林业科学  2012, Vol. 48 Issue (4): 156-161   PDF    
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段丹丹, 王有年, 成军, 招嘉宁, 师光禄
Duang Dandan, Wang Younian, Cheng Jun, Zhao Jianing, Shi Guanglu
欧亚旋覆花提取物对朱砂叶螨生物活性及其体内几种酶活性的影响
Effects of Inula britannica Extracts on Biological Activities against Tetranychus cinnabarinus and Several Enzyme Systems in T.cinnabarinus
林业科学, 2012, 48(4): 156-161.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(4): 156-161.

文章历史

收稿日期:2010-04-02
修回日期:2010-12-30

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段丹丹
王有年
成军
招嘉宁
师光禄

欧亚旋覆花提取物对朱砂叶螨生物活性及其体内几种酶活性的影响
段丹丹1, 王有年1, 成军1, 招嘉宁2, 师光禄1    
1. 农业部都市农业(北方)重点开放实验室 北京 102206;
2. 北京农学院生物技术学院 北京 102206
关键词:棕榈酸乙酯    朱砂叶螨    谷胱甘肽-S-转移酶    乙酰胆碱酯酶    Na+-ATP酶    总蛋白含量    
Effects of Inula britannica Extracts on Biological Activities against Tetranychus cinnabarinus and Several Enzyme Systems in T.cinnabarinus
Duang Dandan1, Wang Younian1, Cheng Jun1, Zhao Jianing2, Shi Guanglu1    
1. Key Laboratory of Urban Agriculture (North) of Ministry of Agriculture;
2. College of Biotechnology, Beijing University of Agriculture Beijing 102206
Abstract: Acaricidal activities of the extracts from Inula britannica against Tetranychus cinnabarinus and theri effects on several enzymes in T. cinnabarinus were evaluated under laboratory conditions. It was found that crude extracts from I. britannica with petroleum ether exhibited high acaricidal activities against T. cinnabarinus, and the corrected mortality in 24 h after treatment was 92.05% at concentration of 2 mg·mL-1. After a liquid-liquid partition from petroleum ether crude extracts with methanol, the petroleum ether extracts were separated into 38 fractions by column chromatography, and further tests for their acaricidal activities were conducted. Fraction 33, the main component of the resulting extracts, was found to possess the strongest acaricidal activity against T. cinnabarinus in all 38 fractions, and its corrected mortality against T. cinnabarinus was 90.12% in 24 h. Moreover, GC-MS analysis revealed that chemical composition of fraction 33 was ethyl palmitate. Laboratory bioassay indicated that the corrected mortality of ethyl palmitate against T. cinnabarinus after treatment for 24h was 90.61%, and the mean lethal concentration (LC50) was (1.255 ± 0.167) mg·mL-1. In order to investigate mechanism of the toxic effect of ethyl palmitate on T. cinnabarinus, several important enzymes including glutathione S-transferase (GST), acetylcholinesterase (AChE) and Na+-adenosine triphosphatase (Na+-ATPase) as well as total protein content in T. cinnabarinus were tested by the colorimetric method. The experimental results showed that after treatment with ethyl palmitate, total protein content in T. cinnabarinus obviously increased, and the activities of GSTs and AchE in T. cinnabarinus were strongly induced, while the activity of Na+-ATPase in T. cinnabarinus was inhibited, which could block the transmit of nerve, and eventually result in the death of the mite. These results indicated that Inula britannica extracts possessed high acaricidal activity.
Key words: ethyl palmitate    Tetranychus cinnabarinus    glutathione S-transferase    acetylcholinesterase    Na+ -adenosine triphosphatase    total protein content    

植食性害螨是危害农业生产的一个重要生物类群,我国每年用于主要作物的杀螨剂费用约90多亿元(师光禄等,1994)。朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)是其中一个重要的种类,可危害粮、棉、油、林木、果树等43科146种植物(李连昌等,1992忤均祥等,2002)。长期以来,对该螨的控制主要依赖化学农药,但频繁的使用农药不仅会杀死大量的害螨天敌和其他有益生物,同时增强了螨类的抗药性。为了减少化学农药带来的负面影响,必须使用安全有效的药剂防治害螨,而植物源杀螨剂可对害螨进行选择性控制,能生物降解为无毒产物,对非靶标生物伤害较小,且降低了环境污染(Kim et al., 2007)。因此,从植物体内提取有效杀螨活性物质防治害螨是国内外农药研究领域的一个热点。Sertkaya等(2010)评价了牛至(Origanum vulgare)、百里香(Thymus sp.)、熏衣草(Lavandula pedunculata)和薄荷(Mentha sp.)4种植物精油对朱砂叶螨的毒性;Wang等(2007)发现核桃叶石油醚提取物对朱砂叶螨有强烈的触杀效果;Shi等(2006)研究了地肤的石油醚、氯仿和甲醇3种溶剂的粗提物对二斑叶螨的触杀活性,发现氯仿的粗提物具有最高的致死率,可达78.86%。这些研究结果明确了从植物中可以获得比较有效的杀螨活性物质,用于开发安全高效的植物源杀螨剂。

