碱基的差异，说明LG7和MG9条带所代表的AM真菌可能不属于同一个种，但具有相同的迁移率。
虽然不同生境黄檗菌根DGGE图谱之间存在很大差异，但从测序结果来看，这3个样地均以球囊霉属为优势种群，并且初步分析都含有盾孢囊霉属的亮色盾巨孢囊霉，仅在帽儿山地区检测出多孢囊霉属AM真菌。林大、帽儿山和凉水地区黄檗菌根AM真菌菌种分别可归为12、11和8个不同的菌种。由此可见:林大地区AM真菌物种多样性最高，帽儿山次之，凉水地区AM真菌物种多样性最低。此结果与AM真菌侵染率和DGGE图谱分析结果相一致。
2.4.4 黄檗菌根DGGE条带系统发育分析用DNAMAN软件对目的序列与每条序列亲缘关系最近的已鉴定出来的微生物进行多序列比对，构建系统发育树，以显示目的序列与已知AM真菌之间的亲缘关系及其系统地位。从系统发育树图 5可以看出: DGGE图谱中的37条条带主要含有4类菌群，即球囊霉属、盾孢囊霉属、多孢囊霉属及肉盘菌科。测序序列LG9、YG9和MG11-1与数据库中盾孢囊霉属有较近的亲缘关系，同源性达99%，归为一族，命名为GroupⅠ; 测序序列MG8与数据库中多孢囊霉属同源性达98%，单列一族，命名为GroupⅡ。测序序列MG13与肉盘菌科同源性达94%，属同一分支，将其归为一族，命名为GroupⅣ。其他34条条带与数据库中球囊霉属亲缘关系很近，同源性达96%，归为一族，命名为Group Ⅲ。
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图 5 DGGE序列与其他近缘种的系统发育树 Fig.5 DGGE sequences and the phylogenetic tree of their closely related species (节点上的数字表示1 000自展后的数值) Bootstrap values (expressed as percentages of 1000 replications) are shown at branch-points. |
近年来，AM真菌菌群结构分析研究的分子技术主要是基于对AM真菌rDNA的序列分析，这种技术在AM真菌分子鉴定及群落研究等方面均取得很大的成功(Kowalchuk et al., 2002; Reddy et al., 2005)。目前，各种AM真菌特异性引物已被设计出来，用于扩增“功能基因”以进行PCR-DGGE分析(Sakurai et al., 2007)。
Simon等(1992)和Helgason等(1998)分别设计的引物NS31和AM1能够特异性扩增所有AM真菌种类。其中NS31是真核生物通用引物，AM1是AM真菌18S rDNA(SSU rDNA)的特异性扩增引物。Ma等(2005)和刘永俊等(2007)利用NS31-GC/AM1引物对的PCR产物，分别对不同样地土壤AM真菌群落和黄土沟壑柠条(Caragana korshinskii) AM真菌群落进行了DGGE分析，得到了较好的结果。但龙良鲲等(2005)利用该引物对始终未能得到清晰、重复性好的DGGE条带; 而通过利用NS31 -GC/Glol引物对进行第3轮PCR后得到了条带清晰DGGE图谱。推测其原因可能在于片段太大，不适合进行DGGE分析。DGGE技术一般要求目标片段在500 bp以下，且应为物种间可变区。此外，Daniell等(2001)和Redecker (2000)研究发现NS31/AM1引物对具有一定的缺陷，引物AM1不能扩增原囊霉科(Archaeosporaceae)和类球囊霉科(Paraglomaceae) 2个科的AM真菌; 其次，由于混合的DNA样品中含有部分非AM真菌以及宿主的基因组污染，这些非AM真菌模板在极高的退火温度下(65℃)也能与AM1/NS31引物对产生一定效率的非特异性扩增。利用该引物对进行研究时会得到许多子囊菌、担子菌等非AM真菌序列。
本文利用AM真菌的NS31/Glol区进行DGGE分析，经多次试验，得到了重复性较好的结果。所测得DGGE条带序列仅MG13所代表的菌群与肉盘菌科真菌相似性达94%，该菌种不属于AM真菌外，其他DGGE条带所代表的菌群均为AM真菌。该试验结果与接伟光(2008)通过对AM真菌DGGE条带测序显示NS31/Glo1引物对扩增出与病原微生物Hyponectria buxi的相似性很高的菌群的结果相似，说明NS31/Glo1引物对也能扩增出非AM真菌。近年来，各国科学家们试图设计更好的AM真菌特异性引物，但均未取得成功。从不同研究者的试验结果来看，引物对NS31/AM1虽然存在一定的缺陷，但仍然能够较为真实地反映出AM真菌菌群结构的变化，所以该引物对在AM真菌菌群结构研究中仍然广泛使用。如一些研究者利用这对引物同时结合其他的分子技术已对各种生态系统中的AM真菌群落进行了广泛研究，并得到了较理想的试验结果(Reddy et al., 2005; Ma et al., 2005)。
由于DGGE技术易造成对菌群结构多样性的过高或过低的估测，在某些情况下，可能会导致一个种类多于一条带的现象发生，因此不易鉴定群落结构到种的水平(刘永俊，2007)。DGGE技术能分离较小的片段(达500bp)，较长的片段分离率下降，这点限制了用于系统发育分析，所以本试验中由于一些条带序列信息量有限，测序后只能将其归于Glomus，而不能将其进一步分类。利用DGGE技术对于微生物菌群结构分析，尚停留在定性阶段，无法准确分析各类AM真菌的数量及各种AM真菌在该生态系统中所发挥的作用。但是，如果再辅以其他技术，将可以在一定程度上避免该技术所带来的缺陷，从而使该技术成为AM真菌群落研究中的有力工具。
