随着分子生物学和基因组学技术的发展，多种PCR新技术如多重PCR和DNA杂交技术为基础的高通量分析手段，推动病原和病害生态学的研究进入一个新的发展阶段。多重PCR是在普通PCR基础上，在同一反应体系中加入多对引物，针对多个模板或同一模板的不同区域同时扩增多个目的核酸片段的反应(陈明洁等, 2005)。具有高效性、系统性、经济简便性，而且能够做到内部控制，对模板质量和数量反应等优点(Edwards et al., 1994)。

自Chamberian等(1988)首次提出多重PCR检测技术以来，这项技术已经在病原鉴定(He et al., 2011；张晓利等, 2010)、高通量的SNP基因分型、基因突变、缺失分析、模板定量、连锁分析、RNA检测以及法医研究等中得到广泛应用。在微生物区系研究及一些植物树木常见的病害诊断中，多重PCR技术也因其准确和灵敏的特性得到广泛的应用。董秀丽等(2006)利用嵌套多重PCR在一个反应体系中同时鉴定出4种感染植物的丛枝菌根真菌Glomus mosseae，Glomus intraradices，Scutellospora castaneae和HAUO3，准确快速地鉴定根内与根际菌根真菌区系；Winton等(2001)在同一个PCR反应中同时利用2对引物NS1/NS2(对照通用引物)和Platf/Platr(特异性引物)扩增ITS序列，可以从树皮、幼苗、土壤和水体中成功检测到雪松(Cedrus deodara)根腐病病原菌(Phytophthora lateralis)；Cote等(2004)运用多重PCR，通过4对引物MO368-1/MO368-6R(通用引物)和MO368-5/MO368-8R(MO368-10R/Laxa-R2)(特异性引物)扩增ITS序列，对侵染核果的褐腐病菌Monilinia spp.的不同种进行了准确的区分；Schweigkofler等(2004)在对辐射松(Pinus radiata)溃疡病研究时，利用2对引物GcHMG1/GcHMG2和MAT1p2/MAT1p3扩增环境样本中分离的辐射松溃疡病病原(Fusarium circinatum)交配型基因，结合多重实时定量PCR，成功区分病原菌MAT-1交配型；Guglielmo等(2007)则利用多重PCR，针对每一属立木腐朽菌，设计特异性引物，鉴定了立木腐朽菌为蜜环菌属(Armillaria spp.)、灵芝属(Ganoderma spp.)和猴头菇属(Hericium spp.)等11属，为早期诊断立木腐朽病提供了一个有力的工具。以上这些多重PCR技术的研究，主要是利用特异性引物，在同一反应中加入多对特异性引物，同时检测多种不同病原菌，为在其他病原鉴定中的应用提供依据。

树木溃疡病病原种类多样，寄主广泛；有性型和无性型并不是一一对应关系，无性型多样，其形态特征差异性小，有性型在自然界中不常发现。目前检测鉴定的方法还依赖于病原菌的分离培养，这限制了生态条件下对树木溃疡病发生、发展和防治的研究。许多基因或核酸间隔序列都已用于溃疡病病原真菌鉴定：rDNA的保守区域(包括ITS，SSU，LSU，18S rDNA，28S rDNA基因等)(张星耀等, 1999；余仲东, 2010)、β-微管蛋白(β-tubulin)、延伸因子-1α(EF-1α)(赵嘉平, 2007)、几丁质合酶(chitin synthase)、α-肌动蛋白(α-actin)和钙调蛋白(calmodulin)等。研究表明：单独一个基因难以准确鉴定病原菌，因此在树木溃疡病研究已从单一基因发展到多基因联合分析(Slippers et al., 2004；Fourie et al., 2004；赵嘉平, 2007)。目前，杨树溃疡病菌Botryosphaeria spp.，Vasla spp.等PCR鉴定检测技术的模板依然是利用纯培养菌株提取获得，扩增仍然是一个分子标记基因独立的反应，分离、培养以及大量的PCR反应成为鉴定和检测病原菌重要的限速过程。另外，引起树木溃疡病的病原菌为复合菌群，没有针对属或种的特异性引物，多重PCR在此类杨树溃疡病病原以及林间环境样本研究中还未有报道，而且利用通用引物构建多重PCR检测病原菌已有报道(Wei et al., 2009)。因此，直接利用通用引物进行多重PCR对环境样本进行多个基因的扩增不需分离，直接扩增环境样本中病原菌种类，将有效提高杨树溃疡病病原检测效率，为基因芯片的应用提供基础。

