林业科学  2012, Vol. 48 Issue (4): 171-176   PDF    
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石东霞, 蒋忠荣, 殷中琼, 杨帆, 贾仁勇, 颜其贵, 贺常亮, 徐娇
Shi Dongxia, Jiang Zhongrong, Yin Zhongqiong, Yang Fan, Jia Renyong, Yan Qigui, He Changliang, Xu Jiao
印楝油两性不育灭鼠颗粒剂对小鼠摄食系数与抗生育作用
Ingestion Coefficient and Antifertility Action of Neem Oil Granules for Rodents' Ambisexual Sterility
林业科学, 2012, 48(4): 171-176.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(4): 171-176.

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收稿日期:2010-08-16
修回日期:2010-12-22

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石东霞
蒋忠荣
殷中琼
杨帆
贾仁勇
颜其贵
贺常亮
徐娇

印楝油两性不育灭鼠颗粒剂对小鼠摄食系数与抗生育作用
石东霞1, 蒋忠荣2, 殷中琼1,3, 杨帆1, 贾仁勇1,3, 颜其贵1, 贺常亮1, 徐娇1    
1. 四川农业大学动物医学院 雅安 625014;
2. 四川省甘孜州畜牧科学研究所 甘孜 626000;
3. 四川农业大学动物疫病与人类健康四川省重点实验室 雅安 625014
关键词:小鼠    印楝油颗粒剂    摄食系数    抗生育作用    
Ingestion Coefficient and Antifertility Action of Neem Oil Granules for Rodents' Ambisexual Sterility
Shi Dongxia1, Jiang Zhongrong2, Yin Zhongqiong1,3 , Yang Fan1, Jia Renyong1,3, Yan Qigui1, He Changliang1, Xu Jiao1    
1. College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University Ya'an 625014;
2. Ganzi Prefecture Institute of Animal Science in Sichuan Province Ganzi 626000;
3. Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Sichuan Agricultural University
Abstract: To choose the optimal dose of major drug and explore its antifertility effect, the ingestion coefficient and antifertility action of neem oil granules forrodents' ambisexual sterility were studied. The ingestion coefficient was studied with the concentration of 30%, 40% and 50% of neem oil granules for rodents' ambisexual sterility respectively, and the optimal palatability of pharmaceutical preparation was selected to study its antifertility action on mice. The ingestion coefficients at concentration of 30%, 40% and 50% of neem oil granules for rodents' ambisexual sterility were 0.67, 0.54 and 0.25 on male mice, and 0.55, 0.50 and 0.22 on female mice. The antifertility action study showed that antifertility rate at concentration of 30% neem oil granules for rodents' ambisexual sterility was 46.7% and 60% on female and male mice, while it at concentration of 40% neem oil granules for rodents' ambisexual sterility was 66.7% and 80% on female and male mice, respectively. The pharmacodynamics at concentration of 40% of neem oil granules for rodents' ambisexual sterility was showed that the testicle coefficient of treated mice was (1.56±0.54)g/100 g, and was significantly lower than the control group(P < 0.05). The treated groups' sperm abnormality rate was 45.22%, which was significantly difference compared with the control group (P < 0.01). The pathology study showed that 40% of neem oil granules caused serious damages on testicle, vas deferens, hystera, oviduct and ovary of mice. The 40% principle agent of neem oil granules for rodents' ambisexual sterility had good palatability and significant antifertility effect, thus it could be prospective in rodents' control on the grassland.
Key words: Mus muscula    neem oil granules    ingestion coefficient    antifertility action    

鼠害一直影响我国林业的发展,传统的灭鼠药物由于对环境的破坏过大且有长期毒副残留的危害,因而现有灭鼠制剂已逐渐开始向天然灭鼠剂转变,其中通过抗生育机制控制害鼠的繁殖力度是一种有效又不破坏生态环境和生态链的灭鼠方法(尤德康等,2006孙红专等,2006)。目前应用的鼠类抗生育灭鼠制剂如姜科植物雷公藤(Tripterygium)等开发用于防治草原鼠害,但由于啮齿动物的婚配制度和交配行为为一雄多雌制和混乱的乱交行为,即使90%的雄性不育也不能保证对种群整体的生育起到控制作用,因此单性的抗生育防治对于野外的鼠害种群数量的控制无意义。于是,人们开始探索两性不育灭鼠制剂,即对雄雌害鼠均有显著抗生育活力的药物,能导致雄雌鼠均不育,这就严重削弱了害鼠的繁殖能力,能够在大面积推广应用的同时对生态环境破坏也较小,且无激素类药物在生物链中循环的不良后果。其中,研究较多的两性不育灭鼠制剂是印楝油(neem oil),其经过印楝(Azadirachta indica)果实榨取而得,印楝树在我国以及世界各地广泛栽种,成活率高,价廉易得。

