林业科学  2012, Vol. 48 Issue (5): 150-153   PDF    
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陈丽培, 王国霞, 沈永宝
Chen Lipei, Wang Guoxia, Shen Yongbao
油松种子萌发初始阶段的呼吸代谢
Respiratory Metabolism of Pinus tabulaeformis Seeds at the Initial Germinating Stages
林业科学, 2012, 48(5): 150-153.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(5): 150-153.

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收稿日期:2009-03-24
修回日期:2012-02-20

作者相关文章

陈丽培
王国霞
沈永宝

油松种子萌发初始阶段的呼吸代谢
陈丽培1, 王国霞1, 沈永宝2    
1. 郑州师范学院 郑州 450044;
2. 南京林业大学森林资源与环境学院 南京 210037
关键词:油松    种子萌发    呼吸代谢    酶活性    
Respiratory Metabolism of Pinus tabulaeformis Seeds at the Initial Germinating Stages
Chen Lipei1, Wang Guoxia1, Shen Yongbao2    
1. Zhengzhou Normal University Zhengzhou 450044;
2. College of Forest Resources and Environment, Nanjing Forestry University Nanjing 210037
Abstract: The seeds of Pinus tabuliformis were cultivated at (25±1) ℃ in an incubator and the respiratory rate, activities of PGI, MDH and G-6-PDH and 6-PGDH of the seeds were measured to investigate changes in respiratory intensity and pathways during the initial germinating stages.The results showed that changes in the respiratory rate could be divided into three stages:rapid increase, stagnation and rapid increase again.The rapid increase stage occurred at the first 27 h, and the respiratory rate rose from 0.5 μmol·g-1min-1 to 12.79 μmol·g-1min-1.Within the following 18 h, respiratory rate was basically stable ranged from 12.79 to 13.55 μmol·g-1min-1.After 45 h incubation, the seed respiratory rate rapidly increased again.When the radicle emerged, the second peak value of respiration was 20.23 μmol·g-1min-1.Activities of all respiratory enzymes increased during the initial germinating stages.The PGI activity increased rapidly and reached to the maximal value of 52.25 OD·g-1DW in 27 h, and then decreased rapidly.MDH activity did not change obviously in the first 36 h, and afterwards increased to a peak value of 30.84 U·g-1min-1 in 72 h.The G-6-PDH and 6-PGDH activity increased slowly from 21.6 U·g-1min-1 to 29.04 U·g-1min-1 in the first 36 h, thereafter, the activity increased rapidly and reached to a peak value of 57.9 U·g-1min-1 with radicle emergence.In conclusion, respiratory metabolism pathways at the early stages of incubation were mainly EMP and PPP, especially EMP pathway.Whereas, during the late stages, EMP, TCA and PPP pathways coexisted, and PPP pathway was predominant.
Key words: Pinus tabulaeformis    seed germinating    respiratory metabolism    enzyme activity    

呼吸代谢是一切生物所共有的生理功能, 其重要作用是释放能量供各种代谢的需要。种子萌发过程中糖氧化降解是通过呼吸代谢途径进行的, 胚乳中的糖需经氧化分解才能为胚的生长提供可利用的能量, 并为新器官、新组织的形成提供重要原料(傅道昭, 1980)。种子萌发过程不同的呼吸代谢途径为胚的生长提供不同的能荷和还原力, 呼吸代谢途径及强度的转变影响种子萌发的正常进行, 因此研究种子萌发过程中呼吸代谢具有重要的意义。过去, 人们对种子萌发初始阶段, 即干燥种子吸水至胚根突破种壳阶段(郑光华, 2004)呼吸代谢有一些研究, 如水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)等种子的顺利萌发是糖酵解途径转变为磷酸戊糖途径, NADH转变为NADPH所致(侯夫云, 2005)。而野燕麦(Avena fatua)、莴苣(Lactuca sativa)等种子在萌发过程中表现出相似的情况(郑光华, 2004)。这些研究更多是针对农作物的呼吸代谢, 而对木本植物的研究很少。本研究以油松(Pinus tabulaeformis)种子为试验材料, 通过探索种子萌发初始阶段呼吸强度及代谢途径的变化, 进一步了解呼吸代谢在萌发初始阶段的作用。

