树木木材形成即次生维管系统发育的分子基础近年来逐渐成为树木分子生物学研究热点。研究木材形成的分子机制对林木遗传育种意义重大，但鉴于木材生长周期较长、基因组遗传背景复杂等原因，难以分离到树木维管发育的突变体。拟南芥(Arabidopsis thaliana)作为一种草本植物，因其生长周期较短，本身并没有次生生长；但在次生诱导生长条件下，拟南芥维管发育会有一定数量的次生生长，产生的次生维管结构在显微和超显微水平与木本植物都很相似(Busse et al., 1999；Ye, 2002)。Chaffey等(2002)利用调节光周期和温度的方法、Ko (2004)通过重压方法来促进拟南芥形成层的发育，发现下胚轴中的木质部结构与杨树的木质部结构极为相似；近年来发现一些在木本植物和草本植物维管形成层中存在共同的调控因子，表明不同物种间维管发育可能存在保守的调控机制(Zhang et al., 2011)。因此借助拟南芥作为模式植物的优势，利用拟南芥维管发育突变体鉴定的基因研究木本植物同源基因在次生维管系统发育中的功能，已经成为一种可行的思路。

图位克隆是目前分离基因的一种有效方法，它是一种基于突变体表型鉴定及突变位点遗传与物理图谱基础上的基因克隆方法(Peters et al., 2003)，属于正向遗传学范畴(Alonso-Blanco et al., 2009)。它的主要原理是根据目的基因和分子标记之间的连锁关系进行基因定位，通过渐进排除基因组的其他无关部分，逐步缩小包含突变基因的染色体或者DNA片段。拟南芥全基因组序列的测定和分析的完成(Arabidopsis Genome Initiative, 2000)，以及拟南芥中可用的分子标记的剧增(Lamesch et al., 2012)，使得通过图位克隆技术在1年或者更短的时间内克隆出突变基因成为可能(Lukowitz et al., 2000)。图位克隆技术依赖于高密度的分子标记图谱，随着许多高密度遗传图谱的不断获得，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记成为实现基因图位克隆的关键。通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记可以判断目标基因是否存在，或将控制某一性状的多个基因剖分开来，进而确定目标基因所在的基因组DNA片段。在分子标记辅助选择育种、遗传多样性和种质资源的管理与评价等方面，筛选与目标基因紧密连锁的分子标记也是非常重要的一个环节。

本课题组前期研究筛选到1个维管发育的拟南芥突变体，命名为尾翼茎(tail fins on stem, tfos)。该突变体相对野生型植株，最明显的特征是在短日照条件下，在茎中下部侧面有脊状结构附着，并伴随发育迟缓、营养生长时期延长、莲座叶片边缘有缺刻等表型，而长日照下这些表型基本消失。脊状结构组织切片显示其内部有类似导管分子结构，推测该基因可能与维管组织分化相关，找出该性状的控制基因有助于加深对植物维管结构发育的认识。本文对该突变体进行了背景纯化和遗传分析，利用传统的分子标记把突变基因定位到拟南芥1号染色体上，并与SSLP标记F11A17-48074紧密连锁，为该维管发育相关基因的克隆和功能分析奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 拟南芥材料

野生型拟南芥材料生态型Columbia(Col)和Landsberg erecta (Ler)由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室保存。拟南芥突变体从购自英国诺丁汉拟南芥突变体资源中心(NASC, Nottingham Arabidopsis Stock Center)的一批突变体筛选而来，为Col生态型。

1.1.2 PCR试剂和引物

PCR所用试剂和Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。毛细管电泳所用高分辨率胶和Size Marker购自QIAGEN公司。所用分子标记参考Hou等(2010)文献中报道的序列，或根据孟山都公司公布的拟南芥Col和Ler之间的INDELs (http://www.arabidopsis.org/browse/Cereon/)，利用Primer 3在线软件(http://frodo.wi.mit.edu/)设计SSLP引物。本试验所用的部分引物序列见表 1，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 方法 1.2.1 拟南芥的次生诱导培养

