森林土壤中存在大量微生物群体, 它们进行着一系列复杂的生物化学反应(Zhang et al., 2006), 是土壤中物质循环的主要动力和植物有效养分的储备库(Xu et al., 2002；Bardgett et al., 1994)，更重要的是, 土壤微生物对环境变化非常敏感, 是土壤环境质量的重要指标(中国树木志编委会, 1978)。土壤微生物群落功能多样性是土壤微生物群落状态与功能的指标, 反映土壤中微生物的生态特征。微生物群落功能为评价微生物功能多样性提供了一个可行的、生态相关的测量方法(郑华等，2004)。

BIOLOG方法操作简单, 获得数据量丰富, 能反映微生物种群的总体活性, 近十几年在微生物生态及环境微生物检测方面应用十分广泛。该方法通过测定微生物对不同碳源利用程度的差异来表征其生理特性的不同, 在研究空间及时间尺度上微生物群落变化方面有较好的应用。其原理是通过直接在微平板中进行针对微生物群体的培养, 并实时监测其引起的光吸收度变化, 籍以表征其生理特征(Garland et al., 1991；Garland, 1997)。

林火对土壤微生物的影响，主要通过Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数所分别反映的土壤微生物物种的丰富度、优势度以及度量群落物种的均匀度来测定。

本文利用BIOLOG技术，对黑龙江省大兴安岭呼中林区偃松林林下土壤进行试验，研究不同火烧强度对森林土壤的微生物功能多样性的影响，为改良火烧迹地土壤和恢复偃松林生态系统提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验地概况

样地位于黑龙江省大兴安岭呼中区呼源林场。该区域年平均气温-2.8 ℃，年均降水量700 mm, 无霜期约90天，土壤类型为棕色针叶林土，成土母质为变质岩，pH值4.9。地带性植被类型为寒温性针叶林，以兴安落叶松(Larix gmelinii)为单优势种，约占80.6%。主要乔木种类有兴安落叶松、红皮云杉(Picea koraiensis)、白桦(Betula platyphylla)、紫椴(Tilia amurense)、樟子松(Pinus sylvestris var. mongolica)和偃松(Pinus pumila)等；主要灌木和草本有兴安杜鹃(Rhododendron dauricum)、榛子(Corylus heterophylla)、越橘(Vacinium vitisidead)、笃斯越橘(Vacinium uliginosum)、杜香(Ledum palustre)和蒿类等(刘会锋等，2011)。

2010年6月发生的特大火灾扑灭后，在火烧迹地上分别选择低(L)、中(M)和高(H)3种不同火烧强度的地段，以及相邻的(同坡位、同坡向)未过火对照林地(CK)(表 1), 分别设置3个4 m×4 m的样方(即3次重复)。各处理(不同林火强度及对照)间除火烧强度差异外，其他立地条件基本一致。

1.2 土壤样品采集及分析方法

于9月25日在各样方内取0~10 cm表层土样，每样方内随机选3个样点，混合均匀后作为一个土壤样品。每个土壤样品除去动植物残体等杂质后，风干、研磨、过筛，迅速装入塑料袋并置于冰块上, 送达试验室, 4 ℃冰箱保存, BIOLOG分析在取样后48 h内进行。

试验使用的BIOLOG GN测试板共96孔。测试板的第1个孔为不含任何C源的对照, 其余每孔中含有1种C源和氧化还原染料四氮唑蓝。微生物利用碳源进行呼吸使氧化还原电势发生变化, 并将四唑类(TV)从无色还原成紫色(Cheng et al., 2006)。

通过测定各板孔的吸光值及其变化来反映微生物群落代谢功能的多样性。具体步骤：称取相当于4 g烘干土壤的新鲜土壤，在超净工作台中将土壤加至带有玻璃珠、存有100 mL灭菌磷酸缓冲液的三角瓶中。加盖振荡15 min(转速为150 r·min^-1)，静置2 min, 取上清液3 mL加至27 mL灭菌0.145 mol·L^-1NaCl溶液的三角瓶中, 稍加振荡(1:100提取液)。重复后一个步骤直至稀释到提取液为1:1 000，静置10~15 min。将BIOLOG ECO微平板从冰箱中取出, 预热到25 ℃。抽取稀释1 000倍的菌液150 μL接种至BIOLOG生态盘中，放入25 ℃培养箱中培养10天，每隔24 h在595 nm处用VAMAX自动读盘机进行自动读数(Microlog ReL 3.5软件)(Schutter et al., 2001)。

