枣实蝇(Carpomya vesuviana)是一种高度危险性有害生物。在2007年5月29日发布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中把枣实蝇列为我国禁止进境的检疫性入侵害虫(张润志等，2007; 阿地力·沙塔尔等，2008)。枣实蝇属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)实蝇亚科(Trypetinae)实蝇族(Trypetini)咔实蝇属(Carpomya)。枣实蝇危害枣属植物如红枣(Ziziphus jujuba)和酸枣(Z.jujuba var.spinosa)，主要以幼虫蛀食果肉，成虫不危害枣果，通常可造成的产量损失高达20%以上，发生严重的可以导致全部枣果受到危害，从而严重影响到红枣的产品质量及其整体的商品价值(阿地力·沙塔尔等，2008)。枣实蝇最初来源于印度，现在主要分布在高加索、意大利、巴基斯坦、毛里求斯、阿富汗、印度、泰国、乌兹别克斯坦、塔吉克斯坦、土库曼斯坦、伊朗、俄罗斯、阿曼等国家(阿地力·沙塔尔等，2008)和地区。据报道，枣实蝇于2007年9月传入我国新疆吐鲁番地区(张润志等，2007; 阿地力·沙塔尔等，2008)。目前国内外对枣实蝇的研究也仅限于形态学的鉴定及生物学习性的研究。因此，研究枣实蝇不同地理种群的亲缘关系来探究其来源，对于检疫和防控工作有很重要的意义。

线粒体DNA COI基因是昆虫分子系统进化应用较多的标记之一，全长大约1 600 bp，其中包含进化较快的可变区和进化速率较慢的保守片段，既可用于系统进化研究，又可用于种类区分或者种下阶元的研究，如引物UEA7与UEA10扩增的序列分别位于两端，变化速率较大适合种内和近缘种间的系统关系研究(Kakouli-Dunrte et al., 2001)。mtDNA COI基因序列在种间表现较大的差异性(Jamnonglik et al., 2003)。目前，COI基因越来越多被应用于实蝇近缘种系统发育研究中，Martha等(2001)扩增了COI基因1 300 bp的片段，分析了按实蝇属(Anastrepha)15个种(包括南美按实蝇的12个近缘种)的系统进化关系(Martha et al., 2001)。Jamnonglik等(2003)利用特异性引物UEA7/UEA10测定mtDNA COI基因部分序列，研究了果实蝇属(Bactrocera)4亚属13种实蝇和泰国本地南瓜实蝇(B. tau)复合种8个成员种间的亲缘关系。

本文研究了检疫性害虫枣实蝇4个不同地理种群的亲缘关系，对4个地理种群的mtDNA COI部分基因序列进行测序，并进行序列分析及不同地理种群系统进化树的构建，分析了4个地理种群mtDNA COI的相似性。

1 材料与方法 1.1 标本来源

枣实蝇蛹标本分别采自4个地区：吐鲁番市、KSS、HSX和HMS，采集地、试验个体数量及采集时间见表 1。

1.2 供试试剂 1.2.1 引物

参照文献(Martha et al., 2001)引用2对引物，送至宝生物工程(大连)有限公司合成，其中can-F和can-R用于质量检测，UEA7和UEA10用于目标片段扩增，如表 2所示。

1.2.2 酶及其他试剂

Takara试剂盒, Taq酶、PCR反应体系试剂(dNTPs、10×buffer和Mg²⁺)、琼脂糖、EB，2 000 bp Ladder Marker均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 主要仪器

高速冷冻离心机(CF16R×Ⅱ型)、定量梯度PCR仪(Biometra)、多功能电泳仪、数字图像分析仪(Alphal220V型)、核酸蛋白检测仪、全自动高压灭菌仪、全温水浴锅、超低温冰箱。

1.4 试验方法 1.4.1 枣实蝇基因组DNA的提取

本研究采用宝生物工程(大连)有限公司研发的Takara试剂盒推荐的方法来提取基因组DNA。

1.4.2 DNA质量检查

枣实蝇DNA提取质量用引物对can-F/can-R来检查。该引物对是专门用于检查实蝇类昆虫模板DNA质量的通用引物，定量梯度PCR仪反应体系包括10 mmol·L^-1 10×Buffer，0.25 mmol·L^-1 Mg²⁺，0.25 mmol·L^-1 dNTP，上下游引物各0.2 μmol·L^-1，1 U Taq酶(Takara)，模板DNA 1 μL，加水至总体积25 μL，反应条件为94 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR反应结束后，分别提取PCR产物5 μL在含溴化乙锭的1.5%琼脂凝胶多功能电泳仪上电泳30 min(90 V)，数字图像分析仪上检测结果，观察扩增带的大小和宽度，确切的DNA浓度通过核酸蛋白检测仪测定。

1.4.3 目标片段PCR扩增

PCR扩增引物和测序引物：目标片段PCR扩增的引物为Uea7/Uea10。

PCR反应体系：PCR扩增在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：10×Buffer 2.5 μL，Mg²⁺ 2 μL，dNTP 2.5 μL，上下游引物各0.2 μL，1 U Taq酶(Takara)0.2 μL，模板DNA 2.5 μL，加水至总体积25 μL。

