药用植物种质资源的优劣对中药材的产量和质量有决定性的作用(黄璐琦等，2005)，种质资源有产生某一特定表型的潜力，但不是必然因素，而是导致一系列的可能性，究竟其中哪一个可能性得到实现，视环境而定(黄璐琦等，2007；曹海禄等，2007；毛飞等，2007；史江峰等，2007)。通常在种源明确的前提下，药材品质的优劣取决于其对环境因子的响应。因此，要提高中药材的产量和品质，一方面要选育优质、高产、抗病虫害的优良品种，另一方面还要研究主要生态因子对中药材产量、品质的影响，确定药材适宜生长的区域(刘洋等，2007)。

银露梅(Potentilla glabra)为我国高寒地区典型性落叶灌丛，又名白花棍儿茶、萌根-乌日阿拉格、银老梅，是重要的野生药用植物资源(中国科学院中国植物志编辑委员会，1985)。银露梅主要有效成分为单宁和黄酮类化合物，嫩叶可代茶叶饮用，花、叶入药, 味微甘，性凉，有健脾化湿、清暑调经、理气散寒、利尿消水、肠道防腐、治疗风热牙痛之功效等(娄宁等，2004)。目前对银露梅的研究主要集中在生物学特性(中国科学院中国植物志编辑委员会，1985)、繁殖培育(任继文，2003；赵典普，2007)、挥发性成分测定(娄宁等，2004)等方面，但对银露梅活性成分与气候因子的相关性研究未见报道。本文应用生态学、统计学方法研究了6个产地银露梅叶的有效成分含量及其体外抗氧化活性的差异，通过分析其与气候因子之间的关系，明确哪些气候因子起主导作用，其研究结果对选择高品质野生药用银露梅的产地来源有重要意义，同时为开发利用该野生植物资源在创制中成药新品种及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

根据课题研究对象的需要，在广泛收集银露梅天然分布资料和实地勘察的基础上，经分析论证确定研究区域分别为陕西省秦岭牛背梁自然保护区、陕西省宁陕县火地塘微波站、陕西省眉县太白山斗母宫、陕西省凤县紫柏山、内蒙古自治区贺兰山哈拉乌北沟和青海省互助北山共6个代表性自然分布区。在每个区域内，采用代表性样地法(杨持，2008)选取典型样地。典型样地具有以下特征：银露梅为天然灌丛或天然次生灌丛，盖度80%以上，丛龄一致(20~30年)；生长整齐而良好，无明显病虫害，无人为干扰等。在每个典型样地内设置3个30 m×30 m的样方，在每个30 m×30 m的样方内设置3个10 m×10 m的小样方，在小样方内随机抽取10个点采样，然后将其均匀混合作为一个样品。每个30 m×30 m的样方获得3个样品，每块样地共计9个样品，6个区域(样地)共获得54份样品，自然阴干，保存。为确保采收期的一致，取样工作于2010年8月22日至9月10日完成。各样地经纬度及海拔见表 1。

1.2 方法 1.2.1 样品提取液的制备

以太白山银露梅叶为试验材料，在单因素试验基础上，综合考虑各因素对银露梅叶单宁、黄酮得率的影响，最终确定4个主要因素。在此基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理、设计响应曲面试验对提取工艺进行优化，确定最优提取工艺(吴华勇等，2008)。经Design-Expert软件分析，确定提取工艺为：乙醇浓度为90%，提取温度为80 ℃，提取时间为2 h，提取次数为3次，液料比为1:20。

1.2.2 样品提取液的制备

取不同产地样品各5 000 mg(a), 按照1.2.1提取工艺进行提取、过滤，将滤液浓缩定容至250 mL(b)，备用。

1.2.3 单宁含量的测定与计算

单宁含量测定采用钨酸钠-磷钼酸显色法(张纵圆等，2009)，标准曲线的回归方程Y₁=92.429X₁+0.070 1(Y₁为吸光度；X₁为单宁标准溶液的浓度，单位：mg·mL^-1，R²=0.999 4。

准确移取待测样品提取液1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度。然后准确移取该液1 mL于25 mL容量瓶中，加入1 mL的F-D显色剂和5 mL的1 mol·L^-1的碳酸钠溶液，然后用甲醇定容至刻度。室温下静置30 min后，在波长720 nm下测定吸光度。利用空白作为参比。单宁百分含量的计算公式为：

