林业科学  2012, Vol. 48 Issue (9): 82-87   PDF    
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鄢杰明, 钟华, 严俊鑫, 严善春
Yan Jieming, Zhong Hua, Yan Junxin, Yan Shanchun
多杀菌素对舞毒蛾幼虫解毒酶活性的影响
Effect of Spinosad to Detoxifying Enzymes Activity in Lymantria dispar Larva
林业科学, 2012, 48(9): 82-87.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(9): 82-87.

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收稿日期:2011-01-19
修回日期:2012-02-17

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鄢杰明
钟华
严俊鑫
严善春

多杀菌素对舞毒蛾幼虫解毒酶活性的影响
鄢杰明, 钟华, 严俊鑫, 严善春    
东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室 哈尔滨 150040
摘要: 为了研究多杀菌素对森林害虫舞毒蛾的杀虫活性,采用叶片药膜法测定多杀菌素对舞毒蛾3龄和5龄幼虫的生物活性及致死中量对其体内解毒酶活性的影响。结果表明:多杀菌素24 h致死中浓度(LC50)分别为0.024 9 mg·L-1 (3龄)和0.226 9 mg·L-1 (5龄); 致死中量多杀菌素对舞毒蛾3龄和5龄幼虫体内解毒酶存在不同程度的影响,其中对羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、多功能氧化酶(MFO)和碱性磷酸酯酶(ALP)大体上均表现为先激活后抑制作用,差异显著(P<0.05);而对酸性磷酸酯酶表现为抑制-激活-抑制作用,差异极显著(P<0.01)。LC10和LC50剂量的多杀菌素对舞毒蛾3龄幼虫的发育历期无显著影响,但能显著降低幼虫成活率及化蛹率(P<0.05)。多杀菌素对舞毒蛾有较强杀虫活性,能够有效影响舞毒蛾的生化指标,干扰其正常的生长发育,可以作为防治舞毒蛾的安全有效药剂。
关键词:多杀菌素    舞毒蛾    解毒酶    
Effect of Spinosad to Detoxifying Enzymes Activity in Lymantria dispar Larva
Yan Jieming, Zhong Hua, Yan Junxin, Yan Shanchun    
State Key Laboratory of Forest Genetics and Tree Breeding Northeast Forestry University Harbin 150040
Abstract: In order to study insecticidal activity of spinosad against Lymantria dispar, bioactivity and LC50 of spinosad against the 3rd and 5th instar larva of L.dispar and its effect on activities of the detoxifying enzymes were assayed in this study.The results showed that LC50 of spinosad in 24 h was 0.024 9 mg·L-1 against 3rd instar larva and 0.226 9 mg·L-1 against 5th instar larva.Spinosad had various effects on activities of the detoxifying enzymes under the LC50 treatment. Carboxylesterase (CarE), glutathione-S-transferase (GST), multi-function oxidase (MFO) and alkaline phosphatase (ALP) were firstly significantly increased and then decreased (P < 0.05);But for acid phosphatase (ACP), the change pattern in activity were decreased-increased-decreased, and the variation was significant (P < 0.01).The development duration of the larva treated with LC10 and LC50 of spinosad was not significantly different from control, but the larval survival rate and pupation rate were significantly lower than control (P < 0.05).The result indicated that the biochemical indexes of L.dispar were affected by spinosad.Therefore, spinosad is a safe and effective pesticide for L.dispar.
Key words: spinosad    Lymantria dispar    detoxifying enzymes    

舞毒蛾(Lymantria dispar)是世界性的害虫,根据其地理分布、生物学习性和形态特征,现在被分为亚洲型舞毒蛾和欧洲型舞毒蛾。亚洲型舞毒蛾主要分布在亚洲和部分欧洲地区,雌成虫能飞行,可危害约500种寄主植物。欧洲型舞毒蛾分布于欧洲和美国,雌成虫不能飞行,危害约250种寄主植物(钱天荣,2000)。由于亚洲型舞毒蛾成虫具飞行能力且寄主范围比欧洲型大等原因,美国认为亚洲型舞毒蛾比欧洲型舞毒蛾对其威胁更大,近年来先后致函中国政府并多次交涉,准备对来自中国相关港口的船舶也实施特别检疫措施(卢小雨等,2009),这必将对我国产品的出口贸易造成严重影响。

