大花黄牡丹(Paeonia ludlowii)为芍药科芍药属牡丹组的多年生灌木，是我国西藏特有的重要药用及观赏植物(Hong，1997)，被《中国物种红色名录》 (第一卷)列为极危物种(汪松等，2004)。种子繁殖是大花黄牡丹的唯一繁殖途径(成仿云等，1997; 邢震等，2007)。在自然条件下，结实植株仅20%左右，生根成活率仅10%左右，且幼苗死亡率极高，天然更新的巨大障碍是造成大花黄牡丹极危的重要因素之一(杨小林等，2006; 2007; 张蕾，2008; 赵仕虎等，2007; 周生军等，2009)。因此，对大花黄牡丹种子萌发特性进行研究具重要意义，而国内外对此研究极少。

牡丹组植物种子具休眠特性，包括上胚轴及下胚轴休眠，且上胚轴休眠更为突出(刘心民等，2005; 曾端香等，2000)。周仁超等(2002)对牡丹种子休眠解除的研究表明:不同种类种子休眠解除所需条件不同，如500 mg·L^-1赤霉素(GA₃)处理能显著加快紫斑牡丹(Paeonia rockii)生根速度，提高生根率，但200 mg·L^-1以下GA₃处理已生根种子却不能打破其上胚轴休眠; 相反，包括GA₃在内的各种理化处理均不能使栽培牡丹(Paeonia suffruticosa)种子提早萌发，但以100 mg·L^-1 GA₃处理根长3 cm以上的生根种子却能打破上胚轴休眠(景新明等，1995); 对滇牡丹(Paeonia delavayi)的研究结果表明:以200 mg·L^-1 GA₃溶液浸泡24 h、挫伤种脐处种皮和50 ℃温水浸种3种处理方法对胚根的生长都有促进作用，GA₃溶液浸泡也能打破上胚轴休眠(娄方芳等，2007)。

对大花黄牡丹种子萌发特性的研究仅见赵仕虎等(2007)的报道。该研究采用随采随播方式，于8月采种后以GA₃、乙醇、机械破皮、沙藏处理后直接播种于大田，以不作处理为对照，种子于第2年3月开始出苗，所有处理从出苗开始至出苗结束历时16 ~ 25天，整个过程历时7个月左右，以GA₃ 500 mg·L^-1处理后播种的效果最好，出苗率达91%，而对照出苗率也达77%。这与其他牡丹上胚轴有较长时间休眠有较大差异，且该研究未对播种后下胚轴萌生时间进行观察，也未对上胚轴休眠解除条件进行试验。

本文以自然风干3个月的大花黄牡丹饱满种子为材料，对其种子萌发特性及不同处理的休眠解除进行了系统研究，旨在为进一步揭示大花黄牡丹种子休眠机制提供更多理论依据，为大花黄牡丹的保护及规模化高效快捷育苗提供技术支撑。

1 材料与方法 1.1 材料

大花黄牡丹种子2008年9月采自西藏灵芝县、米林县，采后晾干混装于布袋，室内保存，12月底寄达昆明时种子含水量11.2%。

1.2 方法 1.2.1 下胚轴休眠解除试验

2008年12月25日种子经0.3%高锰酸钾消毒30 min后，清水冲洗，浸泡1周，待种子完全吸胀后再做各种处理。每处理均3重复，每重复100粒种子。

1) 常规播种:将种子直播于昆明市中国林业科学研究院资源昆虫研究所露地苗床，基质为红壤土、河沙、农家肥按1:1:1比例配制。基质随时保持湿润，冬季不采取加温措施。条播，播种深度5 cm，条距20 cm，粒距5 cm。3个小区，每小区100粒。

2) 温度对下胚轴休眠解除效应:设置5个温度处理，即5，10，15，20，25 ℃，置于人工气候箱中恒温培养。

3) 预处理对下胚轴休眠解除效应:共8个处理，即50 ℃温水(1)、乙烯利20 mg·L^-1 (2)、乙烯利50 mg·L^-1 (3)、乙烯利80 mg·L^-1 (4)、GA₃ 200 mg·L^-1 (5)、GA₃ 400 mg·L^-1 (6)、GA₃ 600 mg·L^-1 (7)，以室温清水(8)为对照。以上处理浸泡时间均为24 h，处理后均置于15 ℃人工气候箱中恒温培养。