笔者在筛选杀螨活性成分的过程中,发现欧亚旋覆花(Inula britanica)的石油醚提取物对朱砂叶螨有很强的杀螨生物活性。欧亚旋覆花是一种分布广泛的传统中草药,主要分布于中国、韩国和日本,用于治疗消化不良、支气管炎,并具有消炎作用(Kim et al., 2002)。目前国内仅有欧亚旋覆花的石油醚粗提物对朱砂叶螨成螨的触杀活性的研究报道(段丹丹等,2009),但未确定粗提物中的有效活性成分,也未研究其对朱砂叶螨生物活性的影响。因此,本文以朱砂叶螨为指示生物,进行室内生物测定,以明确欧亚旋覆花提取物和其有效成分的杀螨生物活性,着重研究了有效活性成分对朱砂叶螨体内几种酶活性的影响,并初步探讨了其对朱砂叶螨的毒杀作用机制,为进一步开发安全有效的新型植物源杀螨剂提供重要依据。

1 材料与方法 1.1 供试材料

欧亚旋覆花(头状花序)15 kg购自北京市同仁堂药房。将干燥的旋覆花用高速粉碎机(型号6202,北京环亚天元机械技术有限公司)粉碎,过40目筛后放入冰箱中备用。

朱砂叶螨为室内饲养的敏感品系,养虫室温度(25±1)℃,相对湿度50%±10%,光照L:D=18 h:6 h。豇豆(Vigna unguiculata)种植在营养钵(直径10 cm,高10 cm)中,当豆苗长出6片真叶后,接种饲养朱砂叶螨。环境温度(27±2)℃,相对湿度60%,光照L:D=16 h:8 h。

1.2 方法

1) 欧亚旋覆花活性成分的提取与分离  粗提物的提取:采用冷浸提取法。将欧亚旋覆花粉末放入广口瓶,加入干粉体积5倍量石油醚室温浸泡,浸提3次,每次3~5天,将浸提液放入浓缩仪(R-220 Büchi)中进行减压浓缩,合并3次的粗提物称重。

杀螨活性成分的分离:对石油醚粗提物用甲醇进行液-液萃取,并通过生物活性测定跟踪活性成分。将粗提物用10倍量的石油醚溶解后,装入分液漏斗中,用甲醇萃取3次,合并石油醚部分萃取液,减压浓缩。取杀螨活性成分集中的石油醚萃取物7 g作为大柱上样样品,选用中压层析柱进行柱层析分离,以石油醚:氯仿(10:0,9:1,8:2,7:3,6:4,5:5,4:6,3:7,2:8,1:9,0:10)进行梯度洗脱。洗脱后的流分经薄层层析(TLC)检测,合并相同组分,测定毒力。

质谱分析:参照查建蓬等(2005)的方法,用气相色谱质谱联用仪(GC-MS) Angilent 6890/5973N鉴定杀螨活性物质。

2) 杀螨活性的测定  采用玻片浸渍法并稍加改进(刘燕萍,2004)。在玻片一端贴上双面胶带,揭去上面的纸片,用零号毛笔挑取大小一致、颜色鲜艳的活泼雌成螨,将其背部粘在双面胶带上,以螨足、口器能自由活动为宜,每片粘约30头,粘好的玻片在双目解剖镜下检查,剔除不活动、受伤和粘的不合格的螨。将待测样品稀释成不同浓度,加0.3 mL吐温-80搅拌作为待测药液,将试螨浸入待测药液中轻轻摇动约5 s后取出,用吸水纸小心吸去螨体周围的多余药液,放在同等饲养条件下培养。24 h后在双目解剖镜下检查结果,用毛笔轻触螨体,以螨足不动者为死亡。以蒸馏水加1%体积的吐温-80为空白对照,3次重复。按Abbott公式计算校正死亡率(Abbort,1987)。

1.3 酶活性的测定

1) 酶源制备  将杀螨活性物质配制成浓度为2 mg·mL-1的药液,取成螨200头,采用触杀方法分别处理4,8,12,16,20,24 h后,加0.25 mL生理盐水在冰浴中匀浆,在4 ℃以10 000 r·min-1离心15 min,取上清液备用。

2) 谷胱甘肽-S-转移酶活性的测定  参照谷胱甘肽-S-转移酶试剂盒(购于南京建成)的方法,以每毫克组织蛋白在37 ℃反应1 min扣除非酶促反应,使反应体系中谷胱甘肽浓度降低1 μmol·L-1为一个酶活力单位。在412 nm波长下测定OD值,重复3次。