PCR扩增条件：94 ℃ 5 min，95 ℃ 40 s，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30个循环，最后72 ℃延伸7 min。取PCR产物5 μL在含溴化乙锭的1.5%琼脂凝胶上电泳30 min(90 V)，在数字图像分析仪上检测结果(吴佳教等，2005)。

1.4.4 序列测定与数据分析

1) 测序把PCR产物(未纯化)送至上海宝生物工程有限公司测序。

2) 枣实蝇mtDNA COI基因序列比较将测序结果提交GenBank，通过BLAST方法检索有代表性国外咔实蝇属COI序列(当同一地理种群存在相同序列时，则选取其中1条)，以蔷薇咔实蝇(C. schineri)和樱桃绕实蝇(Rhagoletis cerasi)为外群。用Clustal X多序列对位排列程序将中国枣实蝇不同地理种群和国外同一个科的种群进行对位排列(当同一地理种群存在相同序列时，则选取其中1条)，并辅以人工校对。用MEGA4软件，根据Kimura 2-paramter模型计算出不同地理种群及不同生物型枣实蝇的进化分歧矩阵; 采用Kimura 2-paramter距离矩阵，非加权配对算数平均法(UPGMA)以及邻位法(NJ)构建系统树，系统树各分支地置信度(boostrap)均进行1 000次的重复检验(褚栋等，2005; 林丽莉等，2010)。

2 结果与分析 2.1 DNA质量检查

枣实蝇DNA提取质量用引物can-F/can-R来检查，枣实蝇模板DNA扩增结果见图 1。在600~700 bp之间目标片段的位置有1条扩增带，亮度差异表示模板浓度的差异。DNA确切浓度和纯度通过核酸蛋白检测仪来测定。

2.2 4个地区枣实蝇mtDNA COI基因序列

利用引物Uea7/Uea10分别测定了KSS、吐鲁番、HMS及HSX 4个地区枣实蝇的线粒体DNA细胞色素氧化酶I(COI)从M7至COOH之间约700 bp片段序列，共获得COI基因序列4条，吐鲁番地区枣实蝇和KSS枣实蝇DNA片段长度为666 bp，HSX枣实蝇和HMS枣实蝇DNA片段长度为664 bp，其中吐鲁番枣实蝇序列已经录入GenBank数据库，序列号为HQ687210。

2.3 4个地区枣实蝇同源序列比较分析 2.3.1 COI基因组成

分别对已测定的4条序列的COI基因蛋白编码区662 bp(第1位~662位)进行排列，4个不同地方的枣实蝇COI基因序列碱基组成如表 3所示，mtDNA COI基因的碱基T，C，A，G的平均含量分别为38.2%, 15.2%，32.1%，14.7%。A+T的平均含量为70.3%，吐鲁番地区枣实蝇的A+T含量最高为71.2%，KSS枣实蝇的A+T含量最低为69.4%。由表 3可知吐鲁番地区枣实蝇和KSS枣实蝇DNA片段长度为666 bp，HSX枣实蝇和HMS枣实蝇DNA片段长度为664 bp。

2.3.2 遗传距离

4个不同地区的枣实蝇之间的遗传分化程度用遗传距离的平均值来计算，分别计算了4个不同地区的枣实蝇之间的遗传距离(表 4)，结果显示吐鲁番市枣实蝇与HSX、HMS枣实蝇的遗传距离最近，为0.002;KSS枣实蝇与HMS、吐鲁番市枣实蝇的遗传距离最远，为0.062。通过BLAST方法检索国外有代表性的咔实蝇属mtDNACOI基因序列，其标本名称及其登录号分别为蔷薇咔实蝇C. schineri R248 FJ571365.1，蔷薇咔实蝇C. schineri R141 FJ571364.1，樱桃绕实蝇R. cerasi GQ175823.1与本试验中4个地区的枣实蝇进行比对，结果如表 4所示。

2.3.3 COI基因相似度

对枣实蝇4个地理种群COI基因相似度进行比较(表 5)，其中来自吐鲁番市枣实蝇与HSX、HMS枣实蝇相似度高，分别为99.8%，99.7%，吐鲁番、HSX、HMS枣实蝇与KSS枣实蝇相似度低，分别为94.1%，94.3%，94.1%。与网上公布的序列FJ571364.1、FJ571365.1和GQ175823.1进行比较，HMS枣实蝇和注册号为FJ571364.1蔷薇咔实蝇及GQ175823.1樱桃绕实蝇相似性为96.5%。