各处理种子均用高压灭菌的河沙进行层积，培养期间保持沙子湿润。播种20天后，每天观察发根情况，以胚根伸出种皮3 mm视为种子发根。对发根起始天数、发根历期、发根率、发根指数等进行调查及统计。

发根起始天数:指从播种到第1粒种子发根所需天数。

发根历期:发根高峰后连续15天不再有发根种子出现则终止调查，以第1粒种子发根至统计期间最后1粒种子发根所经历时间为发根历期。

式中:G_t:置床后t日的发根数; D_t:相应的发根日数。

1.2.2 上胚轴休眠解除试验

种子经0.3%高锰酸钾消毒30 min，清水冲洗，浸泡1周后用经高压灭菌的河沙层积，放置于15 ℃人工气候箱中，保持沙子湿润，发根后用于发芽试验。发根种子经各种处理后，埋入泥炭土:珍珠岩(体积比2:1)的基质中置于15 ℃人工气候箱发芽，每个处理40粒生根种子，3次重复，统计各个处理的发芽率和发芽时间，以子叶出土5 mm视为种子发芽。设置以下处理。

1) 上胚轴休眠解除适宜处理时期:选择根长＞3，2 ~ 3，1 ~ 2，＜1 cm的种子用GA₃ 200 mg·L^-1浸泡2 h，15 ℃人工气候箱发芽。

2) 温度对上胚轴休眠解除的影响:用GA₃ 200 mg·L^-1浸泡根长＞3 cm的种子2 h，于10，15，20，25 ℃的人工气候箱中发芽。

3) GA₃对上胚轴休眠解除的影响:用50，100，200，300，400 mg·L^-1的GA₃浸泡根长＞3 cm的种子2 h，以室温清水浸泡2 h为对照，处理后置于15 ℃人工气候箱发芽。

4) 低温处理对上胚轴休眠解除的影响:根长＞3 cm的种子4 ℃处理20，30，40天，处理后置于15 ℃人工气候箱发芽，以不作任何处理直接于15 ℃人工气候箱发芽为对照。

统计与计算方法与发根试验相同。

1.3 试验数据的处理

试验数据采用SPSS 16.0和Excel软件进行统计分析，处理间差异通过单因子方差(One Way ANOVA)检验其是否显著; 对差异显著者，进一步采用LSD和Duncan多重比较，字母法标记; 其中发芽率和生根率数据均进行反正弦转换，以转换后的值进行差异比较，在解释结果时则还原为试验实得数值(张力，2006)。

2 结果与分析 2.1 常规播种生根及萌发情况

除播前浸泡外不作任何其他处理的常规播种情况下，大花黄牡丹种子生根及发芽时间极长，且极不整齐，不适于进行精准的统计分析，仅能总结其萌发的基本规律。种子于2009年1月1日播入花盆，2009年5月20日开始生根，即发根起始天数为140天; 10月15日开始出芽，即发芽起始时间为288天，从发根起始至发芽起始为148天。至2010年5月5日平均出芽率为35%，其后直到2010年7月均未再出芽，也即从播种至发芽结束历期490天，从发芽起始至发芽结束历期202天。在202天的发芽历期中，出苗极不规律，有时连续数天出苗，每天出苗1 ~ 3株，有时连续数天不出苗，随后又有苗萌生，无明显出苗高峰，且出芽期间仍有种子陆续生根。

该试验结果说明大花黄牡丹种子存在休眠特性，且表现为下胚轴和上胚轴休眠。

2.2 温度对下胚轴休眠解除效应

统计结果(表 1)表明:5 ℃和25 ℃处理种子均未发根，10，15，20 ℃ 3种处理均有生根，且3种处理间的发根起始天数、发根历期、发根率、发根指数均存在显著差异，以15 ℃处理最为理想，该处理所需生根起始时间最短，为49天左右，发根历期也最短，仅需40天发根率即可达97.3%，发根指数达1.50，发根率及发根指数均显著高于其他处理。综合各指标评价，大花黄牡丹种子萌发以15 ℃为最适萌发温度，以此处理可较常规播种缩短发根起始时间91天。