关于印楝油的抗生育作用,国外已将其作为一种高效低毒的植物源两性不育制剂进行了广泛研究和应用(Riar et al., 1991Mukherjee et al., 1996a1996bJuneja et al., 1996Talwar et al., 1997Garg et al., 1998Raghuvanshi et al., 2001)。很多研究报道印楝油具有显著的抗雄性生育效果,杀精效力极高(Awasthy et al., 2001),其对小鼠(Mus musclus)、大鼠(Rattus norregicus)、兔子(Oryctolagus cuniculus)、恒河猴(Macaca mulatta)等具有良好的抗生育作用(Upadhyay et al., 1990Upadhyay et al., 1993Kaushic et al., 1995)。此外,很多人还对其在抗生育制剂的给药途径和剂型方面进行了大量研究(Lal et al., 1986Upadhyay et al., 1994Talwar et al., 1995Kaushic et al., 1995Gbotolorun et al., 2008)。

国内殷中琼等(2004;2005)已证实印楝油对小鼠具有较好的两性不育作用,可保持较长时期的可逆性不育,6周后生育能力逐渐恢复。因此,将印楝油制成颗粒制剂应用于鼠害防控具有重要意义。针对所选用的主药即印楝油具有气味浓烈,适口性差的缺点,前期通过正交试验设计优化了制剂处方,筛选出了适口性较好、主药浓度分别为30%,40%和50%的3种印楝油颗粒剂。本试验拟通过筛选的3种制剂处方对小鼠的摄食系数和抗生育作用的研究,确定制剂中印楝油的最佳含量,并对最佳主药含量组的小鼠进行抗生育药效学研究,以评价制剂质量,为其今后应用于森林、草原鼠害防治提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

供试材料为3种主药浓度(30%,40%,50%)印楝油颗粒剂,由本实验室制备。印楝油由成都绿金公司惠赠。

试验动物选用健康性成熟清洁级昆明种小鼠(M. musculus,KM),合格证号SCXK(川)2008-24,购自华西医科大学动物实验室,6~7周龄,体质量为25~30 g,常规方式饲养[12L/12D、(25±3)℃、湿度35%~60%],自由采食和饮水。

1.2 方法

1) 印楝油颗粒剂对小鼠摄食系数的影响  将试验小鼠随机分为3组:低剂量组(30%印楝油颗粒剂)、中剂量组(40%印楝油颗粒剂)和高剂量组(50%印楝油颗粒剂),分别投喂90 g颗粒剂至各组,且各组均有普通饲料做空白对照。各剂量组分雌鼠15只(I组)和雄鼠组15只(II组),分笼饲喂颗粒剂7天,并于每日9:00 a.m.统计各组摄食量,计算比较各组小鼠的摄食系数。摄食系数=摄食抗生育剂平均量/摄食空白饵剂的平均量。判断标准:摄食系数≥0.3,表明适口性较好(高永荣等,1998)。

2) 印楝油颗粒剂对小鼠的抗生育作用影响  根据上述3种剂量组的印楝油颗粒剂摄食系数研究结果,选择适口性合格的制剂(摄食系数≥0.3)进行抗生育药效学研究。将适口性合格的剂量组的Ⅰ组和Ⅱ组分别自由采食印楝油颗粒剂7天后,将Ⅰ组与正常雄性小鼠按1:2合笼,Ⅱ组与正常雌性小鼠按2:1合笼,19天后处死并剖解雌鼠,统计各组怀孕率和抗生育率(殷中琼等,2006b)。对照组处理同试验组。

3) 印楝油颗粒剂对小鼠药效学试验  综合印楝油颗粒剂对小鼠的摄食系数和抗生育药力影响的研究结果,优选出印楝油颗粒剂的最佳主药剂量组的雄性小鼠(剂量组Ⅱ),于最后一次饲喂后(第8天, 9: 30 a.m.)处死,剖解;分别采取睾丸、附睾、精囊腺称重,计算睾丸系数,并对雄性小鼠精子畸形率进行统计分析。睾丸系数=(睾丸+附睾+精囊腺重量)/体质量×100%;精子畸形率=精子畸形数/精子总数。然后取雄性小鼠的睾丸和输精管与雌性小鼠的卵巢、子宫和输卵管(取材大小为2 cm×1.5 cm×0.3 cm)进行大体观察,并采集各脏器固定于100 mL·L-1福尔马林溶液中,通过苏木素伊红染色(HE),进行病理学检查,对照组同法处理。(殷中琼等,2006a2006b李玲等,1998杨静娴等,2002鲍鑫等,2007)。