2.3.4 根据mtDNA COI序列构建系统发育树

使用邻位(NJ)方法构建系统发育树，系统树各分支的置信度(boostrap)均进行1 000次的重复检验(图 2)(姚廷山等，2009; 2010; 梁亮等，2011)。根据系统发育树同样可以看出吐鲁番市枣实蝇与HSX枣实蝇亲缘关系最近，吐鲁番市枣实蝇和KSS枣实蝇的亲缘关系相对较远。使用UPGMA方法和邻位(NJ)方法构建的系统树的结果相似。由进化树可看出：吐鲁番市、HSX和HMS枣实蝇聚为一支，可推测这3个地区的枣实蝇可能来自同一地区，而KSS枣实蝇从另一地传入。

3 结论与讨论

本研究选择了mtDNA COI基因位于引物Uea7和Uea10之间的片段，从测定的4个不同地区枣实蝇4条mtDNA COI基因序列的比较分析中发现，枣实蝇的COI基因序列中核苷酸组成A+T含量大于G+C含量，平均高出40.6%，结果与以前报道一致，即大多数昆虫mtDNA中A+T含量较高(Lunt et al., 1996; Han et al., 1997)，高A+T含量区域对研究昆虫复合种的进化关系和种类区分十分有用(Lunt et al., 1996)。

本研究测定的4个不同地理种群的枣实蝇，从遗传距离结果来看，吐鲁番市枣实蝇与HSX、HMS枣实蝇的遗传距离最近，为0.002;KSS枣实蝇与HMS和吐鲁番市枣实蝇的遗传距离最远，为0.062。

同源性比较发现：来自吐鲁番的枣实蝇与HSX、HMS枣实蝇相似性高达99.8%，KSS枣实蝇与HMS、吐鲁番市枣实蝇差异性最大，相似度为94.1%。

从新疆4个地区枣实蝇发生时间顺序来看：吐鲁番地区的枣实蝇2007年9月首次发现，HSX的枣实蝇2009年9月发现，HMS的枣实蝇2010年9月17日发现，KSS的枣实蝇2009年8月发现。从这4个地区的地理位置来看：吐鲁番、HSX、HMS这3个地区是相邻近的，相互距离为200 km左右，而KSS离吐鲁番、HSX、HMS等地区距离很远，相距为1 300~1 500 km左右。

从吐鲁番、HSX、HMS这3个地区之间的经济文化交流、人口旅游往来以及枣交易很密切。据笔者调查了解，HMS的红枣是全国有名的品牌红枣，多年以来枣商贩为了牟取更高的经济利益，从而将吐鲁番地区、HSX低价购买的红枣调运至HMS枣交易市场高价出售。HSX的栆实蝇危害程度来看，在交通要道两侧、居民区“四旁”及零星栽植的枣树上发生比较严重。从扩散趋势来看：有从交通要道两侧、居民区向大田扩散的趋势，HMS的枣实蝇在距枣交易市场较近的枣园发生较严重，而离枣交易市场较远的大田发生较轻或没有发生。由此可见，HMS的枣实蝇有以枣交易市场为中心往四周的枣田扩散的趋势。

从KSS的枣实蝇口岸截获情况和扩散趋势来看，2008年12月25日新疆维吾尔自治区对外检验检疫局在吐尔尕特口岸从吉尔吉斯坦引进的30 t红枣中截获过枣实蝇。据笔者调查，KSS的枣实蝇是从城市居民区房前屋后零星栽植的枣树上开始发生，并呈现出逐渐向近郊区的新建枣园扩散的趋势，KSS较远的老枣园中均没有发现枣实蝇。

将上述4个不同地区采集的枣实蝇蛹样本的一部分羽化为成虫后，对其进行形态学性状进行观察、测量、比较和数值分类分析(该内容在另一篇论文中具体论述)发现：4个分类单元聚集为2个组群。其中，吐鲁番、HSX、HMS为一个组群，KSS的枣实蝇独立为一个组群。从形态上的特异性性状对比发现，KSS枣实蝇胸部两侧的4个黑色斑点相互分离的很明显，这与张润志等(2007)描述的特征一致，吐鲁番、HSX、HMS枣实蝇胸部两侧的第3，4个黑色斑点相互连到一起，近似于3个黑色不规则斑点。此外，吐鲁番、HSX、HMS枣实蝇组群背部棕黄色绒毛直接连接了7个黑色斑点，而KSS的枣实蝇背部绒毛则与9个黑色斑点直接相连。

由以上基因序列测序的数据及进化树，结合以上4个地区枣实蝇发生的时间顺序、地理位置、经济文化交流、人口旅游往来、枣交易行为、枣实蝇各地的扩散趋势和口岸截获的情况以及形态学数量性状和特异性性状的比对分析，可以初步确认吐鲁番、HSX和HMS枣实蝇来自同一地区，而KSS枣实蝇从另一地区传入。

本研究仅针对枣实蝇mtDNA COI基因片段进行测序，并进行了序列比较和系统发育分析，而以上4个地区的枣实蝇不同地理种群是否已经出现遗传分化、分化程度如何等一系列问题有待进一步深入研究。同时将mtDNA COⅡ、COIII、ND1、Cytb、ND5与ITS区结合起来研究亲缘关系密切的种、亚种和地理变异，也有待深入。