目前我国防治舞毒蛾的传统方法包括人工防治和药物防治2种。人工防治一般为在秋、冬或早春刮卵块,但是因稍微不仔细便会有不少卵块散落而效果不佳。药物防治一般是在幼虫未扩散前喷洒西维西、敌百虫等药剂,这类药剂虽然效果不错,但是防治效果缓慢且对环境的影响较大(张松,2006)。因此,寻找新的环境友好杀虫剂迫在眉睫。

多杀菌素(spinosad)是由土壤放线菌—刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)经有氧发酵产生的胞内次级代谢产物,以spinosy A和spinosy D为主要成分。从结构上看,属于大环内酯类化合物; 从外观上看为浅灰白色固体结晶。多杀菌素能够有效地防治鳞翅目、双翅目和缨翅目害虫,同时对鞘翅目和直翅目等某些特定种类的害虫显示出一定的防治效果,在对靶标生物有着高度选择活性的同时,多杀菌素对非靶标生物显示出优良的安全性。研究表明:多杀菌素对哺乳动物和鸟类相对低毒,对水生动物也只是轻微的中等毒性。同时,与传统药剂相比,多杀菌素对许多有益昆虫也具有很高的安全阈值,被美国环境保护署划分为低风险类化合物(Wang et al., 2009; Gary et al., 2000),目前已用于防治多种农作物害虫(Vayas et al., 2009)。多杀菌素主要作用于昆虫烟碱型乙酰胆碱受体,对昆虫存在快速触杀和摄食毒性,通过刺激昆虫的神经系统导致非功能性的肌肉收缩、衰竭,并伴随颤抖和麻痹,对鳞翅目及双翅目害虫均有良好的防治效果(Watson et al., 2001; 王东等,2009a)。本文以舞毒蛾为对象,从生化水平探讨了亚致死浓度多杀菌素对舞毒蛾的生物活性,为该药剂对舞毒蛾的防治研究提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

舞毒蛾卵于2010年3月采自东北林业大学示范林场,该地未使用任何药剂防治。将采回的卵在恒温养虫箱内孵化,幼虫采用中国林业科学研究院提供的饲料饲养,每天观察并更换新配制饲料,及时清理幼虫的排泄物和食物残渣。恒温饲养条件:温度(25 ± 1) ℃,相对湿度60% ~ 80%,光周期16L:8D。

1.2 毒力测定

参照Zhao等(2002)叶片药膜法。用清水将2.5 mg·L-1多杀菌素悬浮剂稀释成浓度梯度,其中3龄幼虫选用的浓度为0.000 002 5,0.000 025,0.000 25,0.002 5,0.025,0.25,2.5 mg·L-1; 5龄幼虫选用的浓度为0.002 5,0.005,0.025,0.05,0.25,0.5,2.5 mg·L-1; 以清水作对照。将未接触过药剂的白桦(Betula platyphyla)叶片在稀释好的药液中浸10 s后取出后阴干。用蘸有充足水分的脱脂棉裹住叶柄,放入透明培养皿中,然后分别接入大小一致的饥饿12 h的舞毒蛾3龄和5龄幼虫,每皿各放入10头,各种浓度均重复3次。置于恒温养虫室内饲养,分别于6,12,24 h后检查死亡数。虫体蜷曲僵硬,无法翻身,用毛笔轻触无反应或不能活动的视为死亡。

1.3 解毒酶活性测定 1.3.1 试虫处理

根据毒力测定结果,用LC50剂量多杀菌素处理白桦叶片,饲喂健康、大小一致,且饥饿12 h的3龄和5龄幼虫,其中3龄幼虫每培养皿放15头,5龄幼虫放10头,处理方法和饲养条件同上,以清水作对照。分别于处理后3,6,12和24 h取活试虫,储存于-80 ℃冰箱用于制备酶液。