4) 统计学分析  用SPSS 17.0分析软件进行数据统计、分析、处理与显著性t检验。抗生育力和睾丸系数试验样本容量为n < 30的小样本,2样本(试验组与对照组)平均数差异显著性检验采用t检验法中成组数据平均数比较的假设检验法。精子畸形率影响试验则由于样本容量大,且试验数据服从正态分布,采用大样本平均数比较假设检验处理(李春喜等,1997杜荣骞等,2003)。

2 结果与分析 2.1 印楝油颗粒剂对小鼠摄食系数的影响

表 1中可见:印楝油颗粒剂摄食系数随主药(印楝油)浓度增高而显著降低,可见制剂适口性与印楝油用量密切相关。另外,各组雌性小鼠(Ⅰ组)摄食系数较雄性小鼠(Ⅱ组)略高,但无统计学意义(P>0.05)。结果表明:高剂量组的印楝油颗粒剂适口性较差,而低剂量组和中剂量组的印楝油颗粒剂适口性合格(摄食系数≥0.3)。

表 1 印楝油颗粒剂对小鼠摄食系数的影响 Tab.1 Effect of neem oil grannules on ingestion coefficient in mice
2.2 印楝油颗粒剂对小鼠抗生育作用的影响

表 2可知:低剂量组的印楝油颗粒剂对雄雌小鼠的抗生育率与对照组相比差异均不显著(P>0.05);而中剂量组的印楝油颗粒剂对雄雌小鼠抗生育率均极显著(P < 0.01);中剂量组的印楝油颗粒剂抗生育率明显优于低剂量组的印楝油颗粒剂。结果表明,印楝油颗粒剂的最佳主药浓度为40%。

表 2 印楝油颗粒剂对小鼠抗生育作用的影响 Tab.2 Effect of neem oil grannules on antifertility action in mice
2.3 印楝油颗粒剂对小鼠睾丸系数的影响

表 3可见:中剂量Ⅱ组的睾丸系数与对照组相比差异显著(P<0.05)。结果表明:40%印楝油颗粒剂对小鼠的睾丸系数有不良影响。

表 3 印楝油颗粒剂对小鼠睾丸系数的影响 Tab.3 Effect of neem oil grannules on testicle coefficient in mice
2.4 印楝油颗粒剂对雄性小鼠精子畸形率的影响

表 4可知:中剂量Ⅱ组的精子畸形率与对照组相比差异极显著(P < 0.01)。结果表明:40%印楝油颗粒剂对小鼠的精子致畸效果明显。

表 4 印楝油颗粒剂对小鼠精子畸形率的影响 Tab.4 Effect of neem oil grannules on sperm abnormality rate in mice
2.5 印楝油颗粒剂对雄性小鼠生精组织的影响

光镜下,对照组小鼠睾丸曲细精管,其精原细胞贴近基膜,内侧为排列有序的各级生精细胞(初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子),曲细精管腔面可见大量的精子,生精细胞间可见支持细胞(图 1a)。试验组睾丸组织间质变化轻微者,表现为间质增厚,曲细精管基底膜破坏,各级生精细胞保持完整,严重者睾丸组织间质变性坏死,呈空白状。睾丸多数曲细精管生精细胞数及层次减少,管壁变薄,曲细精管破坏,失去了正常的结构,曲细精管轮廓消失,各级生精细胞发生不同程度的变性、坏死(图 1b)。

图 1 睾丸、输精管组织解剖图 Fig.1 Anatomical chart of testis and deferent duct a, b:睾丸Testis; c, d:输精管Deferent duct

光镜下观察,对照组小鼠输精管组织具有正常组织结构(图 1c)。试验组小鼠输精管间质内毛细血管充血,肌细胞发生脂肪变性和空泡样变性(图 1d),炎性细胞浸润,部分肌细胞溶解坏死,黏膜上皮脱落。

2.6 印楝油颗粒剂对雌性小鼠生殖器官的影响

光镜下,对照组小鼠卵巢具有正常的组织结构(图 2a)。试验组小鼠卵巢血管充血明显,卵膜细胞减少,黄体发育不明显,卵细胞减少,各级卵泡细胞发生局灶性水泡变性,脂肪变性和坏死,部分细胞核溶解(图 2b)。变性坏死灶内嗜中性粒细胞、巨噬细胞大量浸润。卵泡间质发生不同程度的变性和坏死,大量淋巴细胞浸润。

图 2 卵巢、输卵管、子宫组织解剖图 Fig.2 Anatomical chart of ovaries, oviduct and hystera a, b:卵巢Ovaries; c, d:输卵管Oviduct; e, f:子宫Hystera

