松材线虫病是由松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松树上的一种毁灭性病害，又称松萎蔫病。树木一旦受松材线虫侵害，短期内就会死亡，同时又较难控制。因此，松材线虫病又被称为松树的“癌症”(秦复牛等, 2003)。松材线虫隶属滑刃亚目(Aphelenchina)、拟滑刃总科(Aphelenchoidea)、拟滑刃科(Aphelenchoididae)、伞滑刃亚科(Bursaphelenchinae)、伞滑刃属(Bursaphelenchus)。许多线虫的研究需要以线虫的稳定保存为基础，国内外针对线虫的低温保存，特别是模式线虫—秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，均建立了稳定的低温保存体系(潘宏阳等, 2007；庞林海等, 2007；Riga et al., 1991；Eckert, 1987；Hope, 1999；Coles et al., 1980；Hubert et al., 1997；Bai et al., 2004；Elsen et al., 2007)。

为便于松材线虫病的研究，我国也有一些针对松材线虫材料保存的探索性研究。但多数结果都不理想，如多次继代培养后，松材线虫繁殖速度和致病性都会产生明显降低等(高景斌等, 2006)。为解决松材线虫能在实验室长期保存这一问题，本文探索利用冷冻保护剂，在超低温(-80 ℃)条件下松材线虫的保存方法，以及不同冷冻保护剂对松材线虫的保存效果，旨在寻找一种实验室操作方便实用且对松材线虫低温保存效果较好的方法，为开展有关松材线虫研究提供保证。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 供试松材线虫来源

于2009年8月分离自浙江省杭州市发病马尾松(Pinus massoniana)。

1.1.2 灰葡萄孢(Botrytis cinerea)

用于为松材线虫提供食物，本实验室保存。

1.2 方法 1.2.1 线虫培养与观察

线虫培养：接种灰葡萄孢于PDA平板，25 ℃时培养至灰葡萄孢菌丝长满平板后接入松材线虫，放置25 ℃培养箱中继续培养至灰葡萄孢菌丝消失，线虫培养至4龄。使用时将载有线虫的培养基挑出，放入贝尔曼漏斗中，用无菌水将线虫洗出，配成约为6 000条·mL^-1的线虫悬液(混合虫龄)备用。

线虫的显微观察：在显微镜(JNOEC XS-212-202)下，用10×目镜，4×物镜观察线虫活动情况。

1.2.2 线虫低温保存

将40%(V/V)的M9缓冲液(6 g Na₂HPO₄，3 g KH₂PO₄，5 g NaCl，0.25 g MgSO₄·7H₂O，1 000 mL H₂O)和35%(V/V)的S缓冲液(0.1 mol·L^-1 NaCl，0.05 mmol·L^-1 K₂HPO₄-KH₂PO₄ buffer，pH 6.0)混匀，选择不同浓度的甘油(终浓度分别为25%，20%，15%，10%)和二甲基亚砜(DMSO)(终浓度为1%)为保护剂，配制线虫低温保存剂。将分离得到的线虫悬液(约6 000条·mL^-1)1 mL和1 mL线虫低温保存剂，轻微震荡混匀，迅速放入-80 ℃超低温冰箱冻存。以不加保护剂的M9-S-H₂O混合液为对照，每试验组设3个重复。

1.2.3 线虫解冻及培养

从超低温冰箱中取出冷冻保存后的松材线虫，迅速投入到25 ℃的恒温水浴中，待线虫悬液完全融解后，迅速倒入长有灰葡萄孢真菌的平板上，加无菌水稀释至3倍体积，放置在25 ℃培养箱中培养。

1.2.4 线虫存活率及繁殖率测定

用微量移液器吸取0.25 mL解冻后培养的线虫悬液移置在凹玻片上，在解剖镜下计数液滴中的线虫存活数和总线虫数，3次重复取平均值，根据平均值计算1 mL线虫悬液中的线虫数量(崔建臣等, 2004)。以中性红染色鉴别松材线虫的死活，死线虫染成浅红色，活线虫不着色(杨宝君等, 2003)。计算松材线虫存活率和繁殖情况。

线虫存活率(%) =(活线虫数/线虫总数)×100%。

线虫繁殖率以1个个体在单位时间内产生的个体数表示，繁殖率=解冻13天线虫总数/(解冻1天线虫总数×13)。

1.2.5 数据分析

采用SPSS17.0分析软件对数据进行显著性检验(P=0.05)，用最小显著差数法比较数据间的显著性差异(P=0.05)。

2 结果与分析 2.1 不同冷冻液低温保存松材线虫的存活率

取约6 000条·mL^-1的线虫悬液，进行冷冻保存。将冻存3天和30天后得到的线虫进行解冻，1 h后，在显微镜下观测计算得到不同冷冻保护剂下的线虫存活数量(表 1)。从表 1中可以看出冻存3天后解冻的松材线虫存活率依次为：15%甘油＞10%甘油＞25%甘油＞20%甘油＞1%DMSO＞CK，其中在以15%甘油作为保护剂的冷冻液中，松材线虫的存活率达到30%以上。30天后解冻的线虫的存活率与3天解冻的线虫无明显差异，15%甘油冻存下的存活率最高。

2.2 不同冷冻液对松材线虫繁殖的影响

为进一步测试低温保存对松材线虫生长的影响，将解冻后的松材线虫继续在灰葡萄孢平板上培养，分别在第1，3，7，14天进行线虫计数，计算1 mL线虫悬液中线虫的数量。从表 2中可以看出：线虫经过冷冻保存后，均可进行正常繁殖，其中解冻后第7天线虫数量比第1天线虫数量增加了5.46~14.90倍，与线虫正常的繁殖周期一致。以15%甘油为保护剂，冷冻保存3天和30天，线虫解冻后的繁殖率分别为1.13和1.23，也呈现出正常的繁殖率，两者之间无显著差异。

3 结论与讨论

本文摸索了松材线虫的低温保存体系，发现以40%(V/V)的M9缓冲液和35%(V/V)的S缓冲液为生物保存缓冲液，在15%(V/V)甘油作为保护剂的条件下，松材线虫经过30天的低温保存，其存活率能保持在36.5%。36.5%的存活率与其他线虫的冷冻保存效果一致(Hope, 1999)；松材线虫经冷冻保存后，能维持其正常的生长和繁殖功能，与其他线虫保存效果一致(Nolan et al., 1988)。同时也发现：在15%(V/V)甘油作为保护剂下，冷冻3天和30天后松材线虫的存活率和繁殖率均无显著差异，说明松材线虫在合适的低温保存保护剂下，可以实现在-80 ℃下的长期保存。国内外对线虫保存的研究很多，但保存方法和保存效果不一，以液氮保存较多，解冻后线虫存活率从不足10%到高于90%均有报道(Riga et al., 1991；Bai et al., 2004)。针对松材线虫的保存—主要为4 ℃保存和液氮保存，结果均不太理想。本文以-80 ℃作为保存条件，与在液氮中保存相比较，操作简单、费用低廉，线虫存活率较高，更利于在实验室条件下进行保存，与4 ℃保存相比，不需多次转接，更为方便。

近年来，由于松材线虫病在我国的严重发生，针对松材线虫病的研究也不断深入，松材线虫的采集受时间限制，且采集到的线虫在实验室长期培养需要耗费大量的人力、物力，多次继代培养的松材线虫出现繁殖力、活动性和致病性降低等问题。有效的冷冻保存将有助于实验室条件下松材线虫虫源的及时供应。本文摸索的松材线虫的冷冻保存体系，将为松材线虫的研究提供参考。