林业科学  2012, Vol. 48 Issue (9): 88-94   PDF    
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李冲伟, 杨立宾, 邓勋, IlanChet, 宋瑞清
Li Chongwei, Yang Libin, Deng Xun, Ilan Chet, Song Ruiqing
木霉菌株对金黄壳囊孢菌的抑菌效应及机制
Inhibiting Effects and Mechanism of Trichoderma Strains to Cytospora chrysosperma
林业科学, 2012, 48(9): 88-94.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(9): 88-94.

文章历史

收稿日期:2011-09-22
修回日期:2012-02-11

作者相关文章

李冲伟
杨立宾
邓勋
IlanChet
宋瑞清

木霉菌株对金黄壳囊孢菌的抑菌效应及机制
李冲伟1,2, 杨立宾1,3, 邓勋4, IlanChet5, 宋瑞清1    
1. 东北林业大学林学院 哈尔滨 150040;
2. 黑龙江大学生命科学学院微生物学高校重点实验室 哈尔滨 150080;
3. 黑龙江省农垦科学院 哈尔滨 150038;
4. 黑龙江省林业科学院森林保护研究所 哈尔滨 150040;
5. 以色列希伯来大学农学院 雷霍沃特 76100
摘要: 采用对峙培养法和生长速率法,从29个木霉菌株中筛选出3株对金黄壳囊孢菌具有显著抑制效果的菌株T-33,T-14,T-09,并对3个菌株的抑菌活性成分进行复筛确定T-33菌株培养液的正丁醇浸提物对金黄壳囊孢菌菌丝生长的抑制率最高,达到94%,并能显著抑制分生孢子萌发。该抑菌活性成分可显著提高金黄壳囊孢菌细胞膜的通透性,降低病原菌蛋白质含量和SDH,PK,HK,LDH,MDH与辅酶Ⅰ的活力,同时导致Na+,K+ -ATP酶,Mg2+ -ATP酶和Ca2+ -ATP酶活性急剧下降。结果表明:金黄壳囊孢菌细胞膜脂质过氧化严重,糖酵解途径、TCA循环、电子传递与氧化磷酸化过程等代谢途径均不能正常进行,产能下降。抑菌活性成分通过破坏病原菌的防护系统和代谢途径抑制其生长。
关键词:木霉    提取物    金黄壳囊孢菌    抑菌机制    
Inhibiting Effects and Mechanism of Trichoderma Strains to Cytospora chrysosperma
Li Chongwei1,2, Yang Libin1,3, Deng Xun4, Ilan Chet5, Song Ruiqing1    
1. College of Forestry, Northeast Forestry University Harbin 150040;
2. Key Laboratory of Microbiology, College of Life Sciences, Heilongjiang University Harbin 150080;
3. Heilongjiang Academy of Land Reclamation Sciences Harbin 150038;
4. Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy Harbin 150040;
5. Faculty of Agriculture, Hebrew University of Jerusalem Rehovot 76100 Israel
Abstract: Three Trichoderma strains, T-33, T-14, T-09, which have inhibiting effects on Cytospora chrysosperma, were derived from 29 domestic and foreign strains with methods of antagonistic culture and growth-inhibition.The extracts obviously inhibited mycelium growth and conidia germination of Cytospore chrysosperma were gained.The effect of the most highly efficient extract on pathogen's cell physiological indicators and protective enzyme activities was systematically studied.The growth-inhibiting rate of the substances extracted from the fermented liquid of strain T-33 was 94%, and the extract also had an inhibiting effect on spore germination.The extract was able to increase the electrical conductivity and MDA content of the pathogen significantly, reduce the protein content and activity of SDH, PK, HK, LDH, MDH, and coenzyme Ⅰ, and cause a sharp decline in Na+、K+ -ATP, Mg2+ -ATP and Ca2+ -ATP enzymes activities.The results indicated that the pathogen cell membrane would be severely peroxided, and some metabolic pathways such as glycolysis, TCA cycle, electron transport and oxidative phosphorylation, would be restricted.Finally, the extract inhibited pathogen growth by destroying the pathogen's protection system and metabolic pathways.
Key words: Trichoderma    extract    Cytospora chrysosperma    inhibiting mechanism    

