栗疫病(Cryphonectria parasitica)是栗树(Castanea spp.)的重要病害之一，自1904年在美国首次发现后，已有百余年的研究历史。随着含有dsRNA的弱毒性菌株的发现，有关利用弱毒性菌株的生物防治研究很多，在意大利、法国和瑞士等欧洲国家栗疫病病菌的细胞融合系(vegetable compatibility group，VCG)相对单一，因此利用弱毒性菌株的生物防治取得了显著的防治效果(Heiniger et al., 1994)。用于栗疫病生物防治的弱毒性菌株，均含有可向强毒性菌株转化的dsRNA。与强毒性菌株相比，含有dsRNA的弱毒性菌株在菌丝生长、色素产生、孢子形成、草酸富集、胞内和胞外漆酶的活性等方面均有差异(Fulbright et al., 1984)。栗疫病菌弱毒性菌株快速、有效筛选、dsRNA及其稳定转化是生物防治的基础，本文通过菌落观察、dsRNA检测等筛选出2个弱毒性菌株，并进行细胞融合试验。

1 材料与方法 1.1 栗疫病菌弱毒性菌株的筛选

以弱毒性菌株KCP-22 (分离地: Hadong，Kyungnam Province，Korea)为对照，根据在PDA培养基上培养7天后的菌丝生长速度、分生孢子形成能力等培养特性，对60株栗疫病菌进行第1次筛选; 根据在Bavendamm培养基(pH4.5)上培养5天后的菌丝生长和菌落颜色等培养特性，进行第2次筛选。

1.2 dsRNA的检测

采用Hillman等(1990)方法提取dsRNA，用1%琼脂糖凝胶和TPE缓冲液电泳，按常规方法染色和脱色后照相。

1.3 dsRNA的转化试验

根据菌丝生长、产孢等培养性状和dsRNA的有无以及致病力测定等研究结果(Kim, et al., 1999)，选用具有dsRNA的弱致病力菌株KCP-22和供试强致病力菌株KCP-1 ~ 20(韩国国立山林科学院树病研究室保藏)进行细胞融合试验。在PDA培养基上放置玻璃纸，将弱致病力和强致病力菌株对峙培养2 ~ 7天(26 ℃)，根据菌丝交界处扇形(sector)菌丝的形成与否判断细胞融合的成功(Anagnostakis et al., 1979)。

2 结果与分析 2.1 栗疫病菌弱致病力菌株的筛选

在PDA培养基上，大部分致病力菌株形成黄色菌落、菌丝生长较快且产孢旺盛，而少部分菌株则形成白色菌丝，菌丝生长较缓慢且不产生分生孢子(图 1)。在Bavendamm培养基上，大部分致病力菌株的菌丝呈深褐色，而少部分菌株则呈介于褐色和黄色之间的颜色(图 2)。通过这一培养特性初步筛选出了2个弱致病力菌株，即菌株KCP-135 (分离地: Hadong，Kyungnam Province，Korea)和KCP-136 (分离地同KCP-135)。

2.2 弱毒性菌株的dsRNA检测

dsRNA的检测结果表明:筛选的栗疫病菌弱毒性菌株KCP-135和KCP-136中均检测到了dsRNA。与已有的弱毒性菌株KCP-22相比，菌株KCP-135和KCP-136少1个中等分子量的dsRNA分子，即有2个dsRNA分子，其分子量分别约为13.6和3.5 kb (图 3)。