1 材料与方法 1.1 种子来源

油松种子由河北省承德市林木种苗管理站提供。种子采集时间为2007年11月, 其千粒质量为40.85 g, 含水量为9.09%, 发芽率为90%。

1.2 种子培养

将新采集的种子风选后均匀撒播于铺有湿润脱脂棉的发芽盒中, 其上用湿润脱脂棉覆盖, 置于(25±1) ℃培养箱中培养。从置床开始, 每9 h分别取出适量种子样品, 用于呼吸速率及氧化途径关键酶活性的测定。呼吸速率测定后的种子, 剥出胚乳, 并将胚乳用密封袋密封, 放入-76 ℃的超低温冰箱以备氧化途径关键酶活性的测定。种子“露白”(胚根刚突破种壳)时取样结束。取样结束时有85%的种子已“露白”。

1.3 测定方法

1) 呼吸速率的测定在种子培养过程中, 按1.2方法, 每次取100粒种子, 用吸水纸吸干其表面的水分, 放入棉纱布中, 用美国LI-COR公司生产的LI-6400光合作用呼吸仪来测定种子的呼吸强度。

2) 氧化途径关键酶活性的测定以胚乳为材料进行呼吸代谢关键酶活性的测定。磷酸己糖异构酶活性、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶联合酶活性的测定均参考浦新春等(1994)的方法; 苹果酸脱氢酶活性测定参考黄学林等(1990)的方法。各指标测定均取3次重复(计算其平均值)。

2 结果与分析 2.1 种子呼吸速率的变化

种子萌发是一个需能的过程, 充足的能量才能保证代谢的顺利进行。一般情况下, 种子萌发过程呼吸代谢不断增强, 油松种子也不例外(图 1)。油松干种子的气体交换处于极低水平, 其呼吸速率仅为0.50 μmol·g -1min -1, 但随着种子含水量的增加, 酶系统不断修复、活化, 原本“静止状态”的种子呼吸速率明显加强。培养最初的27 h, 呼吸速率上升较快, 至培养27 h时, 呼吸速率达到12.79 μmol·g -1min -1, 是干种子的25.6倍。这可能是干种子吸水膨胀后, 与柠檬酸循环及电子传递链有关的线粒体酶系统活化有关(Huang et al., 2003)。在培养27~45 h期间, 呼吸速率变化平缓, 基本保持在12.79~13.55 μmol·g -1min -1。此时预存的酶系统均已活化, 种子的含水量渐近饱和, 细胞间隙充满水, 含氧较少, 呼吸速率处于相对稳定的水平。但在45 h之后, 呼吸速率又大幅度升高, 并于培养72 h达到最高值20.23 μmol·g -1min -1, 是干种子的40.4倍。这可能是因为该段时间胚细胞开始分裂增长, 胚轴不断伸长生长, 而这些过程均需要大量的能量, 呼吸作用随之迅速升高。

图 1 油松种子萌发初始阶段呼吸速率的变化 Fig.1 Changes of respiratory rate of P.tabulaeformis seeds during initial germinating stages
2.2 胚乳中氧化途径关键酶活性变化

1) 胚乳中PGI活性的变化糖酵解(EMP)途径是葡萄糖氧化分解的重要途径。该代谢途径不仅可以为绝大多数有机质提供自由能, 还能为植物体内重要化合物的合成提供原料, 是种子萌发过程中的重要代谢途径。磷酸己糖异构酶(PGI)是EMP途径中将六碳糖转化为丙酮酸的关键酶, 其活性的变化能反映EMP途径的活化状态。油松种子萌发初始阶段胚乳中PGI活性表现出先上升后下降的趋势(图 2)。种子培养后胚乳中PGI活性就迅速升高, 并于培养27 h达到最大值52.25 OD·g-1DW, 比干种子胚乳中酶活性升高59.69%。此阶段胚乳生理生化反应微弱, 幼胚的生长需要能量和原料较少, EMP途径作为高等植物有氧呼吸或无氧呼吸必须进行的途径被激活, 为随后的代谢活动做准备(宋松泉, 1988)。培养27 h后, PGI活性又迅速下降。在培养72 h时PGI活性降为最低值36.60 OD·g-1DW, 仅比干种子高11.86%。PGI活性在萌发初始阶段的变化规律说明EMP途径可能是油松种子置床初期的重要代谢途径, 但随着种子萌发进程的深入, EMP途径作用逐渐降低。