本研究利用几种溃疡病病原菌，建立多重PCR检测鉴定体系，在对内部转录间隔序列(ITS)和转录延伸因子(EF-1α)成功扩增的基础上，对多重PCR技术的反应条件退火温度、模板和引物的浓度进行优化调整。在成功的多重PCR技术基础上直接应用于环境样本中，同样扩增出目的病原菌。本文建立的溃疡病多重PCR技术，为直接检测和诊断林间林木组织中潜伏或内生的溃疡病病菌及发生的溃疡病类型奠定基础，也为创建环境样本通量检测和鉴定的芯片杂交技术和方法提供可行性参考，从而为树木溃疡病在森林生境下的病害流行学和病原生态学的研究及病原生态互作的分子基础的科学问题研究提供了技术手段。

1 材料与方法 1.1 试验材料

Botryosphaeria dothidea(编号，Bd2)；Valsa sordida(CXY321)；Leucostoma sp.(MUCL49126)；Valsa ambiens(MUCL47926)；无症状北京杨(Populus×beijingensis)2~3年生枝干组织(表 1)。

1.2 试验方法 1.2.1 供试菌株培养和菌丝体收集

将所选菌株接种到固体PDA培养基上活化，25 ℃黑暗培养3天，挑取菌丝转入至马铃薯葡萄糖液体培养基中，震荡培养5天，收集菌丝球，用无菌水洗涤3次，无菌滤纸吸干水分，-20 ℃保存备用。

1.2.2 DNA提取

取冷冻干燥菌丝约0.05 g放入2 mL离心管，用研磨杵研磨至粉末，采用CTAB法稍修改(Jasalavich et al., 2000)，加入1 mL 65 ℃预热的2×CTAB和20 μL β-巯基乙醇，放入65 ℃的水浴锅中水浴60 min。14 000 r·min^-1离心，取上清液，放入新的离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，14 000 r·min^-1离心5 min。重复1~2次，直到界面层的沉淀物质很少后，进入下一步骤。取上清液放入新的离心管中，加入1/10体积的10×CTAB，再加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，14 000 r·min^-1离心5 min。利用1/10体积的醋酸钠和2~2.5倍体积的冰冻无水乙醇，沉淀DNA。10 000 r·min^-1 4 ℃离心10 min，弃上清液，用70%酒精洗DNA 2~3次，室温干燥，加入100 μL的Elution buffer溶解DNA，放入-20 ℃冰箱中保存待用。

对于环境样本总DNA提取，用75%酒精进行枝干表面消毒，然后刮取树皮，放入研钵中，用液氮进行研磨。取环境样本粉末0.2 g放入2 mL离心管中，提取方法同上。取4 μL样品，加入1/6体积的6×Loading buffer，0.8%琼脂糖凝胶(含EB)电泳检测DNA，以MarkerⅢ(天根)为DNA分子标准，100 V电压电泳40 min，并用超微核酸蛋白测定仪(Nanodrop ND-1 000)测量DNA含量，取部分稀释成约50~100 ng·μL^-1，-20 ℃保存备用。

1.2.3 普通PCR扩增

利用真菌通用引物ITS1/ITS4(White et al., 1990)扩增核糖体内部转录间隔区ITS1-5.8S -ITS2序列扩增；利用引物EF1-728F/EF1-986R(Carbone et al., 1999)扩增延伸因子EF-1α。普通PCR扩增体系为50 μL，应组分为：5 μL 10×Ex Taq buffer(Mg²⁺)，4 μL dNTP Mixture(各2.5 mmol·L^-1)，0.25 μL Taq酶(5 U·μL^-1)(TaKaRa)，2 μL各正反向引物(10 μmol·L^-1)，2 μL DNA模板，灭菌水补足50 μL；参考Fujita(2001)反应程序修改为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s，55.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31个循环; 最后72 ℃延伸4 min。其中EF-1α扩增，除了引物改变之外，其余条件都相同，操作在冰上进行。