2.3 dsRNA的转化试验

细胞融合试验表明:弱毒性菌株KCP-22和其他19个强毒性菌株之间的菌落形成明显的隔离带并沿着隔离带产生分生孢子，没有明显的细胞融合现象(图 4B); 而弱毒性菌株KCP-22和强毒性菌株KCP-9之间的菌落则相互交叉而形成扇形菌丝，呈现显著的细胞融合现象(图 4A)。弱毒性菌株KCP-22和强毒性菌株KCP-9的细胞融合菌株VC-9 (sector)的dsRNA和菌丝生长均有了一定的变化:即KCP-22菌株的3个dsRNA分子均全部转移到细胞融合菌株VC-9(sector)中，且细胞融合菌株中还检测到了在供体菌株中所没有的2个dsRNA分子(图 3); 在培养特性方面，VC-9菌株的生长速度均比KCP-22和KCP-9快，且呈灰白色，但不产孢(图 5)。

3 讨论

自60年代欧美发现栗疫病菌的弱致病力菌株后，在亚洲，中国和韩国分别于1992年和1999年有了首次报道(梁平彦等，1992; Kim et al., 1999)。尽管含有dsRNA的菌株不一定都表现为培养等特性异常的弱致病力菌株，相反弱致病力菌株也不一定都具有dsRNA，但通常具有dsRNA菌株的菌丝生长慢、产孢能力和致病力下降等弱致病性菌株特性且具有生物防治研究价值(王克荣等，1996)。本试验结果表明，根据培养特性筛选的菌株均含有dsRNA，说明这一初选方法是行之有效的。

对dsRNA分子本身来说，已发现的dsRNA种类较多，且其数量、分子量等均有较大差异(Paul et al., 1988)。其中有关CHV1-type dsRNA的研究较多，这一家族中有L-dsRNA (12.7 kb)、M-dsRNA (8 ~ 10 kb)和S-dsRNA(0.6 ~ 1.7 kb)等3个不同分子量的dsRNA(Choi et al., 1992)，研究认为大分子量的L-dsRNA是弱致病力的主要因子，M-dsRNA和S-dsRNA是L-dsRNA的缺失突变体(Rae et al., 1989; Shapira et al., 1991; 刘福秀等，2005a)，因此这3个dsRNA有同源性且结构也基本相似; 但也有没有同源关系的dsRNA，如菌株SR2中发现的dsRNA、菌株C18中发现的revirus-like dsRNA (Enebak et al., 1994)等。本试验中发现的dsRNA与CHV1型非常相似，其归属有待进一步研究。

dsRNA的转化基础是细胞融合，而菌株间细胞融合的发生频率和稳定性受多个vic (vegetative incompatibility)基因的调控。dsRNA的转化有2种方式，即从菌丝体转移到分生孢子的垂直方式和通过细胞融合转移的水平方式(Anagnostakis，1988)。其中，通过细胞融合从弱致病力菌株向强致病力菌株的dsRNA转化效率因供体菌和受体菌配对而不同(刘福秀等，2005b)。本试验中成功进行了弱致病力菌株和强致病力菌株间的细胞融合，且全部的dsRNA成功地转移到致病力菌株中，说明利用这一弱致病力菌株进行生物防治的可能性是存在的。但本试验中的转移并不稳定，多出的2个dsRNA分子，可能是dsRNA分子在转移过程中发生缺失变异造成的，其机制尚不清楚。据报道分别具有3个和2个dsRNA的弱致病力菌株GH2和RC1能同时向1个强致病力菌株发生稳定的转化，并从转化菌株中能检测出5个dsRNA; 但有些转化因受体菌株(recipeitstrain)的遗传背景不同而非常不稳定，在转化过程中dsRNA的种类和数量均发生较大的变异，如在转化后发现了供体细胞中所没有的大分子量dsRNA(Anagnostakis et al., 1979; 梁平彦等，1992; Kim et al., 1999)。说明细胞融合菌株不仅在dsRNA种类和数量方面，而且形态特性方面均有可能发生变异，其变异是影响生物防治稳定性的重要因素之一。说明决定dsRNA转化的细胞融合和转化中dsRNA结构变异机制都很复杂，认为同疫区病菌能进行细胞融合且具有较稳定转化特性的dsRNA的弱致病性菌株的筛选是生物防治成功与否的基础。