拟南芥野生型和突变体种子用3%次氯酸钠表面消毒处理后播种于1/2MS培养基(pH5.7)平板上，4 ℃低温暗培养3天后移至Percival拟南芥培养箱中，温度设定为(21±1) ℃，光照强度4 000 lx，每天8 h光照/16 h黑暗进行次生诱导培养。种子萌发2周后移栽到培养基质(草炭土:蛭石=3:1)中继续进行次生诱导培养，3个月后移至长光照(16 h光照/8 h黑暗)环境。

1.2.2 表型观察和石蜡切片观察

在拟南芥次生诱导培养过程中，定期观察记录并拍照。待植株发育成熟后，分别取野生型和突变体茎基部和下胚轴，置于FAA固定液(50%酒精，5%乙酸，3.7%福尔马林，5%甘油)抽气10 min并固定至少24 h，石蜡切片参照Qin等(2007)方法，切6~8 μm厚度，脱蜡后用0.25% (W/V)的TBO(Sigma-Aldrich)染色，在蔡司AXIOIMAGER A1显微镜下观察、拍照。

1.2.3 突变体的遗传分析和作图群体构建

以突变体为母本、野生型Col为父本回交得到T₁代，其自交后代T₂代表型将产生分离，次生生长条件下诱导4周后，观察、记录并统计T₂代突变表型和野生型表型的比例。以突变体为母本、野生型Ler为父本杂交得到F₁代，收集F₁自交后代中有突变表型的F₂代植株作为图位克隆作图群体。从7 335株F₂群体中，筛选出828株具有明显突变表型的植株用于作图。

1.2.4 基因组总DNA提取

选取作图群体单株嫩叶，用简易快速的CTAB法(Stewart Jr et al., 1993)提取作图群体基因组DNA，同时提取2个野生型Col-0和Ler DNA作为扩增对照。

1.2.5 PCR扩增和电泳检测

PCR反应体系20 μL中成分：10×PCR buffer 2 μL(预混20 mmol·L^-1 Mg²⁺)，dNTP 1.6 μL (2.5 mmol·L^-1)，上、下游引物各0.8 μL (10 μmol ·L^-1)，DNA模板0.8 μL(约50 ng)，酶0.16 μL(10 U·μL^-1)，ddH₂O 13.84 μL；反应程序：(95 ℃ 30 s，47~52 ℃15 s，72 ℃ 30 s)，30个循环。PCR产物添加3.5 μL 6×溴酚蓝混匀后吸取10 μL，用3%琼脂糖凝胶进行电泳，EB染色后拍照分析；或者直接在全自动毛细管核酸分析仪(QIAGEN)上，用系统自带软件Biocalculator^TM，根据PCR产物浓度选择合适的分离方法，分析结果并输出凝胶电泳模拟图。

1.2.6 与性状紧密连锁分子标记的验证

进一步分离F₁自交后代有突变表型植株，提取DNA，用筛选到的与突变表型紧密连锁的分子标记进行验证。从300株F₂代个体中筛选出45个有明显突变表型的个体用于作图。根据标记检测定位群体的分离数据，用MAPMAKER(EXP3.0b)作图软件进行连锁分析，利用Kosambi函数将重组率转化为遗传距离(cM)。

2 结果与分析 2.1 tfos突变体的获得和表型分析

杨海峰等(2011)利用拟南芥ATH1基因芯片对毛白杨(Populus tomentosa)次生维管剥皮再生过程进行分析，筛选出差异表达显著的基因，在TAIR(http://www.arabidopsis.org)上搜索并购买对应基因的拟南芥T-DNA插入突变体，进行短光照次生诱导后，筛选到1个茎中下部有脊状结构附生的突变体，经过多代种植，确定该表型稳定遗传，并将其命名为tail fins on stem(tfos)。