取5 μL PCR产物样品，加入2 μL的6×Loading Buffer，以MarkerⅡ或Marker D2000(天根公司)为分子量标准，在2.2%琼脂糖凝胶(含EB)中120 V，电泳40~60 min，观察电泳结果。

1.2.4 多重PCR扩增

在普通PCR扩增程序和体系的基础上，进行多重PCR，除各引物加入量为1 μL，反应体系和反应程序与普通PCR相同。对多重PCR退火温度、引物浓度和灵敏度进行优化。

挑选其中3个菌株B.dothidea，V.ambiens，Leucostoma sp.作为模板，对多重PCR退火温度和模板浓度进行优化。退火温度选择50，52，55.6，58，60 ℃ 5个温度梯度；模板分别做未稀释和稀释100×处理。

选取菌株V. sordida进行多重PCR引物浓度的优化，引物为ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，引物终浓度为0.2，0.1，0.04，0.02，0.01，0.004，0.002，0.001，0.000 4，0.000 2 μmol·L^-1 10个梯度。

选取菌株V. sordida进行多重PCR灵敏度的验证，起始浓度为500 ng·μL^-1，反应体系中加入模板量为2 μL，即V. sordida DNA模板加入量为1 000，500，100，10，1，0.1，0.01，0.001 ng 8个梯度，进行多重PCR，无菌双蒸水作为阴性对照。

1.2.5 测序及鉴定

将普通PCR和多重PCR扩增产物，切胶回收纯化，进行双向测序(华大基因公司)，测序引物和扩增引物相同。将所测序列在GenBank中进行Blast，进行同源性比较，通过Score和E-value值进行判定相似性大小。

1.2.6 多重PCR在环境样本中应用

为了验证多重PCR直接从环境样本中检测鉴定树木病原菌的可行性，采集无症状的北京杨枝条和纯菌B.dothidea进行研磨混合，取0.2 g研磨北京杨粉末，加入菌的量分别为0，0.001，0.01，0.025，0.05，0.1 g 6个梯度，每个梯度重复3次，按照上述方法提取DNA，然后利用ITS1/ITS4，EF1-728F/EF1-986R进行普通PCR和多重PCR扩增，扩增体系和反应程序与菌株扩增相同，无菌双蒸水作为阴性对照。扩增完毕后，取5 μL进行琼脂糖凝胶(含EB)检测。

2 结果与分析 2.1 普通PCR扩增

对于普通PCR，首先进行温度梯度PCR，确定最佳退火温度。结果显示：最适退火温度为58 ℃，能够同时单独扩增ITS，EF-1α。扩增产物ITS片段为500~700 bp，EF-1α片段约为300 bp。

2.2 多重PCR温度参数优化

从图 2可知：模板浓度不同时，温度在55.6和58 ℃时，都可以得到2条目的条带，而在其余温度下，只有1个目的片段扩增明显，而另外1个目的片段没有明显扩增，这种现象在多重PCR中很容易出现。造成这种现象可能为引物配比不平衡，引物对之间互相干扰等。综合来看，选择55.6 ℃作为多重PCR最佳扩增温度。

2.3 多重PCR引物浓度的优化

由图 3可知：当2对引物终浓度为0.2，0.1 μmol·L^-1扩增出目的条带，当引物浓度降低时，则没有扩增出目的条带。

2.4 多重PCR灵敏度验证

由图 4可知：菌株V.sordida起始原始浓度为500 ng·μL^-1，加入体积2 μL。当稀释1 000倍时，即模板浓度为1 ng时，扩增条带微弱，当小于1 ng时，则没有扩增出任何条带。

2.5 普通PCR和多重PCR比较

在B.dothidea，V.sordida，Leucostoma sp.，V. ambiens 4个菌株都能成功扩增的基础上，为了初步判断多重PCR扩增条带是否为目的条带，将4种菌株同时进行普通PCR和多重PCR。由图 5可知：普通PCR扩增条带和多重PCR扩增条带大小一致。将普通和多重PCR产物测序，在GenBank中比对后得到序列也相同。