(1)

式中：a=5 000.0 mg；b=250 mL；c₁(样品溶液浓度)=，单位：mg·mL^-1；250为样品溶液稀释倍数。

1.2.4 黄酮含量的测定与计算

黄酮含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法(沈爱宗等，2008)，标准曲线的回归方程Y₂=13.067X₂+0.0367(Y₂为吸光度；X₂为芦丁标准溶液的浓度，单位：mg·mL^-1，R²=0.999 6。

准确移取待测样品提取液1.0 mL于25 mL容量瓶中，然后加入5%的亚硝酸钠溶液0.3 mL，静置6 min，再加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，静置6 min，最后加入1 mol·L^-1的氢氧化钠溶液4 mL，用70%的乙醇溶液定容到刻度，静置30 min后，在波长为510 nm处测定吸光度。以空白作为参比。黄酮百分含量的计算公式为：

(2)

式中：a=5 000.0 mg；b=250 mL；c₂(样品溶液浓度)=，单位：mg·mL^-1；25为样品溶液稀释倍数。

1.2.5 提取物抗氧化活性能力的测定

DPPH_IC50是指对DPPH·自由基的清除率达到50%时所需的该样品溶液的浓度，DPPH_IC50值的大小反映了提取物抗氧化能力的强弱，二者呈负相关关系，用来作为衡量抗氧化能力的指标。DPPH·法是用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速(反应时间约20 min)、简便、灵敏可行的方法(Brand-Williams et al., 1995)。本研究采用体外DPPH·自由基清除法测定不同产地银露梅叶提取物的抗氧化能力(刘永刚等，2005；许宗运等，2004)。测试时分别用甲醇将V_C、槲皮素、芦丁及各产地银露梅叶提取物配制成所需浓度，在517 nm处，测定不同浓度样品2 mL加DPPH 2 mL的吸光度A_i，不同浓度样品2 mL加2 mL甲醇的吸光度A_j，甲醇2 mL加DPPH 2 mL的吸光度A_o。样品及对照品分别测13~17个浓度，以甲醇作为空白。样品对DPPH·自由基的清除能力(SA)的公式可表示为：

(3)

1.2.6 气候因子与银露梅有效成分的相关性的分析方法

1) 气候资料的获取  查阅前人相关研究，确定影响银露梅有效成分及抗氧化活性可能性最大的目标气候因子，重点依据各产地最近的气候观测站点、《中国自然资源数据库-气候资源数据库》和《中国社会经济发展统计数据库》2006—2010年6个不同产地地面气象数据计算所得气候因子和基础地理信息栅格数据(每平方千米)及衍生数据，包括9个指标：年均温、1月均温、7月均温、年积温、年极端最高温度、年极端最低温度、降水量、日照时数、无霜期。基础地理信息数据库是全国1:100万地图的矢量数据库。样地与气象数据来源见表 2。

2) 数据处理  应用SPSS 18.0对各地气候因子、有效成分含量与DPPH_IC50值进行方差分析及LSD检验(P < 0.05)，并应用DPS 2000软件分别进行气候因子与银露梅叶有效成分含量之间的灰色关联分析以及气候因子与银露梅叶提取物抗氧化活性之间的灰色关联分析。

2 结果与分析 2.1 研究区域气候概况

2006—2010年的气候资料统计结果显示(表 3)，各样地间气候条件差异明显，年均温相差5.92 ℃，1月均温相差12.18 ℃，7月均温相差19.64 ℃，年积温相差1 674.7 ℃，无霜期相差88.2天，年极端最高温度相差26.24 ℃，年极端最低温度相差45.3 ℃，年日照时数相差1 946.88 h，年均降雨量相差915.94 mm。

样地之间相互比较呈现如下特点：牛背梁温度适中多雨，无霜期最长但日照时数较少；火地塘7月均温最高，降雨量最多，年日照时数最少，无霜期较短；太白山年积温最高、年极端最高温度最高，7月均温较低，无霜期偏长，降雨量及年日照时数适中；紫柏山年均温最高，温度总体上中等偏高，降雨量较少，年日照时数中等，无霜期偏长；互助北山温度最低，降雨量偏少，年日照时数较长，无霜期最短；贺兰山1月均温较低，7月均温较高，年积温较高，年极端最高温度较高，年极端最低温度最低，降雨量最少，属高温少雨气候，日照时数最长，无霜期较短。

