拟松材线虫(Bursaphelenchus mucronatus)的形态、生物学特征与松材线虫(B. xylophilus)非常相似，并可能对松属(Pinus)部分种类有一定的致病性。

此外，拟松材线虫形态特征还与豆伞滑刃线虫(B. doui)伪伞滑刃线虫(B. fraudulentus)等非常相似(Braasch et al., 2004)，单从形态学角度很难进行准确的鉴定(Braasch，2008；张奇等，2008)。Braasch(1991)根据形态学及分子生物学等方面的差异，又将拟松材线虫分为2个地理型：东亚型(east Asian type)和欧洲型(European type)。此后有很多学者的研究证实了这一点(Zheng et al., 2003；Iwahori et al., 2004；Urek et al., 2007；Burgermeister et al., 2005；2009)，这更增加了拟松材线虫的鉴定难度。

鉴于国内尚未有文献论述拟松材线虫2个地理型之间的差异，并且笔者研究发现欧洲型拟松材线虫的ITS PCR-RFLP图谱存在变化。为便于有关实验室对该线虫进行准确鉴定，现将结果报道如下。

1 材料与方法 1.1 线虫来源

所用线虫均为宁波口岸从进境木质包装中分离所得，具体见表 1。

1.2 形态观察

用Zeiss Axio Imager Z1显微镜和Zeiss AxioCam MRm CCD数码相机对线虫的整体形态和内部特征进行观察、摄影。

1.3 ITS-RFLP分析 1.3.1 线虫DNA的提取(王江岭等，2010)

将线虫放入ddH₂O清洗，挑取单条线虫放入200 μL PCR管中[含8 μL ddH₂O和1 μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)]，85 ℃加热5 min，-70 ℃放置30 min，85 ℃加热2 min，向PCR管中加入1 μL 1 mg·mL^-1蛋白酶K，56 ℃加热2 h，95 ℃加热10 min，13 000 r·min^-1离心PCR管1 min，得到DNA粗提液，-20 ℃保存备用。

1.3.2 rDNA的ITS区PCR扩增

PCR扩增采用50 μL反应体系：ddH₂O 19.4 μL，10×PCR Buffer(Mg²⁺ free)5 μL，25 mmol·L^-1 MgCl₂ 5 μL，0.1 mmol·L^-1 dNTP 4 μL，10 μmol·L^-1上游引物F194 (Ferris et al., 1993)(5′-CGTAACAAGGT AGCTGTAG-3′)3 μL，10 μmol·L^-1下游引物5368r (Vrain，1993)(5′-TTTCACT CGCCGTTACTAAGG-3′)3 μL，5 U·μL^-1 Taq酶0.6 μL，模板DNA 10 μL。

扩增程序为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，36个循环；72 ℃ 8 min。

1.3.3 RFLP分析

取上述PCR扩增产物8 μL加入0.5 μL ddH₂O，1 μL限制性内切酶对应Buffer，并分别用0.5 μL的限制性内切酶Rsa Ⅰ，Hae Ⅲ，Msp Ⅰ，Hinf Ⅰ，Alu Ⅰ于37 ℃酶切3 h，酶切后的DNA用加入EB的1.5%琼脂糖凝胶电泳(5 V·cm^-1，50 min)，紫外检测仪上观察记录结果并拍照，获得线虫的ITS-RFLP图谱。

2 结果与分析 2.1 主要形态特征

拟松材线虫2种地理型的雄虫形态基本一致，仅虫体大小、交合刺大小、喙突长度、基顶与交合刺所成角度有一定变化，但没有规律。

拟松材线虫2种地理型的区别主要是雌虫尾部形态：东亚型雌虫尾部呈圆锥形，尾尖突与尾几乎连续，缢缩不明显；而欧洲型雌虫尾呈亚圆柱形，尾尖突与尾端缢缩明显(图 1)。

2.2 PCR扩增结果

不同来源的欧洲型拟松材线虫rDNA-ITS区经PCR扩增后，测序结果显示扩增产物均为约925 bp的片段。东亚型拟松材线虫约为920 bp。

2.3 PCR-RFLP结果与分析

选用对伞滑刃线虫具有鉴别作用的5种限制性内切酶Rsa Ⅰ，Hae Ⅲ，MspⅠ、HinfⅠ和AluⅠ，对各个来源的东亚型和欧洲型拟松材线虫rDNA-ITS区的PCR扩增产物进行酶切分析，得到3种酶切图谱(图 2)。3种酶切图谱区别在于Rsa Ⅰ酶切产物大小差异，分别为：4条(变异型A)、3条(变异型B)、5条(变异型A+B)(表 2)。其中变异型A与Burgermeister等(2009)结果一致。