图 2 油松种子萌发初始阶段胚乳PGI活性的变化 Fig.2 Changes of PGI activity of the endosperm of P.tabulaeformis seeds during initial germinating stages

2) 胚乳中MDH活性的变化三羧酸(TCA)循环是生物体内普遍存在的代谢途径。该途径起始底物乙酰辅酶A不仅来自糖的分解, 也可由脂肪酸和氨基酸的分解代谢中产生, 都进入TCA循环彻底氧化。TCA循环实际是糖、脂肪及蛋白质等有机物在生物体内末端氧化的共同途径(潘瑞炽, 1998)。苹果酸脱氢酶(MDH)是TCA循环的关键酶, 可以反映TCA循环的活化程度, 进而反映油松种子胚乳的呼吸代谢特点。油松种子萌发初始阶段, 胚乳中MDH活性总体呈上升趋势, 但上升非常缓慢(图 3)。培养最初36 h, MDH活性变化无明显规律, 变化不大, 基本保持在22.38~25.74 U·g-1min-1。这段时间一方面胚乳贮藏物质降解需要能量较少, 另一方面由降解产生的乙酰辅酶A含量低(Roberts et al., 1973; Maarten et al., 2002), 而乙酰辅酶A是TCA循环的起始底物, 致使TCA循环活化不明显, MDH活性处于较低水平。随后, MDH的活性不断升高, 在培养72 h时达到最大值30.84 U·g-1min-1, 比干种子高37.80%。MDH活性的这种变化说明在种子萌发初始阶段的后期, TCA途径可能是胚乳物质代谢以及胚细胞分裂生长的能量主要来源之一。

图 3 油松种子萌发初始阶段胚乳中G-6-PDH和6-PGDH联合酶及MDH酶活性的变化 Fig.3 Changes of G-6-PDH and 6-PGDH, MDH activities of the endosperm of P.tabulaeformis seeds during initial germinating stages

3) 胚乳中G-6-PDH和6-PGDH联合酶活性的变化戊糖磷酸(PPP)途径是植物体中葡萄糖直接氧化脱羧的有氧呼吸途径, 在生物体内它除提供能量外, 主要为还原性生物合成提供需要的NADPH、核酸代谢所需的磷酸戊糖(黄骥等, 2004; Karsten et al., 2001)等。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH)联合酶是戊糖磷酸(PPP)途径的限速酶, 通过测定其活性, 了解PPP途径在种子萌发过程中的活化状态。油松种子萌发初始阶段, 随着置床培养时间的延长G-6-PDH和6-PGDH联合酶活性呈现逐渐升高的趋势(图 3)。培养最初27 h联合酶活性升高幅度较小, 从21.6 U·g-1min-1升高到29.7 U·g-1min-1, 仅升高37.5%。该段时间EMP途径活化程度较高, PGI作为催化EMP途径的关键酶与G-6-PDH有着共同的反应底物, 2种酶的活性在萌发过程中呈现此消彼长的规律(Muscolo et al., 2001), 致使G-6-PDH在置床最初36 h升高幅度较小。培养27~36 h, 联合酶活性没有显著变化。随后, 胚乳代谢活动加强, 幼胚分裂生长需要较多的还原力和原料物质核酸。而PPP途径不仅能产生合成核酸不可缺少的原料物质磷酸戊糖, 同时为生命活动提供主要的还原力NADPH, 该途径被迅速活化。G-6-PDH和6-PGDH联合酶作为催化PPP途径的重要酶, 在培养36 h后其活性迅速升高, 且上升幅度远大于培养最初27 h, 在胚根突破种壳时联合酶活性达到了最高值57.9 U·g-1min-1, 比干种子中酶活性高168.06%。G-6-PDH和6-PGDH联合酶活性的变化表明PPP途径可能是油松种子萌发初始阶段中后期的主要代谢途径。