2.3 预处理对下胚轴休眠解除影响

该试验设置的对照及不同预处理条件下，大花黄牡丹种子发根率均可达97%左右，相互间无显著差异(表 2)。但GA₃ 400 mg·L^-1处理的生根起始时间为40天，较对照提早7天，发根历期为38.67天，较对照少10天，发根指数最高，达1.87，3个指标均显著优于对照。因此，采用GA₃ 400 mg·L^-1对大花黄牡丹种子进行预处理，虽不能显著提高生根率，但生根更为整齐，建议生产上酌情使用。

2.4 上胚轴休眠解除适宜处理时期

以GA₃ 200 mg·L^-1处理不同根长的种子，以筛选适宜的解除上胚轴休眠的处理时期。结果(表 3)表明:根长＜1 cm的种子所需起始发芽天数显著多于其他处理，发芽率、发芽指数则显著低于其他处理。而根长＞3 cm的种子所需发芽起始时间显著少于其他处理，发芽率、发芽指数则显著高于其他处理。因此认为以根长达3 cm以上的种子进行上胚轴休眠解除处理最理想，从处理至发芽结束历期只需31天，出芽率可达97%左右。

2.5 温度对上胚轴休眠解除的影响

温度对大花黄牡丹上胚轴休眠解除具有较大影响(表 4)。25 ℃处理种子发芽率为85.8%，显著低于其他处理，10 ℃处理所需发芽起始时间为21.33天，显著多于其他处理，发芽指数则显著低于25 ℃处理。15 ℃和20 ℃处理种子发芽起始天数、发芽率和发芽指数均无显著差异，发芽率分别为97.5%和95%，与10 ℃处理无显著差异。因此，15 ~ 20 ℃为大花黄牡丹上胚轴解除休眠的适宜温度。

2.6 GA₃对上胚轴休眠解除的影响

用不同质量浓度的GA₃处理根长3 cm以上的种子，均能起到显著的上胚轴休眠解除效果(表 5)。清水浸泡的对照种子从处理到发芽起始需76天，从发芽起始至结束需16.33天，发芽指数0.06，发芽率仅为11.7%，未发芽的种子在试验结束时少部分种子整体腐烂，大部分种子胚根变褐。而不同质量浓度GA₃处理的种子所需发芽起始天数均显著少于对照，发芽历期及发芽率相互间均无显著差异，发芽指数以300 mg·L^-1处理最高。因此，用300 mg·L^-1 GA₃浸泡根长3 cm以上的种子2 h具有最好的上胚轴休眠解除效果。在此处理下，发芽起始时间仅需6天，发芽历期25天，发芽率高达99.2%，发芽指数达3.14。

2.7 低温处理对生根种子发芽的影响

4 ℃低温处理不同时间对大花黄牡丹上胚轴休眠解除也能起到显著效果(表 6)，各处理种子发芽率均显著高于对照，其中以低温处理30天和40天效果最佳，发芽率可达77.5%和80%，两者之间无显著性差异。

3 讨论与结论 3.1 讨论

1) 关于大花黄牡丹种子失活问题  休眠是植物种子对环境变化的适应特征，除受多基因调控外，还受植物激素和环境因子的影响(Finkelstein et al., 2008)。张蕾(2008)对大花黄牡丹种子活力检测后认为，大花黄牡丹种子自然风干8天时含水量降至11%，部分种子活力丧失，13天后种子含水量降至6.4%，种子全部丧失活力。龚洵等(1993)对黄牡丹的研究有类似结论，认为黄牡丹(Paeonia lutea)种子含水量为29.5%时胚的生命力开始下降，含水量为14.1%时，所有种子丧失活力。本研究所采用种子于2008年9月采收，于西藏灵芝县室内自然风干保存，于12月底送达昆明时种子含水量为11.2%。以上种子在适宜的处理下出芽率高达95%以上，不仅说明大花黄牡丹种子完全可于室内自然风干存放3个月以上，且可不必随采随播，也不必沙藏，为科学试验和生产实际提供了极大便利。