3) 乙酰胆碱酯酶活性的测定  参照何玉仙等(2003)的方法,以碘化硫代乙酰胆碱(Ach)为底物,二硫双硝基苯甲酸(DTNB)为显色剂,毒扁豆碱为抑制剂,反应条件为27 ℃,保温15 min,1 mmol L-1的毒扁豆碱0.3 mL终止反应,以每毫克蛋白每分钟水解乙酰胆碱的物质的量表示AchE活性,在412 nm波长下测定OD值,重复3次。

4) Na+-ATP酶活性的测定  参照Na+-ATP酶试剂盒(购于南京建成)的方法,以每小时每毫克组织蛋白中ATP酶分解ATP产生的无机磷的含量来表示Na+-ATPase活性,在636 nm波长下测定OD值,重复3次。

5) 酶源总蛋白含量的测定  采用考马斯亮蓝法。取酶液0.1 mL于试管中,对照管中加入0.1 mL磷酸缓冲液,5 mL考马斯亮蓝G-250试剂,混匀,25 ℃水浴加热2 min,于595 nm波长处比色测定OD值。根据标准曲线计算出蛋白质含量。

2 结果与分析 2.1 欧亚旋覆花粗提物对朱砂叶螨的触杀活性

石油醚粗提物的提取率较低,仅为1.56%;但其对朱砂叶螨具有很强的毒杀作用,当浓度为2 mg·mL-1时,对成螨24 h的校正死亡率达到92.05%(表 1)。

表 1 欧亚旋覆花提取物的提取率及提取物浓度为2 mg·mL-1时对朱砂叶螨的触杀毒性 Tab.1 Extraction rate of I. britanica extract and corrected mortality of T.cinnabarinus at 2 mg·mL-1 of the extract
2.2 有效活性成分的分离及其对朱砂叶螨的触杀作用

采用柱层析和薄层层析对石油醚萃取物进行分离纯化,最终得到38个流分。采用GC-MS对流分33进行检测,总离子流分析结果见图 1。从图 2可发现棕榈酸乙酯纯品的出峰时间和流分33是接近的,说明流分33的主要成分为棕榈酸乙酯,匹配度达90%以上。同时从表 2可以看出:当浓度为2 mg·mL-1时,棕榈酸乙酯对雌成螨触杀的LC50值为(1.255 ± 0.167)mg·mL-1,95%置信区间为(1.468~2.204)mg·mL-1。进而对棕榈酸乙酯的触杀毒性进行生物活性跟踪,从表 3可以看出,当浓度为2 mg·mL-1时,其对朱砂叶螨成螨24 h的校正死亡率为90.61%,这些结果进一步证实欧亚旋覆花中的有效活性物质是棕榈酸乙酯,有很强的触杀作用。

图 1 流分33的GC/MS总离子流图 Fig.1 Total ion current analysis of G33
图 2 棕榈酸乙酯的GC/MS总离子流图 Fig.2 Total ion current analysis of ethyl palmitate
表 2 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨雌成螨触杀活性的毒力回归方程(24 h) Tab.2 Toxicity regression equation of ethyl palmitate against T. cinnabarinus female adults (24 h)
表 3 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨的触杀作用 Tab.3 Mortality of ethyl palmitate from I.britanica against T.cinnabarinus
2.3 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内总蛋白含量的影响

图 3可以看出:棕榈酸乙酯处理朱砂叶螨后的24 h中,处理组的总蛋白含量变化趋势与对照组大致相符,表现为先升后降的趋势;总体看来,朱砂叶螨经棕榈酸乙酯处理后,处理组的总蛋白含量大部分时间高于对照组,但是在处理16 h后,与对照组相比,处理组的总蛋白含量表现出更为明显的下降,到24 h时处理组反而低于对照组,这可能是由于处理组已经进入死亡状态,导致各种蛋白含量急剧下降。

图 3 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨总蛋白含量的影响 Fig.3 Effect of protein content of the ethyl palmitate against T.cinnabarinus
2.4 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响

图 4可以看出:棕榈酸乙酯处理朱砂叶螨后的24 h中,处理组谷胱甘肽-S-转移酶活力变化趋势与对照组大致相符,4~8 h稍有下降,8~16 h大体为上升,16~24 h有不同程度的下降;在处理后16 h,处理组与对照组的谷胱甘肽-S-转移酶活力均有一个峰值,处理组的比活力为87.03 U·mg-1,而对照组为71.14 U·mg-1;与对照组相比,处理组的酶活力明显高于对照组,尤其在4 h和20 h,处理组的比活力分别为对照组的1.8倍、1.9倍。这说明棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内谷胱甘肽-S-转移酶有较强的激活作用。

图 4 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响 Fig.4 Effect of GST activity of the ethyl palmitate against T. cinnabarinus
2.5 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内乙酰胆碱酯酶活性的影响

