文章信息
- 沈明月, 章启元, 朱仲良, 孙小苗
- Shen Mingyue, Zhang Qiyuan, Zhu Zhongliang, Sun Xiaomiao
- 基于HPLC技术及模式识别方法鉴别4种红木
- HPLC and Pattern Recognition for the Identification of Four Species of Hongmu
- 林业科学, 2012, 48(5): 168-172.
- Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(5): 168-172.
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文章历史
- 收稿日期:2011-04-29
- 修回日期:2011-06-23
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作者相关文章
2. 上海市木材工业研究所 上海 200051
2. Shanghai Wood Industry Research Institute Shanghai 200051
自明清以来,红木家具以其温润典雅的气质,一直深受人们喜爱。红木是中国人约定俗成的名称,无对应英文标准名称,故暂采用汉语拼音“Hongmu”(GB/T 18107—2000)。可以说,红木一词,承载了中国几百年的文化思想,红木家具也成为一种重要的文化载体,以其源远流长的历史、古色古香的韵味以及丰富的内涵享誉古今中外。红木绝大多数原产于东南亚、热带非洲及拉丁美洲,中国的红木98%以上依赖进口(王卫斌,2003)。近年来,随着红木资源越来越匮乏,红木价值越显珍贵,价格也随之攀升; 此外,越南、老挝等红木原料产国加大力度限制红木的采伐,也同样助长了红木价格的上涨(长江商报数字报,2011)。在这样的背景下,红木家具的收藏者与投资者越来越多,仿造、伪造等投机手段也随之不断出现,不仅给消费者与收藏家带来了严重困扰,也扰乱了市场秩序(王树谷,2003; 王晓慧,2010)。所以,如何准确鉴别红木,成为十分重要的问题。
2000年,国家质量监督检验检疫总局颁布了《红木》标准(GB/T 18107—2000), 将红木分为5属8类33个树种,对规范红木市场起到了重要作用。目前国内关于红木鉴别的文献(罗良才,2000; 谭秋祝等,2005; 姜笑梅,2010)多采用传统的木材识别和区分方法,即主要以简便实用的宏观特征(如密度、结构、材色和纹理等)为依据,辅以必要的木材解剖特征来确定其属种; 但是传统方法往往需要依靠良好的“硬件”与“软件”条件,即正确定名的木材标本、很多烦琐的工具和步骤以及有经验的专业人员(任洪娥等,2007)。所以寻求一种快速简便而又准确的鉴别手段是很有必要的。而随着现代仪器分析技术与计算机的结合,使这种想法成为可能。国外对红木及类似木材的研究,主要集中在其药用价值方面(Tchmadeu et al., 2011)。而Kite等(2010)则利用LC-MS,NMR及SIEVE软件确定出2种标志性物质Dalnigrin和假靛黄素(pseudobaptigenin), 为鉴别巴西黑黄檀(Dalbergia nigra)及亚马逊黄檀(Dalbergia spruceana)提供了有力证据。研究发现Dalnigrin只在巴西黑黄檀中出现,而在另外15种木材,包括亚马逊黄檀中并未出现。另外,在亚马逊黄檀中也检测出了一种巴西黑黄檀中没有的化合物假靛黄素。
作为一种从整体上研究复杂物质体系的技术工具(田润涛等,2006),化学指纹图谱已广泛应用于中药(Wang et al., 2011; Yang et al., 2011)、茶叶(Wang et al., 2008; Dumarey et al., 2010)等天然产物的分析中,并成为国际公认的控制中药或天然药材质量的最有效手段(范骁辉等,2006)。对于木材判别,木材色谱指纹图谱也成为一种高效、可靠的方法。目前,国内将指纹图谱用于木材这一天然产物的报道还较少,可以说用指纹图谱来鉴定木材在国内仍处于刚起步阶段(周佳璐等,2006; 孙多永,2009; 李艳艳等,2010)。
本文选用花梨木及黑酸枝木探索了红木HPLC指纹图谱的构建。花梨木与黑酸枝木在木材结构、心材颜色等方面有一定的相似之处,非业内人士在鉴别这2种红木时可能会产生误判。本文成功建立了2类4种红木的指纹图谱,并分别采用相关系数法、系统聚类法及PCA投影法对各样本指纹图谱的相似度进行了考察,以此探索化学指纹图谱在不同红木的验证及判别方面应用的可行性。
1 材料与方法 1.1 材料试验样品来自上海市木材产品质量监督检验站(上海木材工业研究所)。按照《红木》标准(GB/T 18107—2000),可分为2属2类4种红木,共18个样本,样本具体信息见表 1。