1.3.2 活性测定

从-80 ℃超低温冰箱中取出不同处理的舞毒蛾3龄与5龄幼虫,解冻,经缓冲液漂洗后,置于玻璃匀浆器中,匀浆2 ~ 3 min(冰浴),制备酶液。其中羧酸酯酶(CarE)酶液制备和活性测定参考Van Asperen(1962)郭庆龙(2007)方法略加修改,将原酶液稀释50倍用于试验; 谷胱甘肽S-转移酶(GST)酶液制备和活性测定参照Booth(1961)郭庆龙(2007)方法略加修改,将原酶液稀释10倍用于试验,反应体系中加入2.5 mL 0.066 mol·L-1、pH7.0磷酸缓冲液和0.1 mL酶液; 多功能氧化酶O-脱甲基酶液制备和活性测定参考Hansen等(1971)王建军等(2009)方法。磷酸酯酶参照Bessey(1946)的方法并略作修改,将原酶液稀释50倍用于试验。每个处理均重复3次。蛋白质含量测定采用Bradford (1976)的考马斯亮蓝G-250法。

1.4 亚致死浓度多杀菌素对舞毒蛾发育指标的影响

采用LC10和LC50剂量多杀菌素处理白桦叶片,饲喂健康、大小一致,且饥饿12 h的3龄幼虫,24 h后将其转移到饲料盒中继续喂养。每饲料盒放1头,以清水为对照,每处理10头试虫,重复3次。3龄幼虫从4龄开始记录各龄幼虫的龄期,整个过程中每12 h观察1次,直到成虫死亡,最后统计各龄期幼虫的幼虫历期、化蛹率、蛹期、成虫寿命等。龄期确定以蜕皮为判定标准,2次蜕皮之间的天数为该龄龄期。定期更换饲料以供试虫取食。

1.4 数据统计分析

用POLO软件处理分析毒力测定结果,计算致死中浓度(LC50)及其95%置信区间; 采用SPSS 18.0软件进行方差分析,差异显著性检验采用LSD方法,显著水平为α = 0.05或α = 0.01。

2 结果与分析 2.1 多杀菌素对舞毒蛾幼虫毒力测定

根据毒力测定结果,多杀菌素对舞毒蛾幼虫不同龄期的致死中浓度(LC50)及其95%置信区间见表 1。从表 1可以看出:多杀菌素对舞毒蛾幼虫表现出较高的活性,3龄幼虫对药剂十分敏感。舞毒蛾幼虫龄期增长,所需药量增加,但是随着处理时间的延长,LC50逐渐降低。本试验选择处理24 h LC50作为试验剂量处理舞毒蛾3,5龄幼虫(LC50分别为0.024和0.226 mg·L-1),来测定多杀菌素对其体内解毒酶活性的影响。

表 1 多杀菌素对舞毒蛾幼虫的毒性 Tab.1 The toxicity of spinosad to the larvae of L.dispar
2.2 多杀菌素对舞毒蛾幼虫解毒酶活性的影响 2.2.1 对3龄幼虫体内解毒酶活性的影响

多杀菌素对舞毒蛾3龄幼虫体内解毒酶存在明显影响。从图 2可以看出:多杀菌素对舞毒蛾3龄幼虫体内羧酸酯酶、谷胱甘肽S-转移酶、多功能氧化酶O -脱甲基和碱性磷酸酯酶具有先激活后抑制的作用,在处理后3 h,对羧酸酯酶和碱性磷酸酯酶的激活作用最强,分别为同期对照的1.742,1.210倍; 处理6 h,对谷胱甘肽S-转移酶和多功能氧化酶O-脱甲基激活作用最强,为同期对照的1.300,3.128倍; 4种酶在激活作用达到最高后活性均有不同程度降低,且差异均极显著(P<0.01),说明多杀菌素短期处理,对这4种酶均有明显的激活作用,但随着该药剂在幼虫体内富集量的增大,酶活性逐渐被抑制,且多杀菌素对这4种酶的影响存在明显的时间差异。舞毒蛾3龄幼虫经多杀菌素处理后,其酸性磷酸酯酶呈“降低—升高—降低”的曲线状波动:处理6 h,酸性磷酸酯酶的活性被抑制到最低,仅为同期对照的0.672倍,差异极显著(P<0.01);处理12 h,酸性磷酸酯酶的活性有所增大,为同期对照的1.155倍; 至24 h,活性再次被抑制,为同期对照的0.828倍,差异极显著(P<0.01)。说明多杀菌素对酸性磷酸酯酶有先抑制再激活的作用。