随着杨树(Populus)栽植面积的扩大和管护工作的疏忽,由金黄壳囊孢菌(Cytospora chrysosperma)引起的杨树烂皮病呈现上升的势头(谷振泰,2008)。重灾区常有林木成片死亡的现象,严重制约了林木工业生产的发展(曾大鹏,2002)。目前,对杨树烂皮病防治工作除了加强栽培管理、适地适树外,及时清除病原菌、控制病原菌种群数量也是防治工作的重点。传统的化学药剂在抑制病原菌的同时,也杀死了树体有益的微生物,影响生物多样性系统的完整性,使病原菌产生抗药性,污染环境(高克祥等,2001)。探索高效、安全的防治措施是目前亟需解决的难题。研究发现:微生物发酵液提取物对杨树烂皮病菌具有抑制作用,向玉英(1986)证明Psuedomonas fluorcellsBacillus subtilisB.punilus对杨树烂皮病菌(C.chrysosperma)有显著拮抗作用,Trichoderma viride等木霉菌对杨树烂皮病菌的拮抗效果也较好。徐明等(2009)通过测定不同杀菌剂对杨树烂皮病菌菌丝生长和孢子萌发的抑制作用,筛选出了抑制杨树烂皮病菌的有效杀菌剂。孙冬梅等(2006)研究了黄绿木霉菌(Trichoderma aureoviride)代谢产物对杨树烂皮病菌的抑菌能力,认为50%的黄绿木霉菌代谢产物在121 ℃处理25 min抑菌作用可达100%。而有关这类抑菌物质的抑制机制目前还不清楚。

木霉菌(Trichoderma)作为自然界中资源丰富的拮抗微生物,因其抗菌谱广、适应性强等特点而被广泛应用。木霉菌竞争作用强,能迅速生长进行营养和空间位点的竞争; 能产生挥发性或非挥发性的抑菌物质,如木霉素、胶霉素、绿色木霉素和抗菌肽等。Dennis等(1971)报道木霉产生的一种挥发性乙醛对病原真菌具有抗性。Horace等(1986)研究表明:哈茨木霉防治立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)的主要机制之一是产生一种挥发性的抗生素,经鉴定为六戊烷基吡喃及戊烯基吡喃。Brukner等(1993)从长枝木霉及绿色木霉中分离提纯出一组特殊的抗菌肽,分别命名为长枝木霉素(trichobrachin)和绿木霉素(trichovirin),并测定了氨基酸序列。孙彩云等(2002)证实了木霉菌株SMF2的固体发酵液中存在抗生素,对防治姜瘟青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)取得了很好的效果。木霉菌产生的这些抗菌类物质,对生态环境破坏性小,在生物农药开发和生物防治中受到越来越多的重视(陈凯等,2007)。

本研究从国内外29个木霉菌株中筛选出对杨树烂皮病菌具有高效抑制作用的菌株,并提取抑菌活性物质(Park et al., 2005)。通过提取物对病原菌的抑制研究,从病原菌代谢途径的角度阐述了提取物的抑菌机制。上述结果将为抑菌活性物质构效关系的阐述和微生物农药的开发奠定理论基础。

1 材料与方法 1.1 试验材料

试验所用木霉菌株29株(表 1),其中,引进国外菌株7株、国内菌株22株。病原菌株为杨树烂皮病菌。菌株均保藏于东北林业大学森林病理实验室。

表 1 木霉菌株及其抑菌效果 Tab.1 Strains of Thichoderma spp.used in this experiment and their inhibiting effects

试验培养基为PDA和PD培养基。

1.2 试验方法 1.2.1 高效木霉菌株的筛选

通过木霉菌株及培养液对病原菌的抑制效果进行菌株筛选。1)木霉菌株对病原菌的拮抗作用  采用对峙培养法。在直径90 mm的PDA平板培养基上,相距30 mm先接入直径6 mm的病原菌菌饼,培养48 h后,在同一平板上接种直径6 mm的木霉菌饼,以PDA平板培养基中心接种直径6 mm的木霉菌饼和病原菌菌饼作为对照,每处理3个重复。于25 ℃生化培养箱中培养,每12 h观测菌落纵横半径。采用2菌落相向半径进行拮抗效果测定(Song et al., 2004)。

通过下列公式计算抑制效果:被抑制率=(单独培养菌落半径-菌落趋向半径)/单独培养菌落半径×100%;相对抑制效果=病原菌株被抑制率/拮抗菌株被抑制率。

2) 木霉菌培养液对病原菌的抑菌作用  采用生长速率法。取活化好的木霉菌饼3片,接入装有300 mL PD培养基的三角瓶(500 mL)中,160 r·min-1振荡培养5天。将培养液过滤后减压蒸发浓缩,以10%吐温80定容至25 mL。取浓缩液25 mL与100 mL 50 ℃ PDA培养基混合后倒平板,接种直径1 cm的病原菌菌饼,于25 ℃生化培养箱中培养,6天后测量菌落直径(冀瑞卿,2007)。抑制结果计算公式:抑菌率=(对照净生长量-处理净生长量)/对照净生长量×100%。