2.6 环境样本多重和普通PCR

由图 6可知：将无症状北京杨枝条和B.dothidea纯菌研磨混合后，直接进行普通PCR和多重PCR，都可以扩增出片段。其中图上19, 20，21 3个泳道为纯菌(B.dothidea) ITS，ITS/ EF-1α，EF-1α扩增目的片段，而其余为混合模板(菌和环境样本)扩增结果。将其扩增片段和纯菌扩增片段大小比较，结果显示：混合模板和纯菌扩增条带大小一致。挑取混合模板多重PCR扩增条带，进行测序，将测得ITS序列和EF-1α序列分别同源性比较，测序结果和加入菌(B.dothidea)一致。

3 结论与讨论

以4种杨树溃疡病病原菌和环境样本为材料，利用通用引物ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R对内部转录间隔区ITS和转录延伸因子EF-1α 2个区域进行PCR扩增，在此基础上进行多重PCR，对多重PCR退火温度、模板浓度和引物浓度进行优化。结果表明：退火温度为55.6 ℃，各引物浓度为0.2 μmol·L^-1时，可以成功地扩增出目的条带，通过测序比较，多重PCR和普通PCR扩增条带相吻合。多重基因组DNA检测的灵敏度最低可达1 ng。然后将环境样本进行普通和多重PCR，通过片段大小比较和多重PCR产物测序，判断目的片段即为病原菌。证明在环境样本中有病原菌存在的情况下，多重PCR则能够扩增出病原菌不同片段。

多重PCR中，引物是最重要的一个因素，在同一反应中同时扩增2个或者更多目标序列，主要是依赖引物对彼此之间的相容性。理想状态下是所有引物对有相同的扩增效率和解链温度，这样在同一温度下互补链才能分离，扩增才能同时进行，而解决这一问题最主要的是引物退火温度要相近。其次，避免引物二聚体的产生，在某些条件下这些非目的片段更易扩增，消耗反应液并且破坏退火和延伸速率(Brownie et al., 1997)，影响目的片段的扩增。另外，PCR产物大小要容易区分(谭军等, 2010)。因此在本试验中，为了适用于以后感病环境样本检测，选择2对通用引物ITS1/ITS4和EF1-728F/EF1-986R，它们有相近的退火温度约为58 ℃，而且通过普通PCR验证，很少有引物二聚体的产生，片段大小相差很大(图 1)。

此外，影响多重PCR的因素有反应程序和体系。在反应程序中，循环次数影响较小，而退火温度和时间，延伸时间对扩增影响较明显；在反应体系中，反应体积对其扩增效果影响较小(黄银花等, 2003)。其他因素有PCR缓冲液组成及浓度，dNTP以及酶等(赵红庆等, 2007；赵邦荣等, 2011)。本试验中所用的普通PCR反应体系是50 μL，利用同样体系进行多重PCR，采用一个退火温度，获得较好扩增，与王凤格等(2003)一致。另外，多重PCR进行中还容易出现优先扩增的现象(Ploz et al., 1998)，如在环境样本扩增中，PCR产物ITS片段较EF-1α片段扩增明显，而在菌株中，两者扩增几乎无差别，其原因可能是寄主中组分影响了引物扩增效率。随着引物对增加，多重PCR难度也会增加，但多重PCR技术一旦成熟，则会大大提高检测病原菌的效率。由于树木溃疡病病原的多样性，选择更多个基因以及基因芯片的应用将会极大地促进溃疡病病原鉴定及相关的研究。

目前树木溃疡病的研究，主要着重于遗传进化、互作等方面的研究。基于菌株的分离纯化培养，逐个进行PCR，费时费力，且在分离过程中，由于分类知识匮乏和技术不成熟，容易造成失误。直接从环境中研究病原菌，将会大大缩短时间和周期，通用引物多重PCR可以最大量地扩增环境样本中的病原菌，对病原生态学及病害流行学研究提供方法和数据。本文首次将多重PCR应用到杨树溃疡病病原研究中，并且对于环境样本，同样可以成功扩增到目的条带。随着溃疡病病原基因信息的不断积累和完善，通过对基因序列的研究分析，需要寻找更多的标记基因、功能基因等。针对不同种的病原菌，设计特异性引物，利用多重PCR一次性检测大量的病原菌；或利用通用引物多重PCR与基因芯片、AFLP、荧光定量和逆转录等联合，快速准确地检测环境样本溃疡病病原种类，以及相关病原遗传进化、互作等，同时也为在其他树木以及病原菌的应用中奠定了基础。