图 2 不同处理时间多杀菌素对舞毒蛾3龄幼虫解毒酶活性的影响 Fig.2 Effect of spinosad on detoxifying enzymes activity in the 3nd instar larva of L.dispar at different time after treatment ①*和**分别表示同一处理时间内,处理与对照之间经LSD检验差异显著(P<0.05)或极显著(P<0.01);不同小写字母表示不同处理时间之间差异显著(LSD检验,P<0.05);下同。 The data are given as Mean ± SE; Ratio = Treatment/CK; * and ** denote significant different at P < 0.05 and P < 0.01 compared with the control at the same processing time; Different letters in the same column indicate significant difference at different processing time (LSD test, P < 0.05);the same below.
2.2.2 对5龄幼虫体内解毒酶活性的影响

图 3可以看出:舞毒蛾5龄幼虫经多杀菌素处理后3 h时,羧酸酯酶与多功能氧化酶O-脱甲基活性明显被激活,处理组为同期对照的1.615,1.249倍; 从6 h起,后者活性被明显抑制; 至24 h,处理组活性仅为同期对照的0.392倍,差异极显著(P<0.01);前者自12 h起,酶活性被明显抑制,至24 h,处理组为同期对照的0.798倍,与对照组相比差异极显著(P<0.01)。处理3 h,谷胱甘肽S-转移酶和碱性磷酸酯酶活性均明显被激活,6 h后,这2种酶活性逐渐被抑制,12 h时达最低,处理组分别为同期对照的0.784,0.800倍,且2种均在处理24 h时,酶活性有所上升,与同期对照差异不显著。多杀菌素处理舞毒蛾5龄幼虫体内的酸性磷酸酯酶呈“降低-升高-降低”的曲线状波动:处理后3 h酶活性为同期对照的0.752倍,差异极显著(P<0.01);后酶活逐渐增强,12 h时达到最高,为同期对照的1.163倍; 至24 h,酶活性再次减弱,仅为同期对照的0.528倍,差异极显著(P<0.01)。说明多杀菌素对5龄幼虫体内这5种酶均具有先激活后抑制作用,且对这5种酶的影响也存在明显的时间差异。

图 3 不同处理时间多杀菌素对舞毒蛾5龄幼虫解毒酶活性的影响 Fig.3 Effect of spinosad on detoxifying enzymes activity in the 5th instar larva of L.dispar at different time after treatment
2.3 亚致死浓度多杀菌素对舞毒蛾幼虫生长发育指标的影响

从表 4看出:亚致死剂量多杀菌素处理舞毒蛾3龄幼虫后,试虫的成活率及化蛹率显著低于对照,但各发育历期对照相比无明显差异。其中LC10处理的幼虫在化蛹前全部死亡; 而LC50处理的幼虫在6龄前全部死亡。各龄期的平均成活率,CK>LC10>LC50,LC50致死效果明显高于LC10

表 2 亚致死浓度的多杀菌素处理3龄幼虫对舞毒蛾发育指标的影响 Tab.2 Effects of the 3rd instar larvae treated with sublethal concentration of spinosad to hymenium development of L.dispar
3 讨论

杀虫剂进入虫体内,在到达靶标起作用之前,首先受到体内非靶标组织的竞争,在虫体内主要表现为解毒酶系对杀虫剂的代谢能力(王东等,2009b)。代谢杀虫剂的解毒酶一般是使进入体内的有毒化学物质经过氧化、还原、水解或结合后,降低毒性,增强水溶性,使之易于排出体外,从而达到解毒的目的(赵宇,2008)。昆虫体内主要的解毒酶包括各种酯酶(羧酸酯酶、磷酸酯酶等)、谷胱甘肽S-转移酶及微粒体多功能氧化酶系(张晓燕,2010)。