1.2.2 高效抑菌活性成分提取方法的筛选

高效菌株抑菌活性成分的提取采用水提和酯提2种方式。1)抑菌活性成分的提取  木霉菌株培养液的制备:用直径1 cm的无菌打孔器切取PDA平板培养基上培养3天的木霉菌饼,接种到300 mL PD培养基的三角瓶(500 mL)中,每瓶接种菌饼3片,于26 ℃、160 r·min-1摇床上培养5天,过滤,取上清液。

水提样品的制备:方法参照冀瑞卿(2007)

酯提样品的制备:选用石油醚、正己烷、乙酸乙酯、乙醚、氯仿、正丁醇6种有机溶剂作为萃取剂,以3: 1(V/V)比例常温浸泡木霉菌株培养液48 h,有机溶剂部分减压浓缩,以10%吐温80定容至25 mL。

2) 抑菌活性检测  提取物对病原菌菌丝体生长影响的检测采用生长速率法,对病原菌孢子萌发影响的检测采用改进的悬滴法(冀瑞卿,2007)。

改进的悬滴法:将样品液与病原菌孢子悬浮液各取200 μL加入到1.5 mL离心管中,置于25 ℃生化培养箱中培养,定时观察是否有菌丝团的出现,每处理5个重复。以10%吐温80作为对照。

1.2.3 高效提取物抑菌机制的研究

抑菌机制的研究主要从提取物对病原菌生理指标和代谢酶系统的影响2个方面进行。提取物能够抑制病原菌菌丝体的生长,必然是破坏了菌丝体正常的生理代谢途径,因此,应选择代谢途径中关键酶的变化来研究木霉菌株对金黄壳囊孢菌的抑制机制; 病原菌生理指标则选择电导率、丙二醛含量和蛋白质含量。

将PD培养基中培养5天产生直径约为2 cm的病原菌菌丝团洗净后置于20 mL含10%提取物的无菌水中,静置。分别于2,4,6,8,10,12,24,48 h后测定各项生理指标和代谢酶活性指标,以10%吐温80处理为空白对照(Bai et al., 2003)。

电导率采用电导率仪直接测定(马忠华等,1997)。丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法测定(张志良等,2003)。蛋白质含量采用考马斯亮蓝染色法测定(杨武英等,2005)。提取物对保护酶系统中SOD,CAT,POD活性的测定参照蒋继宏等(2005)方法; 对PPO和辅酶Ⅰ含量的测定,对糖酵解途径中HK,PK和LDH活性的测定,对TCA循环中SDH与MDH活性的测定,对ATP活性的测定,采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒(计红芳,2007; 王晓容等,2003)。

2 结果与分析 2.1 高效木霉菌株的筛选结果

从对峙培养60 h的试验结果可以看出:相对抑制效果较高的菌株有T-33(图 1)、T-14和T-09,分别为39.9,21.5和20.6;生长抑制率较高的菌株有T-33,T-14和T-15,分别为85.1% (图 2),83%和69.6% (表 1)。为此,将菌株T-33,T-14和T-09作为高效菌株进行下一步筛选。

图 1 T-33菌株与病原菌对峙培养(6 d) Fig.1 Antagonistic culture between strain T-33 and pathogen (6 d)
图 2 T-33菌株提取物对病原菌的抑制效果 Fig.2 Inhibiting effect of T-33 extract to pathogen
2.2 高效抑菌成分的筛选结果

3个高效菌株的不同有机溶剂提取物对病原菌菌丝生长和孢子萌发的抑制效果见表 2。菌株T-33正丁醇提取物对病原菌菌丝生长的抑制率最高,为94%;其次为菌株T-14乙酸乙酯提取物,抑制率为78%。T-33,T-14和T-09菌株的正丁醇提取物和T-14菌株的乙酸乙酯提取物对病原菌孢子萌发抑制效果显著。依据上述试验结果,选择T-33菌株的正丁醇提取物进行下一步研究。

表 2 不同提取物对病原菌菌丝体生长和孢子萌发的影响 Tab.2 Effects of the different extracts on pathogen's growth and spore germination
2.3 T-33菌株正丁醇提取物的抑菌机制 2.3.1 T-33菌株正丁醇提取物对病原菌电导率、丙二醛含量和蛋白质含量的影响