1.3 数据处理

根据相关文献提供的方法, 按算式(1)计算测试板孔中溶液吸光值平均变化率(average well color development, AWCD)；按算式(2)计算Shannon指数H(用于评估物种的丰富度)；按算式(3)计算Simpson指数(用于评估某些最常见种的优势度)；利用算式(4)计算McIntosh指数U(用于评估群落物种均匀度)(Garland et al., 1991；Jeffrey et al., 1996)：

(1)

(2)

(3)

(4)

式中, C为每个培养基孔的吸光值, R为对照孔的吸光值, n为培养基孔数, GN板n值为95。P_i为第i孔的相对吸光值与所有反应孔相对吸光值总和的比值, 即：P_i=(C-R)/∑(C-R)。D为1/Simpson指数, n_i为第i孔的相对吸光值(C-R), N为所有反应孔相对吸光值的总和∑(C-R)。

试验结果的方差分析及主成分分析采用SPSS 16. 0进行。

2 结果与分析 2.1 板孔平均颜色变化率

吸光值平均变化率(AWCD)表征微生物群落碳源利用率, 是土壤微生物群落利用单一碳源能力的一个重要指标, 反映了土壤微生物活性、微生物群落生理功能多样性(Zabinski et al., 1997；娄鑫等，2011)。

连续10天每隔24 h测得的AWCD(图 1), 从中可以看出, AWCD随培养时间的延长而提高, 不同样品都表现出在开始的24 h变化不大, 而在第48~144 h内快速升高, 随后持续缓慢地升高直到试验结束。AWCD的曲线高度从高强度火烧、中强度火烧、低强度火烧到对照一次升高。

图 1可见：各处理对AWCD有较大影响。火烧等级低强度火烧(L)、中强度火烧(M)、高强度火烧(H)的AWCD显著低于对照，且呈递减趋势。

2.2 土壤微生物多样性指数

生物多样性指数表明土壤微生物群落利用碳源类型的多少，即功能多样性。它们分别反映土壤微生物物种的丰富度、优势度以及度量群落物种的均匀度。

为了进一步确定火烧强度对土壤微生物的影响, 每个土样3个重复处理测算Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数, 它们分别反映土壤微生物物种的丰富度、优势度以及度量群落物种的均匀度。表 2列出了AWCD达到对数生长期(144 h)的指数计算结果。其中, Shannon指数和Simpson指数的结果表明：低强度火烧以及中强度火烧的群落丰富度、物种优势度均高于高强度火烧处理。而McIntosh指数的结果则表明低强度火烧的物种均匀度最高, 其次为中强度火烧，而高强度火烧处理最低, 说明其均匀度与群落丰富度、物种优势度之间有着不一致的现象。

2.3 主成分分析

BIOLOG的主成分分析显示了微生物群落对不同处理下碳源利用的响应, 是反映土壤微生物群落结构特征的有效手段。Garland等(1991)认为各样本空间位置的不同是和微生物利用碳底物的能力相关联的。具体而言, 各样本在PC空间不同PC轴坐标的差异是与对聚集在该PC轴上碳源的利用能力相联系的(李娟等，2008)。利用培养144 h后测定的AWCD数据, 经过标准化处理后, 利用相关文献提供的方法进行主成分分析(Kela et al., 2007；Min et al., 2007)。

根据提取的主成分个数一般要求累计方差贡献率达到85%的原则(Hao et al., 2003)，共提取了2个主成分, 累计贡献率达89.42%。因此本文对2个主成分进行分析(图 2)。