| [] | 蔡柏岩, 葛菁萍, 接伟光, 等. 2009. 黄檗根围丛枝菌根真菌菌群结构分析. 菌物学报, 28(4): 512–520. |
| [] | 董秀丽, 赵斌. 2006. 嵌套多重PCR—研究田间植物部分丛枝菌根真菌和微生物区系的一个可行技术. 中国科学:生命科学版, 36(1): 59–65. |
| [] | 范继红, 杨国亭, 穆立蔷, 等. 2006. 接种丛枝菌根真菌对黄檗苗木主要3种生物碱含量的影响. 防护林科技(5): 24–26. |
| [] | 接伟光. 2008. 黄檗(Phellodendron amurense)丛枝菌根真菌鉴定及菌群结构分析. 黑龙江大学硕士学位论文. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10212-2008120424.htm |
| [] | 接伟光, 蔡柏岩, 葛菁萍, 等. 2007. 黄檗丛枝菌根真菌鉴定. 生物技术, 17(6): 32–35. |
| [] | 刘永俊. 2007. 黄土沟壑区柠条丛枝菌根生态学研究. 上海交通大学硕士学位论文. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10730-2007114865.htm |
| [] | 龙良鲲, 羊宋贞, 姚青, 等. 2005. AM真菌DNA的提取与PCRDGGE分析. 菌物学报, 24(4): 564–569. |
| [] | 魏薇. 2007. 利用DGGE技术研究黑龙江省各地沤麻系统中细菌多样性. 黑龙江大学硕士学位论文. http://d.wanfangdata.com.cn/Thesis/Y1125689 |
| [] | 阎秀峰. 2003. 药用木本植物的生态保护. 应用生态学报, 14(9): 1561–1564. |
| [] | Andrés P S, María Luisa S M, Andrés P P, et al. 2009. Arbuscular mycorrhizal fungi increased growth, nutrient uptake and tolerance to salinity in olive trees under nursery conditions. Journal of Plant Physiology, 166(13): 1350–1359. DOI:10.1016/j.jplph.2009.02.010 |
| [] | Bedini S, Avio L, Argese E, et al. 2007. Effects of long-term land use on arbuscular mycorrhizal fungi and glomalin-related soil protein. Agriculture, Ecosystems and Environment, 120: 463–466. DOI:10.1016/j.agee.2006.09.010 |
| [] | Comejo P, Azcón-Aguilar C, Barea J M, et al. 2004. Temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) as a tool for the characterization of arbuscular mycorrhizal fungi. FEMS Microbiology Letters, 241: 265–270. DOI:10.1016/j.femsle.2004.10.030 |
| [] | Daei G, Ardekani M R, Rejali F, et al. 2009. Alleviation of salinity stress on wheat yield, yield components, and nutrient uptake using arbuscular mycorrhizal fungi under field conditions. Journal of Plant Physiology, 166(6): 617–625. DOI:10.1016/j.jplph.2008.09.013 |
| [] | Daniell T J, Husband R, Fitter A H, et al. 2001. Molecular diversity of arbuscular mycorrhizal fungi colonising arable crops. FEMS Microbiology Ecology, 36: 203–209. DOI:10.1111/fem.2001.36.issue-2-3 |
| [] | Gyuricza V, Declerck S, Boulois H D. 2010. Arbuscular mycorrhizal fungi decrease radiocesium accumulation in Medicago truncatula. Journal of Environmental Radioactivity, 101(8): 591–596. DOI:10.1016/j.jenvrad.2010.03.004 |