1) 仪器与装置 高效液相色谱仪(Agilent 1100系列,配有在线真空脱气机、四元泵、二极管阵列检测器、手动进样器、ChemStations色谱工作站); 超声波发生器(B5200S-DT型); Millipore Express纯水系统; 分析天平(Mettler AE 163); 0.5~5 mL移液器(Thermo)。
2) 试剂 甲醇、乙腈(HPLC级,Fisher Scientific); 超纯水(自制)。
3) 色谱条件 色谱柱:UltimateTM XB-C18 (150 mm ×4.6 mm,5 μm); 流动相:乙腈(A)-水(B)进行梯度洗脱:8%~23% A(0~20 min),23% A(20~33 min),23%~30% A (33~43 min),30%A (43~53 min),30%~38% A(53~69 min),38% A (69~76 min),38%~49% A (76~91 min),49%~ 70% A (91~106 min),70% A (106~108 min); 流速:1 mL·min-1; 检测波长:290 nm; 柱温:25 ℃。
4) 样品处理 称取红木心材部分木屑0.2 g(精确至0.001 g),置于50 mL锥形瓶中,加入5 mL甲醇、5 mL高纯水,超声提取5 min,滤纸过滤,再以0.45 μm的微孔滤膜过滤后备用。
5) 样品测定 将待测红木样本提取液,进样20 μL,按上述中色谱条件分析测定,采集108 min色谱数据。
6) 数据分析 对4种红木HPLC色谱指纹图谱进行数字化处理,其具体过程为:将经过峰面积积分的色谱数据,根据保留时间进行色谱峰对齐。其原则为同一组分在不同样本中保留时间一致,避免色谱峰漂移影响分析结果; 某一样本的特有峰,其他样本的相应保留时间补为0(Wang et al., 2005)。在数字化指纹图谱的基础上,本文采用相关系数法对指纹图谱进行相似度评价,并进一步利用系统聚类法及主成分分析法进行模式识别,其结果能够更加直观地体现样本间差异(柴逸峰等,2006)。
2 结果与分析 2.1 试验条件优化1) 检测波长选择 根据Agilent仪器软件中的全波长紫外波长吸收(190~400 nm)三维光谱信息图,可初步确定检测波长。比较几个具体波长的HPLC色谱图,可进一步确定合适的检测波长。试验表明:红木样本中提取物大部分在200 nm附近有最大吸收峰,但考虑到天然产物提取液组成比较复杂,而在低波长范围内杂质吸收较多,HPLC达到基线分离困难,且会造成较为严重的基线漂移,所以选择第2大吸收峰290 nm处作为检测波长。
2) 流动相选择 先后考察了甲醇-水系统及乙腈-水系统作为流动相。结果显示,若使用甲醇-水系统,提取液中低极性物质难以分离,造成较严重的基线漂移; 乙腈-水系统在乙腈比例为8%~70%范围内,能够实现提取液中多种组分的有效分离,且峰形良好,基线稳定。因此,最终选择乙腈-水体系作为流动相。
3) 色谱柱选择 先后比较了UltimateTM AQ-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)、UltimateTM XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)、UltimateTM XB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm) 3种色谱柱对红木提取物的分离情况。使用UltimateTM AQ-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)柱时,强极性物质有拖尾现象,且小峰分离度差,影响整体分离效果; 使用UltimateTM XB-C18(150 mm×2.1 mm, 5 μm)柱时,残留较多,会造成样本间干扰; 而使用UltimateTM XB-C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱可避免上述2个问题,并能达到较好的分离效果,因此,最终作为本文试验的分离色谱柱。
4) 前处理条件优化 试验分别对以下前处理条件进行了比较与优化:冷提法与超声提取法、不同提取溶剂(甲醇、乙腈)、不同甲醇比例的提取液(0%,30%,50%,70%,100%)、不同木材质量(0.1,0.2,0.4,0.6 g)。最终选择0.2 g红木、50%甲醇为溶剂的超声提取法为本文的提取方法。
2.2 方法学考察1) 精密度试验 取同一红木样本提取液,平行测定5次,分别计算5张色谱图之间的相关系数,结果都大于0.99,说明仪器的精密度良好。