图 5可看出:棕榈酸乙酯处理朱砂叶螨后,随着时间的变化,对照组与处理组的乙酰胆碱酯酶活力均有先降后升的趋势,4 ~ 8 h有显著下降,而在16 h后略有升高;总体看来,朱砂叶螨经棕榈酸乙酯处理后,处理组的乙酰胆碱酯酶活力均高于对照组;在处理后的8 h内,处理组的比活力显著高于对照组,尤其在4 h,处理组的比活力为对照组的5.7倍。因此,棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内乙酰胆碱酯酶有一定的激活作用。

图 5 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨乙酰胆碱酯酶活性的影响 Fig.5 Effect of AchE activity of the ethyl palmitate against T. cinnabarinus
2.6 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内Na+-ATP酶活性的影响

图 6可以看出:棕榈酸乙酯处理朱砂叶螨后,处理组和对照组的Na+-ATP酶活力大体表现为下降趋势,尤其在4~8 h有显著下降;而对照组的酶活性有一次较明显的先升后降的过程,在16 h时有一个峰值,比活力升高到3.14 U·mg-1,此时对照组的比活力为处理组的1.9倍;从总体趋势来看,朱砂叶螨经棕榈酸乙酯处理后,处理组的Na+-ATP酶活力始终低于对照组,表明棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内Na+-ATP酶的活性有明显的抑制作用。

图 6 棕榈酸乙酯对朱砂叶螨Na+-ATP酶活性的影响 Fig.6 Effect of Na+-ATPase activity of the ethyl palmitate against T.cinnabarinus
3 讨论

欧亚旋覆花作为一种常用的中药植物,含有多种倍半萜类、黄酮类和类固醇类化合物(Bai et al., 20052006Park et al., 2000Kim et al., 2002)。目前,关于欧亚旋覆花提取物具有杀菌、抗氧化和细胞毒等作用的研究很多(丁海新等,2005Bai et al., 2005Park et al., 1998),但有关欧亚旋覆花提取物的有效活性成分对朱砂叶螨生物活性的影响还未见报道。

笔者通过生物活性跟踪发现:当浓度为2 mg·mL-1时,棕榈酸乙酯对成螨24 h的校正死亡率为90.61%,其对成螨触杀的LC50值为(1.255 ± 0.167) mg·mL-1,这表明棕榈酸乙酯对朱砂叶螨成螨具有很强的触杀活性。进而笔者又通过测定棕榈酸乙酯对朱砂叶螨体内几种酶活性的影响,对棕榈酸乙酯的杀螨作用机制进行了初步研究。谷胱甘肽-S-转移酶是螨类体内重要的解毒酶系,它能催化内源性的还原型谷胱甘肽与外源化合物的亲电子基团发生轭合,最终形成易溶于水的产物,再经代谢排出体外,从而降低它们的细胞毒性。因此,谷胱甘肽-S-转移酶的升高可作为试螨解毒代谢作用的敏感指标。乙酰胆碱酯酶的主要功能是水解突触的乙酰胆碱,以保持正常的神经功能。乙酰胆碱酯酶被抑制会造成乙酰胆碱的积累,从而阻断突触的神经传递,最终导致昆虫过度兴奋而死亡。ATP酶存在于组织细胞及细胞器的膜上,是生物膜上的一种重要的蛋白酶,在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要作用(王镜岩等,1999)。Na+-ATP酶是其中的一种,它对维持细胞内Na+的稳定,保持细胞内外Na+的平衡及神经细胞的兴奋和传导起到非常重要的作用(刘素媛等,1999)。

棕榈酸乙酯作为一种药剂已在生物和医学领域得到一些应用。Rothwell等(19982000)通过静脉输注棕榈酸乙酯抑制兔网状内皮系统,以维持人血小板在兔血液中的循环。本研究首次发现:从欧亚旋覆花的石油醚提取物分离得到的38个流分中,具有最佳杀螨活性的物质是棕榈酸乙酯。研究表明:用棕榈酸乙酯处理朱砂叶螨后,其体内的谷胱甘肽-S-转移酶被明显激活,同时在处理后4~8 h内乙酰胆碱酯酶也被较强激活。谷胱甘肽-S-转移酶是螨类体内重要的解毒酶系,这说明棕榈酸乙酯进入生物体后,会引起谷胱甘肽-S-转移酶活性的增高来加强代谢,以保证生物体的正常生理活动。但是,棕榈酸乙酯对Na+-ATP酶具有强烈的抑制作用,可能会破坏细胞内外Na+的平衡,影响神经细胞的兴奋和传导,造成神经传递的阻断,最终导致螨体的死亡。但对其明确的作用机制还有待于进一步研究确定,同时笔者将进一步对其毒理进行深入研究。

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