CarE主要通过代谢体内某些内源及外来有害物质,使其分解,排出体外,从而达到解毒的目的。(尹显慧等,2008)研究发现小菜蛾(Plutella xylostell)不同处理在不同时间段CarE活性变动较大,在处理后72 h内,有升高、有抑制。而MFO的底物广泛,能够参与各种类型杀虫剂的解毒作用,其中O-脱甲基酶作用是多功能氧化酶代谢杀虫剂的重要途径之一。(魏辉等2006)研究了多杀菌素亚致死浓度LC20,LC50处理小菜蛾后36 h内的M FO活力变化动态,发现酶活力随时间变化趋势与对照相似,但低于对照。GST是对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系,参与许多分子的解毒机制。魏波等(2006)采用4种杀虫剂的LC50剂量处理棉铃虫(Helicovera amigera)后的144 h内,幼虫GST活性变化规律与对照有一定差异,昆虫在杀虫药剂刺激一段时间后,其中GST处于动态的调整之中(Watson,2001)。但是Mo等(2006)曾报道甜菜夜蛾(Spodoptera exigusa)对多杀菌素抗性和敏感种群3龄幼虫的GST活性影响无差异,说明多杀菌素对不同种类昆虫及昆虫不同发育龄期GST的活性影响是不同的。

与上述研究做比较,本研究得出了相似的结果。研究发现多杀菌素处理不同龄期舞毒蛾幼虫其羧酸酯酶、多功能氧化酶与谷胱甘肽-转移酶活性均呈先升高后降低趋势,在3 ~ 6 h时诱导作用表现为最强,随后逐渐被抑制。这也与亚致死浓度多杀菌素可诱导西花蓟马(Frankliniella occidentalis)虫体内羧酸酯酶的活性,其对小菜蛾的多功能氧化酶具有先诱导后抑制作用,脱氧鬼臼毒素对谷胱甘肽S-转移酶具有明显的激活作用等具有一致性(龚佑辉等,2009; Yin et al., 2008; 马燕等,2010)。这些变化都表明多杀菌素参与试虫体内水解代谢,或作为外源物刺激昆虫使其增强了水解代谢。值得注意的是,羧酸酯酶较另外2种酶被激活的时间短,原因是羧酸酯酶被看作是代谢活性前体药物的主要酶(张晓燕,2010)。

酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶是昆虫体内重要的代谢酶,可参与多种生化反应,在昆虫生长发育及对外源毒物的解毒代谢方面均具有重要的作用,其在中肠中活性最高(Senthil et al., 2005)。植物源杀虫剂例如铿木三萜(dysoxylum triterpenes)和蕨内酯(beddomei lactone)可抑制稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)中肠内的2种磷酸酯酶的活性,而用多杀菌素处理害虫后2种磷酸酯酶的变化未见报道(Nathan et al., 2007)。本研究中,多杀菌素对舞毒蛾幼虫体内的酸性磷酸酯酶和碱性磷酸酯酶分别表现出抑制-激活-抑制和先激活后抑制的趋势,亦表明2种磷酸酯酶参与了舞毒蛾幼虫的解毒代谢。

从幼虫行为观察到:药剂处理3 h后,舞毒蛾幼虫即出现身体僵硬、爬行不稳、无法翻身、头尾抱成一团等中毒症状,而且在24 h时几种解毒酶的活性均被完全抑制,这说明舞毒蛾幼虫体内的解毒作用被中断。鄢杰明等(2010)研究发现利用甲氧虫酰肼处理舞毒蛾5龄幼虫,其解毒酶在48 h后被显著抑制,而多杀菌素与之相比表现出较强的速效性和杀虫活性,这可能与多杀菌素作用于昆虫神经系统的乙酰胆碱受体有关,使受试昆虫在短时间内既表现出中毒症状(王光峰等,2003)。生长发育指标试验结果表明:低剂量多杀菌素能够影响舞毒蛾幼虫的成活率和化蛹率,这与王光峰(2003)研究多杀菌素处理甜菜夜蛾后幼虫的存活率及化蛹率显著降低的结果一致。因此,多杀菌素可以取代高毒农药,作为防治舞毒蛾的安全、有效药剂。

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