2.2 不同产地银露梅叶的有效成分含量及体外抗氧化活性的比较

由表 4可知，同一物候期不同生境下银露梅叶中有效成分含量及体外抗氧化活性差异显著，其中，互助北山银露梅叶中的单宁、黄酮含量均最高，分别达7.74%和3.27%，而其体外抗氧化活性最弱；贺兰山银露梅叶中的单宁、黄酮含量分别为4.86%和3.27%，仅次于互助北山，但其体外抗氧化活性最强。由此可知，2个产区的单宁和黄酮并不完全都具有抗氧化活性，可能是银露梅叶中具有抗氧化活性的单宁和黄酮在贺兰山产区含量较高。因此，在评价药用植物品质时除考虑有效成分含量外，其抗氧化活性也是一个重要因素。另外，表 4还可以看出，来自秦岭的4个产地，牛背梁、火地塘、太白山和紫柏山，其单宁的含量为5.00%~5.97%，居于贺兰山与互助北山之间，且差异不显著；黄酮的含量为1.08%~2.32%，低于贺兰山，且差异显著；从抗氧化活性看，其抗氧化能力较弱，其中火地塘产区最弱(DPPH_IC50为13.94)，但其余3个产区稍强于互助北山，且火地塘产区抗氧化能力与其余3个产区差异显著。

2.3 气候因子与银露梅叶有效成分含量的相关性分析

从表 5可看出，各气候因子与银露梅叶有效成分含量之间灰色关联度在0.586 6~0.864 7，表明所选各气候因子与银露梅叶有效成分合成累积联系密切。其中与单宁含量灰色关联度最大的气候因子为年极端最低温度、无霜期、年极端最高温度，其灰色关联度分别达0.864 7，0.790 7和0.752 6。与黄酮含量灰色关联度最大的气候因子为年日照时数、年极端最低温度、年积温，其灰色关联度分别达0.782 9，0.719 3和0.702 1，由此表明温度在银露梅叶单宁、黄酮的合成积累中起了重要作用，其中年极端最低温度是影响其积累的共同因子，且低温的影响要显著大于高温。年日照时数与黄酮含量的灰色关联度最大，药用植物体内有机物的形成和转化有赖于光合作用，日照时间反映了植物直接获得光能的量，银露梅属喜光植物(中国科学院中国植物志编辑委员会，1985)，其生长发育需要有充足的光能，在生长期内，干物质合成积累与日照呈正比，日照时数长，光合作用强，有机物的合成累积增强，从而增加黄酮的积累。无霜期为植物将热能转换成物质的积累期日数，可表示植物生长期的长短，是影响单宁合成的重要因子。除此之外，银露梅单宁、黄酮的积累还与年极端最高温度、年积温有关。

2.4 气候因子与银露梅叶提取物抗氧化活性的相关性分析

从表 6可看出，各气候因子与银露梅叶DPPH_IC50值之间的灰色关联度在0.623 8~0.764 7，表明所选各气候因子与银露梅叶提取物的抗氧化活性关系密切。其影响顺序依次为：年日照＞年均降雨量＞年极端最低温度＞年极端最高温度＞1月均温＞7月均温＞年积温＞无霜期＞年均温，可见光、水、温三因素共同影响银露梅叶提取物的抗氧化活性。贺兰山银露梅叶抗氧化活性最强，可能与该地区年日照时数长、降雨量少、温差大等独特的气候因子有关。年均降雨量对于DPPH_IC50的灰色关联度不如光照，可能是因为银露梅喜光，吸收充足的光能后，植株生长旺盛，能够提高其叶中抗氧化作用的物质累积合成速率，因此，年日照对DPPH_IC50的影响最大。对所研究的银露梅6个产区而言，当光照条件一定时，水分的增加并不一定能增强银露梅叶的抗氧化活性，也不一定能提高有效成分含量。