通过对不同来源欧洲型拟松材线虫进行酶切研究，各株系线虫得到的变异型酶切图谱见表 2。除460-1得到了全部3种变异型酶切图谱外，其他只得到1到2种酶切图谱(表 1)。统计显示：得到变异型A酶切图谱占绝大多数。以前的研究大多选用大量线虫作为DNA来源，不能表现出单个线虫DNA序列的微小差异，因此也多得到变异型A酶切图谱的结果。

从以上结果可以看出：之所以欧洲型拟松材线虫有3种限制性内切酶Rsa Ⅰ的结果，是因为该种线虫的部分群体存在核糖体ITS区段序列的异质性或微不均一性(microheterogeneity)(Burgermeister et al., 2009)，即同一种内、个体间或者个体内部ITS区段在相同位置存在DNA序列的差异。在变异型B的基础上，变异型A在490 bp的产物上多了一个Rsa Ⅰ酶切位点，将其分成263 bp和227 bp 2个片段；而变异型A+B则是混合体，显示同一条线虫的PCR扩增产物中，多数产物上(显示酶切产物条带颜色较深)没有针对490 bp的产物的酶切位点，但少数产物上存在酶切位点。

3 讨论

目前已发现B. corneolus, B. singaporensis, B. sexdentati, B. doui等多种伞滑刃线虫存在ITS区段序列的异质性现象(Lange et al., 2007；Kanzaki et al., 2008；Burgermeister et al., 2009)，但未曾有关于欧洲型拟松材线虫ITS区段序列的异质性现象的报道。Urek等(2007)展示欧洲型拟松材线虫应属于变异型A+B，但文中既没有对此作进一步分析，又忽略了263 bp和227 bp 2个条带。

尽管该现象会造成伞滑刃属线虫ITS PCR-RFLP图谱的细微差异，但由于这一现象较少见，并且都只是其中一种酶切结果略有差异，因此这对依据ITS PCR-RFLP图谱进行种类鉴定影响甚微。ITS PCR-RFLP仍是伞滑刃属线虫鉴定十分可靠的辅助手段，得到了广泛的应用。

在形态学鉴定时，拟松材线虫易与伪伞滑刃线虫、豆伞滑刃线虫混淆。伪伞滑刃线虫虫体更粗壮(雌虫和雄虫a=33.5和36.6，而拟松材线虫a>40)，端生尾尖突多数着生于近腹面且微向腹面弯曲，长约1.5~2.6 μm，偶尔尾端钝圆，较拟松材线虫短(拟松材线虫尾尖突长度平均超过4 μm)，并且雄虫交合刺远端盘状突膨大不明显。豆伞滑刃线虫雌虫尾尖突多位于腹面，长2~4 μm，形态多变(阶梯形、几乎钝圆、丝状、方形、鸟嘴形)；交合刺大(长36~40 μm)，且中部较平直。拟松材线虫与伪伞滑刃线虫、豆伞滑刃线虫的ITS PCR-RFLP图谱有显著差异(Burgermeister et al., 2009)。

Wingfield等(1983)报道从美国明尼苏达州和威斯康辛州的香脂冷杉(Abies balsamea)中分离到M型松材线虫。该线虫形态特征与欧洲型拟松材线虫十分接近，其雌虫所有个体都有明显的尾尖突，平均值为2~3 μm(有关M型松材线虫的形态和分子特征正在进一步研究)，而欧洲型拟松材线虫的平均值一般超过4 μm。但研究表明M型松材线虫的ITS PCR-RFLP图谱与松材线虫完全一致(Li et al., 2009)。

松材线虫雌虫偶尔也有会有尾尖突，一般不超过2 μm，但存在一些特殊情况。Braasch等(1996)报道一种圆尾形的松材线虫(US15株系)接种到苏格兰松(Pinus sylvestris)幼苗上后，3个月后从树苗上分离到的雌虫中，35%呈圆尾形，8%尾呈锥形，40%有短尾尖突(约1 μm)，而17%有显著的尾尖突，长达4~5 μm。赵文霞等(2005)也报道一种圆尾形松材线虫接种到油松(Pinus tabulaeformis)上后，从死树上分离到的雌虫中85%具有尾尖突(该文没有给出具体数据)。郑炜等(2007)也报道从浙江宁波马尾松(P. massoniana)中分离到一种松材线虫，其雌虫尾尖突平均值达1.7 μm，最长达2.9 μm，但经灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)培养后，所有的雌虫尾尖突均消失。

此外，刘伟等(1995)报道1种加拿大的松材线虫株系在拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)上培养后，44%呈圆尾形，33%有不到1 μm的尾尖突，23%尾尖突达1.46~3.41 μm。

尽管松材线虫雌虫尾形多变，但R型松材线虫雌虫中总有一些个体是圆尾形的。由此可见，关于松材线虫、拟松材线虫及其近似种的形态鉴定十分困难。本研究表明：ITS PCR-RFLP方法是十分可靠的辅助手段，结合形态学鉴定方法，可有效区分拟松材线虫及其近似种，并且还可准确区分种内不同地理型，为拟松材线虫的鉴定提供了可靠依据。