与野生型相比，该突变体生长缓慢，在1/2MS培养基上，野生型长出4片真叶时(图 1A)，tfos刚长出2片真叶(图 1B)。移栽后，突变体营养生长时期延长，当野生型已经完成抽薹并开始结种，tfos花茎则刚开始抽薹；莲座叶叶片边缘缺刻严重，呈锯齿状，叶表面有一定程度的皱缩和扭曲(图 1D)；在茎中下部有数条脊状结构附着(图 1F, G)，每条脊结束于其相连的茎生叶的边缘(图 1G)；突变体成熟植株分枝数量较多，并且有一定程度的矮化(图 1H)，平均高度比野生型矮5 cm。

2.2 突变体显微切片观察

为了确定突变体茎内部维管结构是否也发生了变化，对野生型和突变体茎基部部位和下胚轴取材进行石蜡切片和半薄切片染色观察。结果如图 2显示，正常野生型茎基部横切面外围轮廓呈规则的圆形(图 2A)，而突变体则在表皮的外围出现数条脊状突起(图 2B)。杨海峰等(2011)通过对脊状突起的切片荧光观察，发现在突起部位中的细胞团的自发荧光要明显比周围细胞强，说明该细胞团内部有着细胞壁加厚的细胞，可能存在管状分子等细胞。脊的纵切观察也显示，在其中心部位，部分细胞排列紧密，有类似管状分子的存在(图 2C)；突变体(图 2E)和野生型(图 2D)的下胚轴则没有这种表型。

2.3 tfos突变体的遗传分析

通过杂交试验来检测tfos是否受单一基因控制。将tfos与Col野生型回交，其T₁代植株的表型表现正常，T₂代植株可以明显地区分为正常野生型和突变表型2种；110个T₂代个体里，正常植株和突变体表型植株的比例是84:26，经卡方(χ²)检验，其分离比符合孟德尔分离比3:1(P>0.5)(表 2)，表明控制该表型的基因为单隐性基因或者少数几个基因。为了进一步确认这一结论，随机挑选5株T₂代中正常表型植株种植并观察其子代T₃代的分离比。3个单株的子代(T₃-2, T₃-3, T₃-5)发生了表型分离，正常表型植株和突变表型植株个体数之比分别为62:19，62:16和44:13，卡方检验结果均符合孟德尔单基因分离规律(表 2)，从而确定tfos为单基因隐性突变控制。

2.4 突变基因的定位

对tfos突变体与Ler野生型杂交获得的F₂代群体进行遗传分析和分子标记连锁分析。首先利用Hou等(2010)设计的基本均匀分布在拟南芥5条染色体上的25个分子标记进行TFOS基因的粗定位。在种植的600株F₂代粗定位群体中，筛选到突变表型明显的个体114株。图 3列出了部分突变个体在拟南芥5条染色体上不同位点分子标记的检测结果(图 3A, B, C, D, E)，在1号染色体16.53 Mb位置(图 3A)，114个突变个体用该位置SSLP分子标记F28H19-5434扩增，89个个体为Col带型，25个为杂合子带型，推测TFOS基因可能与该分子标记连锁。

从16.53 Mb两侧寻找突变发生的位置。在14.1 Mb附近，114个体中，87个扩增条带为Col带型，27个为重组子带型；在17.39 Mb(Marker T3F24-5717)位置，重组子减少为4个；在18.16 Mb (Marker F27J15-5969)附近，重组消失，全部为Col带型；而在18.60 Mb(Marker F14I3-6115)位置，又出现3个重组子。由此可以推定突变位点发生在1号染色体17.39 Mb和18.60 Mb之间，即SSLP分子标记T3F24-5717和F14I3-6115之间，与它们的遗传距离分别为1.75 cM和1.32 cM。