| [] | Helgason T, Daniell T J, Husband R, et al. 1998. Ploughing up the wood-wideweb. Nature: 384–431. |
| [] | Kowalchuk G A, Souza F A, Vanveen J A. 2002. Community analysis of arbuscular mycorrhizal fungi associated withAmmophila arenaria in Dutch coastal sand dunes. Molecular Ecology, 11: 571–581. DOI:10.1046/j.0962-1083.2001.01457.x |
| [] | Ma W K, Siciliano S D, Germida J J. 2005. A PCR-DGGE method for detecting arbuscular mycorrhizal fungi in cultivated soils. Soil Biology and Biochemistry, 37: 1589–1597. DOI:10.1016/j.soilbio.2005.01.020 |
| [] | Michelini S. 1993. Relationships between environmental factors and levels of mycorrhizal infection of citrus on four islands in the EasternCaribbean. Tropical Agriculture, 70(20): 135–140. |
| [] | Reddy S R, Pindi P K, Reddy S M. 2005. Molecular methods for research on arbuscular mycorrhizal fungi in India:problems and prospects. Current Science, 89: 1699–1709. |
| [] | Redecker D, Morton J B, Bruns T D. 2000. Molecular phylogeny of the arbuscular mycorrhizal fungi Glomus sinuosum and Sclerocystis coremioides. Mycologia, 92(2): 282–285. DOI:10.2307/3761561 |
| [] | Sakurai M, Suzuki K, Onodera M, et al. 2007. Analysis of bacterial communities in soil by PCR-DGGE targeting protease genes. Soil Biology & Biochemistry, 39: 2777–2784. |
| [] | Schwarzott D, Schüβler A. 2001. A simple and reliable method for ssuRNA gene DNA extraction, amplification and cloning from single AM fungal spore. Mycorrhiza, 10: 203–207. DOI:10.1007/PL00009996 |
| [] | Simon L M, Lalonde T D, Bruns T D. 1992. Specific amplific of 18S fungal ribosomal genes fromvesicular-arbuscular endomycorrhizal fungi colonizing root. Applied and Environmental Microbiology, 58: 291–295. |
| [] | Taheri W I, Bever J D. 2010. Adaptation of plants and arbuscular mycorrhizal fungi to coal tailings in Indiana. Applied Soil Ecology, 45(3): 138–143. DOI:10.1016/j.apsoil.2010.03.004 |
| [] | Violi H A, Alejandro F, Wright S F, et al. 2008. Disturbance changes arbuscular mycorrhizal fungal phenology and soil glomalin concentrations but not fungal spore composition inmontane rainforests in Veracruz and Chiapas, Mexico. Forest Ecology and Management, 254: 276–290. DOI:10.1016/j.foreco.2007.08.016 |