2) 重现性试验 按照上述样品处理方法,在同一红木样本不同部位取样,制备5份提取液,进样测定,并分别计算5张色谱图的相关系数,结果都大于0.95,说明方法重现性好。
3) 稳定性试验 取同一红木样本提取液,分别放置0,2,4,6,24,48 h后进行测定,分别计算6张色谱图的相关系数,结果都大于0.98,说明提取液在48 h内稳定性较好。
2.3 试验结果1) HPLC色谱指纹图谱的建立 将18个红木样本按上述色谱条件进行进样分析,采集色谱数据,得到4种红木色谱指纹图谱(图 1)。从图中可以看出,4种红木特征明显,各有1个或者几个易区分于其他红木的特征峰。
大果紫檀木材提取液颜色比印度紫檀要浅很多,但二者的色谱图十分相似,在11,13和90 min处有共有峰。二者区别在于:相对于大果紫檀来说,印度紫檀提取液中含有更多组分,在谱图上表现为在8.5,10,61,71和80 min处各有一个明显的色谱峰,大果紫檀色谱图上未出现; 且印度紫檀在90 min处色谱峰明显强于大果紫檀,表明印度紫檀提取液中该物质含量更多。
东非黑黄檀的色谱峰多集中于10~70 min,其特征峰在42,55,60,68 min处。卢氏黑黄檀的特征峰在45,48,69,76,93 min处。
因此采用HPLC法构建红木指纹图谱,可以直观地将不同种红木区分开来。对于外观十分相似,在市面上易混淆的红木,如卢氏黑黄檀与印度紫檀,其HPLC指纹图谱可提供比较可靠的鉴别依据,即红木提取液中不同物质的保留时间及色谱峰的相对强度。
2) 相关系数计算 相关系数是评价指纹图谱相似度的指标之一(田润涛等,2006),可以确定变量之间是否存在相关关系。相关系数的大小可直接地反映样本间相似度,也可作为红木鉴别的指标之一。
本文运用Excel中CPRREL函数计算了18个红木样本峰面积之间的相关系数,结果见表 2。从表 2可见,同种红木样本间相关系数均大于0.81,不同种红木样本间相关系数小于或等于0.21,表明不同种红木样本间微弱相关。该结果进一步验证了采用HPLC指纹图鉴别木材的可靠性。
3) 系统聚类分析 聚类分析通过衡量样本间的距离来判断样本间相似性(许禄等,2004)。本文利用Matlab软件对4种红木样本进行系统聚类,结果见图 2。由图 2可知,同种红木可以明显聚类,2种花梨木也可聚为一大类,2种黑酸枝木无法聚类。所以,利用系统聚类法可以比较好地实现种间聚类,但在类间聚类时可能会有偏差。这可能是由于《红木》标准中的分类依据是从木材解剖学的角度出发,而本文所构建的指纹图谱,其着眼点为红木生物代谢产物化学特征的分析与质控模式的研究(田润涛等,2006)。不同种红木中的化学成分因受到广泛因素综合影响,必然客观存在着一定甚至是较大程度的差异, 导致其提取液中化学成分可能存在差异。该结果也表明,从化学成分出发,对于不同种红木的鉴别是可行的。
4) 主成分分析 主成分分析是一种多元统计分析技术,其目的是将数据降维,以排除众多化学信息共存时相互重叠的信息。经变量转换后得到几个能够尽可能多地表征原变量数据结构的新变量,由这些新变量来表征样本(许禄等,2004)。本文对18个样本进行主成分分析,选择第1主成分PC1和第2主成分PC2在二维坐标系统中显示变量,得到投影图见图 3。分析图 3,得到如下结论:
1) 18个样本聚集成为4种,同种红木样本间聚类效果明显,其中卢氏黑黄檀的4个样本几乎完全重叠; 而在HPLC色谱图上比较相似的印度紫檀和大果紫檀,在PCA图上也实现了较好的区分。
2) 该投影图直观地反映出了样本间的相似度,4个样本分布在3个区间,其中印度紫檀与大果紫檀在同一区间且距离相近,表明二者相似度更高。从整体上看,花梨木与2种黑酸枝木之间区分比较显著。
3 结论与讨论本文从红木的化学成分出发,成功构建了木材提取液的HPLC色谱指纹图谱。通过谱图比较,发现本文所研究的每种红木都有明显区别于另外3种红木的特征峰,因此,可根据这些峰鉴别这4种红木。以色谱指纹图谱为基础,将谱图信息转化为数字信息,并利用相关系数法对指纹图谱的相似度进行考察,结果显示,同种红木间相关系数大于0.98,不同种红木间小于0.21。该结果从数值上体现了红木样本间的相似度。
进一步利用模式识别方法中的系统聚类法及PCA投影法,对4种红木进行了有效聚类及区分,其中花梨木类(印度紫檀与大果紫檀之间)能够实现较明显的类间聚类。聚类分析结果能够更加直观地反映出4种木材的相似度。
综合考察目前已经建立的红木色谱指纹图谱,虽然已经实现了较显著的鉴别效果,但为了提高该法的适用面和准确度,应增加采集的红木样本种类及数量,扩大考察的范围及深度,使试验结果能够趋近并反映研究对象的真实内在质量,最终构建普遍适用的红木HPLC化学指纹图谱,并使其成为红木真伪鉴定及质量监控的有效手段之一。
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