3 结论与讨论

灰色关联是指事物的不确定关联，是一种对系统动态过程发展态势的定量比较分析技术，它以系统内各因子间的关联系数和灰色关联度的大小作为依据，通过分析系统中主行为因子与相关行为因子关系的密切程度来确定主要因素和次要因素，适用于部分信息已知、部分信息未知的不确定性系统。而中药材与环境的关系属不确定关联，本文采用灰色关联分析方法，把气候生态因子作为子因素，将银露梅药材的有效成分含量与体外抗氧化活性视为母因素，从中筛选对银露梅有效成分含量及抗氧化活性影响最大的气候因子，以期探明银露梅有效成分的积累及抗氧化能力对光照、温度、水分等气候条件的要求，从研究结果来看基本能够反应客观实际情况(刘玉成等，1996；王建林等，2006；李倩等，2010；Yeh et al., 2004)。

本研究结果初步显示：6个产区立地条件差异显著，其温度、光照、水分等气候因子的不同，因而决定了各产区银露梅叶中的单宁、总黄酮的含量及其体外抗氧化活性的差异性。1)年极端最低温度、无霜期、年极端最高温度是影响单宁含量的主导因子，其中年极端最低温度是重要因子，当温度低于植株所能承受的最低温度时，会造成植物的冻害现象，化合物的合成积累也就会减慢甚至停止(张继澍，2002)。贺兰山年极端最低温度达-29.88 ℃，温度过低，影响了单宁的积累，其含量最低，仅为4.86%。日照时数长、降雨量少也是抑制银露梅中单宁含量的重要因素，且与单宁含量呈负相关。青海互助北山年极端最低温度、年日照和降雨适中，气候条件有利于银露梅叶中单宁含量的积累，因此，该产区单宁含量高。2)年日照时数、年极端最低温度、年积温是影响黄酮含量的主导因子，其中年日照时数为重要因子。年均温过高对黄酮的积累不利，紫柏山产区年均温接近12 ℃，导致黄酮含量低，而年均温在6 ℃左右的互助北山与10 ℃左右的贺兰山银露梅黄酮含量较高，由此可以认为年均温6~10 ℃是银露梅叶黄酮含量高的适宜温度条件，关于这一结果有待于进一步研究。日照时数、降雨量对黄酮含量的影响与单宁一致，但影响程度不尽相同，黄酮含量高的产地单宁含量不一定高。贺兰山1月均温、7月均温、年积温、年极端最高温度、无霜期均高于互助北山，但其日照时数过长、降雨量偏少，黄酮的积累受到影响，导致黄酮含量低于互助北山，居第2位，另外，在采样时发现贺兰山的银露梅叶片较小，向上向内翻卷，干枯，呈手掌状，可能由于该区海拔较高(3 102 m，高于互助的2 930 m)，受紫外辐射的强度大，加之该区日照时数过长、降雨量偏少、夏季温度过高所致，也可能与自身的遗传因素有关。3)抗氧化是评定银露梅品质不可忽视的指标。年日照、年均降雨量、年极端最低温度是影响抗氧化活性的主导因子，年日照是重要因子。贺兰山产区DPPH_IC50值最小(6.90 μg·mL^-1)，银露梅叶抗氧化能力最强，这与贺兰山年日照时数长、降雨量少等气候因子有关，当然也与其他生态因子的综合作用有关。日照时数长、降雨量少有利于抗氧化活性的提高，这与其对银露梅叶中单宁、总黄酮含量影响结果相反，日照时数长、降雨量少有利于抗氧活性的提高却对单宁、黄酮含量的累积有抑制作用，因此，贺兰山的银露梅抗氧化活性强，单宁、黄酮的含量低，而互助北山的银露梅抗氧化活性弱，单宁、黄酮含量高。4)就本文研究区域而言，从有效成分含量与抗氧化能力2个指标综合来看，位于秦岭的4个产地，牛背梁、火地塘、太白山和紫柏山产区银露梅品质中等，没有明显的优劣，这一点可为银露梅的利用提供导向，生产中应根据不同的需求来选择银露梅药材。

气候因子是影响银露梅有效成分含量及抗氧化活性的重要因素。本文的这一研究结果，可对银露梅的开发利用具有一定的指导意义，在实际生产中，应根据对银露梅叶单宁、黄酮、抗氧化能力的具体需求来利用该资源，希望得到单宁、黄酮成分含量高的银露梅药材应选择温度较低、年日照时数中等偏长、降雨量中等偏少、无霜期较短的生态区，如互助北山；希望得到抗氧化活性强的银露梅药材应选择年日照时数长，降雨量少、年极端最低温度低的生态区，如贺兰山。另外，在选择银露梅栽培基地时，同样应充分考虑这些因素。