3 结论与讨论

呼吸作用是一切生活细胞所共有的生命活动, 是植物新陈代谢的一个重要组成部分, 与植物的生理活动过程有着重要而密切的关系(Fang et al., 2007)。油松种子呼吸速率的变化呈“S”形曲线, 而且明显存在呼吸滞缓期。油松种子呼吸滞缓期长达18 h左右。但对有些种子, 如野燕麦、蓖麻(Ricinus communis)等种子, 不存在呼吸滞缓阶段(Fang et al., 2007), 这些植物种子从吸胀的一开始呼吸速率就迅速升高, 不经过暂时的厌氧阶段, 胚根就突破种壳。可见, 在萌发过程中不是所有植物种子的呼吸速率都表现出“迅速升高、缓慢升高、重新迅速升高”的“S”形曲线, 这与种子水分的有效性及其周围氧气的浓度有关(Michael et al., 2002)。同时, 呼吸的滞缓期也说明促进种子萌发的一些物质, 包括酶等需要“动员期”。

油松种子萌发初始阶段呼吸代谢是通过不同的代谢途径实现的。目前, 植物体内营养物质氧化分解的途径基本有3条:EMP途径、TCA循环及PPP途径等, 这些途径所占的比重随植物的种类、发育时期、生理状态和环境而发生变化(潘瑞炽, 1998)。一般情况下, EMP/ TCA途径是生物利用能量的主要途径, 但在一些植物中, 或同一植物不同生理状态下, 也能通过PPP途径进行有氧呼吸, 这是一条仅次于EMP/ TCA的重要途径(韩建国等, 1998)。在种子萌发初始阶段, PPP途径作为具有特殊生理功能的途径, 其活性的增加有利于种子萌发的顺利进行(Huang et al., 2003; Michael et al., 2002)。PGI, MDH, G-6-PDH和6-PGDH联合酶分别是EMP途径、TCA循环和PPP途径发生反应的关键酶, 通过测定它们的活性, 了解种子萌发初始阶段呼吸代谢途径的活化状态。油松种子置床培养后PGI最先活化, 在培养27 h达到峰值后逐渐降低; MDH及G-6-PDH和6-PGDH联合酶活性在培养36 h时发生明显转折, 培养最初36 h, MDH活性无明显变化, G-6-PDH和6-PGDH联合酶活性增幅较小, 但36 h后2种酶活性均迅速上升, 胚根突破种壳时达到最大值, 分别比干种子中酶活性高37.80%和168.06%。MDH与G-6-PDH和6-PGDH联合酶相比增幅较小, 活化程度低。以上3种氧化途径酶活性的变化说明整个培养过程糖的代谢可能以EMP途径和PPP途径为主, 其中培养最初27 h, EMP和PPP途径同时存在, 但以EMP途径为主。随后胚乳代谢活动加强, 幼胚的生长需要大量的能量和原料, 而EMP途径满足不了种子生命活动的需要, 其活性逐渐降低。随着EMP途径活化程度的降低, 催化TCA及PPP途径的关键酶活性不断升高, 胚乳的呼吸代谢由EMP途径转向PPP途径和TCA途径。TCA途径在种子培养中后期活化程度有所升高, 但增幅不明显, PPP途径成为培养中后期的主要代谢途径。PPP途径的生理意义在于它不必经过EMP生成丙酮酸而进行有氧呼吸, 该途径的酶系统与催化EMP/TCA的酶系统完全不同, 当EMP/TCA途径的酶系统受到抑制时, PPP途径往往能正常地进行有氧呼吸, 并能有效地为生物合成提供主要的还原力, 为遗传物质DNA和RNA的合成提供不可缺少的原料物质(郑光华, 2004; Roberts et al., 1973), 在种子萌发初始阶段PPP途径活化程度的升高具有重要的作用(Wendt et al., 2000)。氧化途径学说认为, 种子萌发必须在PPP途径逐渐增强并达到一定程度时才能启动, 种子呼吸途径由EMP途径转向PPP途径是种子逐渐萌发的象征。赵永华等(2001)在研究西洋参(Panax quinquefolius)种子休眠解除指出, 种子休眠萌发主要是受EMP/TCA途径和PPP途径的平衡调节, 当PPP途径逐渐增强并达到一定比例时种子就萌发。可见, 油松种子在萌发初始阶段呼吸途径由EMP途径向PPP途径的转变是种子顺利萌发的标志。

高等植物呼吸代谢不一定只遵循一条固定不变的路线进行, 而可能存在多条并行的途径, 这些途径进行的程度和速度是随着植物的发育情况及外界环境而改变的(Maarten et al., 2002)。油松种子在培养初期EMP和PPP途径同时存在, 而中后期EMP, TCA及PPP途径同时存在。

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