经T-33正丁醇提取物处理后,病原菌菌体的电导率显著提高(图 3)。从1 h开始,经提取物处理的菌丝体电导率的上升速度显著高于对照组,说明提取物对菌丝体细胞膜起到了显著的破坏作用。12 h二者电导率差异达到最高,处理组高出对照组100.4%。24 h后处理组的电导率趋于平稳,对照组则缓慢上升,处理组的电导率始终高于对照组。

图 3 提取物对电导率的影响 Fig.3 Effect of the extract on electrical conductivity

经提取物处理后,病原菌菌丝体的丙二醛含量显著提高(图 4a)。从2 h开始提取物处理组的丙二醛含量上升速度显著高于对照组,说明菌丝体膜脂过氧化严重。8 h二者丙二醛含量均达到最高值,处理组高出对照组18.28%。24 h后处理组和对照组的丙二醛含量差值趋于恒定,处理组始终高于对照组。

图 4 提取物对MDA含量(a)蛋白质含量(b)的影响 Fig.4 Effect of the extract on the MDA content (a) and protein content(b)

提取物处理组的蛋白质含量呈现显著的下降趋势(图 4b),对照组蛋白质含量呈现先升后降的缓慢变化。处理组蛋白质含量明显下降,说明提取物抑制了菌丝体蛋白质的合成或者导致菌丝体的蛋白质变性。

2.3.2 T-33菌株正丁醇提取物对病原菌代谢酶系统的影响

1) 对SOD,CAT,POD和PPO活性的影响  从图 5可以看出: SOD,CAT,POD和PPO 4种酶对提取物均比较敏感,都呈现出先上升后下降的趋势,这与蒋继宏等(2005)报道的相一致。这种变化趋势表明:菌体在提取物的逆境胁迫下,前期SOD,CAT,POD和PPO互相协调一致,呈现上升趋势,以发挥它们对菌体的保护作用,后期由于氧自由基的增加和膜脂过氧化的加重,细胞透性增加,蛋白质变性严重,最终导致各种酶含量的降低或消失。

图 5 提取物对SOD,CAT,POD和PPO酶活力的影响 Fig.5 Effect of the extract on the enzyme activity of SOD, CAT, POD and PPO

2) 对己糖激酶(HK)和丙酮酸激酶(PK)活性的影响  己糖激酶(HK)是一种调节酶,具有调节糖酵解途径的作用,催化葡萄糖形成6-P-葡萄糖。丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途径中的一个重要变构调节酶,催化磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸并产生1个ATP分子。试验结果显示:对照组HK与PK酶活性随时间的增长而持续上升,提取物处理组HK与PK酶活性随处理时间的增长始终呈下降趋势(图 6ab)。从4 h开始对照组和处理组呈现出显著差异,24 h处理组HK与PK酶活性分别低于对照84.8%和94.9%,48 h处理组HK与PK酶活性分别低于对照组91.6%和99.2%。

图 6 提取物对HK,PK,LDH和SDH酶活力的影响 Fig.6 Effect of the extract on the enzyme activity of HK, PK, LDH and SDH

3) 对乳酸脱氢酶(LDH)活性的影响  乳酸脱氢酶(LDH)广泛存在于动物、植物和微生物中,是糖酵解中生物氧化的关键酶类,是生物均具有的产能方式。试验结果显示:对照组菌丝体乳酸脱氢酶活性基本无变化,细胞能够维持菌体正常的活动,而提取物处理组LDH活性显著下降,说明提取物严重干扰了菌体细胞的糖酵解途径(图 6c)。

4) 对SDH与MDH活性的影响  TCA循环是生物细胞中十分重要的有氧分解代谢途径,它不仅供给生物体能量,而且还是糖、脂、蛋白质3大物质转化的枢纽。琥珀酸脱氢酶SDH与苹果酸脱氢酶MDH是三羧酸循环中2个重要的氧化还原酶,这2种酶是细胞生长代谢和繁殖所必需的,它们直接影响整个TCA循环能否顺利地运转。试验结果显示:对照组病原菌菌丝体细胞的SDH与MDH酶活随时间的延长而呈现持续上升的趋势,而处理组SDH与MDH酶活随处理时间的延长下降速度越来越快,处理12 h其活性几乎接近于零(图 6d图 7),说明病原菌菌丝体细胞的SDH与MDH的酶活受到了提取物的抑制和破坏,导致整个TCA循环的停滞。

图 7 提取物对MDH活力的影响 Fig.7 Effect of the extract on the activity of MDH

5) 对辅酶Ⅰ活性的影响  辅酶Ⅰ是多种脱氢酶的辅酶,参与机体中许多生物氧化过程,它的含量可以反映出细胞的氧化还原状态。从图 8可知:对照组辅酶Ⅰ含量在试验时间内呈上升趋势,表明菌体代谢基本正常; 提取物处理组辅酶Ⅰ含量呈现下降趋势,12 h时几乎接近零,与对照相比差异显著。表明处理组的菌体中,以NAD为辅酶的脱氢酶,氧化还原反应不能正常进行,菌体代谢势必出现紊乱。