2.5 与TFOS基因紧密连锁标记的确认

扩大作图群体，分离到714个F₂代突变个体，在1号染色体17.39 Mb和18.60 Mb之间利用合适的SSLP引物，寻找与突变位点更紧密连锁的分子标记。结果显示，分子标记F21D18-5824产生了2个单交换，而T1N15-5886产生了1个单交换，从而最终将TFOS精细定位在分子标记F21D18-5824和T1N15-5886之间，遗传距离分别为0.14 cM，0.07 cM。在此区间设计新的SSLP标记F11A17-48074(表 2)，挑选后续分离到的46株F₂代突变个体，没有检测到交换发生(图 4A, B, C)，确定TFOS基因和F11A17-48074紧密连锁。

3 结论与讨论

近几年，随着拟南芥和杨树(Populus)全基因组测序的完成，以及先进研究手段的建立与成熟，人们对植物维管组织的建立与分化在分子水平上有了进一步的认识，采用拟南芥突变体来研究维管系统形态建成过程中所涉及的基因及其调控等方面取得了显著进展，如转录因子HD-ZIP Ⅲ基因家族在植物维管组织极性排列中的决定性作用即是首先利用拟南芥通过正反向遗传学分析手段发现的(Emery et al., 2003；Juarez et al., 2004；Zhou et al., 2007)，并且杨属植物中该家族的同源基因和拟南芥具有大致相同的调控功能(Zhao et al., 2005；Ko et al., 2006；Du et al., 2011)。

本课题前期研究利用拟南芥全基因组芯片(Wang et al., 2009)，通过研究拟南芥维管发育系统来研究木材形成过程有关基因的功能，为加快揭示树木维管发育分子机制提供了一条便捷途径。在利用该系统研究维管发育过程中，作者筛选到一个维管发育异常的拟南芥突变体，该突变体在茎的中下外围附生有1到4条不等的脊状结构(图 1F, G；图 2B)，纵切脊状结构显示其内部有管状分子细胞(图 2C)，说明次生诱导对突变体维管发育产生了很大影响。而且在长日照条件下(16 h光照/8 h黑暗)，tfos和野生型相比，茎中下部脊状突起、生长延迟和矮化等表型基本消失，莲座叶边缘缺刻也不明显(数据未显示)。由于短日照可以促进维管组织的发生(Chaffey et al., 2002)，因此，一定程度上TFOS参与了次生诱导条件下拟南芥维管的发育。

如果突变是由T-DNA或者转座子插入引起，插入序列会提供一个直接指向基因的标签，但研究发现，来自英国诺丁汉拟南芥突变体库中心的T-DNA插入突变体tfos(突变体号为Salk_053109，插入位点为AT2G44110)，突变体表型并非T-DNA插入位点基因失活导致(杨海峰等，2011)，而可能是其他基因的突变引起。除了化学诱变、辐射等原因，自然界还存在大量的自发突变。这种突变除了定位克隆之外，没有更好的选择。本研究利用传统的分子标记，成功地把TFOS定位到1号染色体SSLP标记F21D18-5824和T1N15-5886之间约190 kb的区域，并与F11A17-48074共分离，为进一步克隆该基因打下了基础。

维管组织发育和分化的分子网络极其复杂，从开始出现原形成层束到最终形成具有特化细胞的木质部和韧皮部组织，由一系列与细胞分化和调节相关基因的表达而实现，任何方面的不正常都会造成生长发育障碍并形成突变表型。本文研究发现tfos在茎基部维管发育出现异常的同时，还伴随着莲座叶叶片边缘缺刻、发育迟缓、植株矮化等特性，说明TFOS在控制维管发育的同时，还影响了植株生长发育的多个方面。这表明该基因能够调控不同组织的发生和发育，处于调控网络的上游。对TFOS基因的克隆及功能鉴定，并确定其参与的分子调控途径，不但对进一步深入研究该基因在拟南芥维管发育中的作用，以及维管发育和其他器官发育过程的相互关系有重要意义，而且为研究木本植物同源基因的表达模式和功能打下基础，为揭示维管系统的调控提供依据。