2) 关于大花黄牡丹下胚轴休眠问题  采用化学药剂处理(Oda et al., 2009)、温水浸种(Sadehgi et al., 2009)等方法或运用砂纸打磨(Sadehgi et al., 2009)、剖开种子(Ashley et al., 2009)等物理手段可有效打破部分种子由于种皮的理化限制而导致的休眠。景新明等(1995; 1999)研究结果表明:栽培牡丹种子在胚根显露前约有3个月的后熟期，去除种皮及各种理化处理均不能显著促进其萌发，而四川牡丹(Paeonia decomposita)、紫斑牡丹等4种野生牡丹，其种子萌发生根前需半年以上，但通过胚培养可使之减至2周。娄方芳等(2007)对黄牡丹种子萌发的研究结果显示:将新采收的成熟种子用GA₃处理后在10 ℃下培养，15天后种子出现裂口，60天后生根率达26%，未作处理的对照生根率仅为2%，而GA₃处理种子在15 ℃培养下20天后即有种子开始生根，2个月后生根率可达74%，但对照生根率也达50%，此结果表明黄牡丹的种子不论采用何种处理，仍需在适宜萌发温度下经2个月时间才能大量萌发。以上研究结果初步表明:牡丹属植物种子休眠为非物理休眠(胡小文等，2009)，亦非化学休眠或综合休眠类型(方升佐等，2011; Cooke et al., 2002; Morris et al., 2000; Sari et al., 2006)，而是由于胚未完成后熟作用而导致的生理休眠。由于牡丹种子萌发时先长胚根，再长胚芽，因此由生理后熟导致的休眠首先表现为下胚轴的休眠。

3) 关于大花黄牡丹上胚轴休眠解除  牡丹种子为典型的上胚轴休眠类型，对其休眠解除也有众多研究，多认为须在胚根生长至4 cm左右时用GA₃或低温处理才能有效解除休眠(刘心民等，2005)。本文对大花黄牡丹上胚轴休眠解除的研究得出类似结果，以GA₃ 200 mg·L^-1处理根长3 cm以上的种子效果最好，虽对根长1 cm以下的种子也有一定休眠解除效果，处理后40天左右出芽率可达79%，但起始发芽时间较3 cm的种子晚10天左右，而胚根由1 cm生长至3 cm也需要10天左右，因此认为GA₃也要在胚根长至3 cm以上后才能充分发挥作用。虽然胚根长3 cm以上的种子经4 ℃低温层积20 ~ 40天也能有效解除上胚轴休眠，但其作用远不如GA₃效果好。

关于大花黄牡丹下胚轴生长情况仅见张蕾(2008)的研究，但其研究未说明所用种子状况及萌发试验起始时间。本文所用为采后室内保存3个月的大花黄牡丹种子，但在最适于胚根生长的15 ℃恒温培养箱中培养仍需49天下胚轴才开始萌生，再需40天才完成发根; 而不同质量浓度的乙烯利、GA₃及50 ℃浸种处理对生根率无显著影响，说明大花黄牡丹同样可能存在生理后熟作用，而这种作用在种子吸水后40天左右才能完成。由于尚无人研究过刚采收的大花黄牡丹种子于15 ℃下进行恒温培养的生根效果，因此，无从判断其种子生理后熟所需的确切时间。

3.2 结论

综合考虑上胚轴及下胚轴休眠解除，大花黄牡丹种子理想的萌发程序和条件为:播种前室温清水浸泡7天，于15 ℃恒温培养; 待根生长至3 cm以上时，以300 mg·L^-1 GA₃浸泡2 h，置于15 ℃恒温培养。按此处理，从播种到种子发芽结束约需120天，较常规播种缩短370天以上，发芽率可达95%以上，较常规播种提高171.4%以上。