图 8 提取物对辅酶Ⅰ含量的影响 Fig.8 Effect of the extract on Coenzyme Ⅰ content

6) 对ATP酶活性的影响  ATP酶是一种转运细胞膜内外多种离子的酶,在物质运送、能量转换,以及信息传递方面具有重要作用,生物体在逆境状态下,该酶活性会发生明显的改变。由图 9可知:对照组Na+、K+ -ATP酶、Mg2+ -ATP和Ca2+ -ATP酶的活性始终呈现上升趋势,24 h时基本达到最高值,表明对照组菌体各种合成代谢与分解代谢基本正常。提取物处理组Na+、K+ -ATP酶、Mg2+ -ATP和Ca2+ -ATP酶的含量呈现先上升后急剧下降趋势,8 h时含量达到最高值,此时的酶活性均高于对照。此后3种ATP酶的活力受提取物影响急剧下降,菌体细胞膜的物质和能量转运势必停滞,从而影响细胞的正常生理活动。

图 9 提取物对Na+,K+,Mg2+,Ca2+ -ATP酶活的影响 Fig.9 Effect of the extract on Na+, K+, Mg2+, Ca2+ -ATP enzyme activity
3 结论与讨论

从29个木霉菌株中筛选出对杨树烂皮病菌具有高效抑制效果的菌株T-33,该菌株培养液的正丁醇提取物对杨树烂皮病病原菌菌丝体生长的抑菌率最高,为94%,并能够抑制孢子萌发。该提取物可显著提高病原菌菌丝体的电导率和MDA含量,降低病原菌蛋白质含量,降低病原菌菌体的SDH,PK,HK,LDH,MDH与辅酶Ⅰ的活性,使Na+,K+ -ATP酶,Mg2+ -ATP和Ca2+ -ATP酶的活性急剧下降。菌丝体电导率的提高表明病原菌细胞膜的通透性明显上升,而MDA含量显著增加,表明细胞膜脂质过氧化加重。菌体的SDH,PK,HK,LDH,MDH与辅酶Ⅰ含量的活力与对照组相比均处于相对较低水平,表明提取物的处理导致糖酵解途径、TCA循环、电子传递与氧化磷酸化过程均不能正常进行,ATP合成受阻,产能下降,而Na+、K+ -ATP酶、Mg2+ -ATP和Ca2+ -ATP酶的活性在8 h后急剧下降,细胞内外离子转运受阻,从而破坏了糖、脂类与蛋白质相互间的代谢平衡。

马忠华等(1997)曾报道:菌丝体内MDA含量大幅度升高和麦角甾醇含量的降低,表明膜脂过氧化严重。左斌等(2005)报道:植物激活蛋白打破了保护酶系统原有的动态平衡状态,导致生物体代谢紊乱,植物细胞内保护酶失活,最终导致死亡。冀瑞卿等(2007)研究了毒蘑菇活性成分对杨树烂皮病的影响,测定了病原菌体内自身保护相关酶系的变化。朱天辉等(1994)研究哈茨木霉菌(T. harzianum)对立枯丝核菌的抗生现象时发现,FO60菌株产生的非挥发性代谢产物能抑制立枯丝核菌的生长和菌丝干物质的积累,这些代谢物可以破坏病原真菌菌丝的细胞壁和细胞膜,使细胞内物质外渗,引起立枯丝核菌菌丝原生质凝聚、菌丝断裂解体。这些相关酶的变化与本试验的结果基本是一致的,这说明病原菌体受到外界干扰后,通过信号传输导致自身酶系发生趋向本能的自我保护,外界干扰导致的自身保护酶系统的改变基本上是一致的。本文研究了木霉提取物对杨树烂皮病菌的抑菌作用,通过代谢过程中几种酶的变化探讨了提取物抑菌活性成分的抑菌机制。木霉菌株抑菌活性成分对杨树烂皮病菌抑菌机制的研究在国内尚属首次报道。

木霉菌株培养液中的抑菌成分有抗菌肽类、抗生素类和挥发性物质,这已经得到证实,但是对于各物质的结构目前还不是很清楚。近期课题组在木霉菌株培养液挥发性物质的研究中发现了具有抑菌作用的烷烯基酸酯类成分,该研究成果将另文后续报道。

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