对照组小鼠输卵管具有正常的组织结构(图 2c)。试验组输卵管肌层横纹模糊,严重者消失(图 2d),管腔内充满大量浆液,并伴有充血,输卵管肌层出现大量炎性细胞浸润。

对照组小鼠子宫具有正常的组织结构(图 2e)。试验组小鼠子宫肌纤维溶解,结构异常,多有变性溶解现象出现(图 2f),严重者子宫失去正常结构,肌层内有炎性细胞浸润,呈局灶性分布。

3 结论与讨论

摄食系数试验是评价药物适口性的常用试验,具有较好的客观性,可排除空间和环境因素对小鼠自由采食的影响,能较准确的评价药物适口性(沈世英,1987李镜辉,1990)。本研究表明:主药浓度为30%和40%的楝油颗粒剂的摄食系数大于0.3,适口性合格。印楝油颗粒剂适口性随主药浓度升高而降低,提示制剂适口性与主药含量密切相关,制剂应从适口性和药效学两方面综合考虑主药剂量。

抗生育率是指不孕母鼠数与母鼠总数的百分比,可以反应药物对雌雄小鼠的抗生育能力。通过印楝油颗粒剂对小鼠摄食系数的研究结果,选择低和中剂量组的印楝油颗粒剂对雌雄小鼠抗生育率进行分析比较,以筛选出其最佳主药含量。结果表明:低剂量组的印楝油颗粒剂对雄雌小鼠的抗生育率与对照组相比差异均不显著(P>0.05);而中剂量组的印楝油颗粒剂对雄雌小鼠抗生育率均极显著(P < 0.01);中剂量组的印楝油颗粒剂抗生育力(试验组Ⅰ抗生育率66.7%;试验组Ⅱ抗生育率80%),明显优于低剂量组的印楝油颗粒剂(试验组Ⅰ抗生育率46.7%;试验组Ⅱ抗生育率60%)。因此,当主药浓度为40%时,印楝油颗粒剂具有较好的抗生育作用,该数据为印楝油制剂应用于生产实践提供了主药剂量的参考。

脏器系数可以在一定程度上反映动物某些脏器的损伤程度(贺显晶等,2008)。睾丸系数是评价生精功能的一个基本指标。研究结果显示:中剂量组的雄鼠睾丸系数与对照组相比显著降低(P<0.05)。这表明40%印楝油颗粒剂对小鼠的睾丸系数有不良影响,对睾丸组织有一定程度的病理损伤。

精子畸形试验的价值在于精子畸形率的增加可以预示化学物质及其衍生物到达睾丸而发生性腺毒作用(Kall et al., 1997)。小鼠精子畸形试验对生殖细胞突变剂是比较敏感的,许多证据表明引起的精子形态改变可以反映雄性生殖细胞的遗传损伤。当化学物质致使生殖细胞的基因发生突变或干扰了基因的表达过程,就会导致精子畸形率的增高(殷中琼等,2005)。小鼠精子畸形多见有双头、小头双尾、头部、结合部膨大等(杨继红等,2009)。本试验表明:印楝油颗粒剂对小鼠精子畸形的影响主要集中在头基部过宽,双尾等方面,畸形率达45.22%,与对照组的13.84%相比差异极显著(P<0.01),则印楝油颗粒剂对小鼠精子的致畸影响可能是其抗生育作用的一个原因。关于印楝油颗粒剂致精子畸形率偏高的机制一方面认为是由于它可明显改变睾丸内部的生理环境,即精子发育生成的外环境被破坏;另一方面也可能是其直接与精子作用从而破坏精子结构使其畸形。

印楝油颗粒制剂对雄性小鼠生精组织的影响结果表明:其对睾丸间质的影响显著,破坏各级生精细胞,导致精子生成减少,这可能是印楝油发挥抗生育作用的主要原因,此结果与殷中琼等(2005;2006a)研究结果相同。而印楝油颗粒剂对雌性小鼠生殖器官的影响结果表明:其对卵巢、子宫和输卵管的影响较大,主要引起卵巢各级卵泡细胞发生不同程度的变性、坏死和炎性细胞浸润,子宫发生水肿和炎症和输卵管的肌层模糊或消失,管腔内充满大量浆液,甚至出现充血等病理现象,这可能是印楝油颗粒剂导致雌性小鼠不孕的主要原因。综上所述,印楝油两性不育灭鼠颗粒剂对小鼠具有很好的抗生育作用,而关于其抗生育作用具体机制有待进一步探究,为印楝油两性不育灭鼠颗粒剂用于鼠害防治提供科学的理论依据。

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