结果表明：不同火烧强度处理在PC轴上出现了明显的分异, 在PC1轴上各处理分布分散, 对照和低强度火烧处理主要分布在负方向, 而中强度火和高强度火烧主要分布在PC1轴正方向；PC2轴上各处理主要分布在正方向, 且有随着对照、低强度火烧、中强度火烧、高强度火烧沿PC2轴依次升高趋势。整体来看不同火烧强度处理分异较大, 表现出经不同强度火烧后微生物群落的不稳定性。

对不同的火烧强度处理的碳源主成分进行分析, 对PC1和PC2具有较高相关性的31个碳源的分析结果表明：对PC1和PC2起分异作用的主要碳源是氨基酸和糖类物质(表 3)。氨基酸类碳源在PC1的权重较大, 而与PC2相关性较大的碳源主要是糖类；氨基酸类、糖类碳源是区分各处理的主要碳源。

本文对不同处理具体利用的前5种碳源亦进行了分析(表 3)。不同处理的土壤微生物虽然利用的主要都是糖类、氨基酸类以及少量其他物质, 但处理之间共同点并不多。这显示出不同火烧强度处理对土壤微生物利用碳源的情况已经造成了一定的差异。

3 讨论

不同林火强度对土壤微生物群落碳源利用能力产生了不同的影响。AWCD的高低可用来表征微生物对碳源的利用率高低。火烧过后AWCD显著低于对照, 表明火烧不利于维持土壤微生物的碳源利用能力；AWCD均低于没有过火的对照处理, 表明这几种火烧处理中, 土壤微生物对所试95种碳源的利用能力相对较低，氨基酸类、糖类碳源是区分各处理的主要碳源，可见不同火烧强度改变了土壤微生物利用碳源的种类和能力。另外, 火烧可能改变了土壤微生物的优势种群, 引起其对所试碳源的利用率低下。一些研究指出一定强度的火烧有利于维持土壤微生物的多样性及活性(赵田夫等，2006)。

微生物群落在土壤中处在一个动态平衡过程中, 影响土壤的理化因子都会干扰土壤微生物群落的平衡从而影响土壤微生物的活性及其生态功能, 进而影响土壤环境质量。Shannon指数、Simpson指数、McIntosh指数分析结果表明：不同处理对土壤微生物群落多样性的影响有显著差异, 即不同火烧强度处理下, 微生物物种的数量、优势物种的优势度, 以及各个物种的多度均不相同。其中中强度火烧最有利于提高微生物群落物种数量、优势种的优势度以及各物种的均匀度, 这可能是由于适度火烧有利于土壤微生物的生长。火烧促进土壤微生物大量繁殖, 加快微生物的新陈代谢(赵田夫等，2006)。研究显示低强度火烧和中强度火烧处理虽然能增加微生物物种的数量及优势度, 但高强度火却使物种均匀度指数低于对照。这可能是由于土壤经过高温高热的灼烧，挥发了所产生的大量的气态氮、有机碳、速效磷，使火烧后土壤中的微生物数量、多样性锐减，以及组成发生了改变，土壤中的有机质含量减少(郭爱雪等，2011)。同时，火后土壤的pH值升高，使微生物生存环境发生了变化，不利于微生物的活动，使土壤微生物群落丰富度、物种优势度降低，但不同物种分布不完全一致，以至于物种均匀度存在变化不一致现象。可见，适度火烧可以提高群落丰富度、物种优势度，但可能破坏物种的均匀度。

4 结论

通过对大兴安岭地区偃松林土壤火烧迹地一个生长季土壤微生物群落功能多样性的研究, 可以得出以下结论：低强度火烧和中强度火烧处理使微生物的碳源利用率明显升高, 而高强度火烧却对土壤微生物碳源利用能力有不利的影响。以上3种火烧强度均影响微生物群落多样性, 其中，低强度火烧能提高微生物物种丰富度、物种优势度及群落均匀度, 中强度火烧使微生物物种丰富度、物种优势度指数升高，物种均匀度却下降，高强度火烧使3种指数均降低。

物种均匀度与丰富度、优势度变化规律不一致，这可能是由于低强度火烧促进了某些微生物种群(如善于利用植物残体的种群)的生长代谢, 而高强度火却抑制了一些微生物种群的生长代谢甚至导致死亡, 致使群落均匀度下降。