林业科学  2012, Vol. 48 Issue (4): 49-55   PDF    
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文章信息

杨玲, 单琳, 沈海龙, 祁永会
Yang Ling, Shan Lin, Shen Hailong, Qi Yonghui
花曲柳体胚发生和植株再生
Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration of Fraxinus rhynchophylla
林业科学, 2012, 48(4): 49-55.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(4): 49-55.

文章历史

收稿日期:2011-08-24
修回日期:2012-01-10

作者相关文章

杨玲
单琳
沈海龙
祁永会

花曲柳体胚发生和植株再生
杨玲1, 单琳1, 沈海龙1, 祁永会2    
1. 东北林业大学林学院 林木遗传育种国家重点实验室 哈尔滨 150040;
2. 黑龙江省林业科学研究所 哈尔滨 150040
摘要: 以花曲柳合子胚的单片子叶为外植体成功诱导出体胚并获得再生植株。未成熟合子胚的子叶在添加400 mg·L-1水解酪蛋白、0.25 mg·L-1 6-BA、1.5 mg·L-1 NAA、70 g·L-1蔗糖和6 g·L-1琼脂的MS1/2培养基上可以成功诱导产生体胚,诱导率达到34.7%,每个外植体上体胚数量为2~9个。成熟合子胚的子叶在添加0.25 mg·L-1 6-BA、2 mg·L-1 NAA的MS1/2培养基(其他成分同上)上可以成功诱导产生体胚,诱导率为10.0%。体胚在MS1/2培养基上经过成熟培养后可以正常萌发,萌发率87.6%。萌发的体胚植株在MS1/2+0.01 mg·L-1NAA培养基上生长较好,具备实生幼苗的外观特征。经炼苗后的体胚苗移植到栽培基质(草炭土:蛭石:珍珠岩体积比为5:4:1)中可以正常生长,成活率为75.0%。
关键词:花曲柳    组织培养    体细胞胚胎发生    植株再生    
Somatic Embryogenesis and Plantlet Regeneration of Fraxinus rhynchophylla
Yang Ling1, Shan Lin1, Shen Hailong1 , Qi Yonghui2    
1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding School of Forestry, Northeast Forestry University Harbin 150040;
2. Heilongjiang Province Forest Science Research Institute Harbin 150040
Abstract: Somatic embryogenesis and plant regeneration of Fraxinus rhynchophylla were obtained by using single cotyledons of zygotic embryos as explants. Cotyledons of immature zygotic embryos, cultured on half strength MS medium supplemented with 400 mg·L-1 hydrolyzed casein, 70 g·L-1 sugar, 6 g·L-1 agar, 0.25 mg·L-1 6-BA and 1.5 mg·L-1 NAA, were able to be successfully induced somatic embryos. The somatic embryo (SE) induction rate could reach 34.7% and about 2-9 SEs were produced per each explant. However, cotyledons from mature zygotic embryos, culture on a similar medium with modification of adding extra 0.5 mg·L-1 NAA, and the SE induction rate could reach 10.0%. Somatic embryos after in vitro maturation on a MS1/2 medium could normally germinate, and the germination percentage rate reached to 87.6%. The germinated somatic plantlets grew well on MS1/2 medium containing 0.01 mg·L-1 NAA and had the similar morphological characteristics of zygotic seedlings. Acclimated somatic plantlets grew normally after transplanted in a medium with 50% peat moss, 40% vermiculite and 10% polite, with 75.0% survival rate.
Key words: Fraxinus rhynchophylla    tissue culture    somatic embryogenesis    plant regeneration    

花曲柳(Fraxinus rhynchophylla)为木犀科(Oleaceae)白蜡树属(Fraxinus)落叶乔木树种,主产长白山区,在黑龙江省主要分布在东南部林区,在吉林省东南部山地向松辽平原过渡地带的低山丘陵区以及辽宁省东部山区和华北各省有分布; 在朝鲜、俄罗斯远东地区也有分布(周以良,1986)。花曲柳抗逆性强,材质坚硬致密,花纹美丽; 树皮为中药“秦皮”,可清肝热、止痢、明目、主治肠炎; 种子可榨油,供制肥皂(周以良,1986),是一种重要的装饰用材树种、药用树种和园林绿化树种。

体胚发生过程是一个起源于非合子细胞,经过类似合子发育过程,形成具有两极结构、与周围组织无维管束联系的结构的过程(Arnold et al., 2002)。对于大多数树种(针叶树和阔叶树)来说,体胚发生是最好的无性繁殖组织培养方法(Stasolla et al., 2003; Merkle et al., 2005; Oh et al., 2010)。体细胞胚可以用于胚胎发育研究,也可以用于大规模的无性繁殖(Arnold et al., 2002)。在离体培养条件下,体胚发生是形态发生和植株再生的一条重要途径,因其高效转化成完整植株的能力、高度的遗传稳定性和用于基础研究的巨大潜力而受到广泛重视,它在良种繁育方面具有更高的应用潜力(沈海龙,2005)。近几十年来,关于白蜡树属植物器官发生途径的植株再生的报道较多,而关于体胚发生途径植株再生的研究相对较少。目前,通过器官发生途径中腋芽增殖获得再生植株的有美国白蜡(F. americana)、欧洲白蜡(F. excelsior)、对节白蜡(F. hupehensis)、美国红梣(F. pennsylvanica)、白蜡树(F. chinensis)、绒毛白蜡(F. velutina)等(Arrillaga et al., 1992; 叶景丰等,2010; Silveira et al., 1994; Hammatt et al., 1992; 王彩云等,1999; Kim et al., 1997; 毕君等,2010; 王磊等,2008; 陈之群等,2006)。在美国白蜡以及欧洲白蜡的组织培养中,均采用幼嫩的茎尖作为外植体(Arrillaga et al., 1992; Hammatt,1994; Hammatt et al., 1992)。洪源范等(2006)用花曲柳带腋芽茎段在MS培养基上添加6-BA 0.2 mg·L-1 +KT 0.8 mg·L-1+IBA 0.2 mg·L-1实现了腋芽增殖,增殖系数为2.5; 李素华和何松林(2009)研究发现,基本培养基对常青白蜡(F. griffithii)腋芽诱导率影响最大,在WPM培养基中添加6-BA 5.0 mg·L-1 + NAA 0.5 mg·L-1为最适合常青白蜡的腋芽诱导培养配方。Preece等(1987)首次报道了美国白蜡的体胚发生和植株再生技术,随后Tonon等(2001)也成功地实现了细叶白蜡(F. angustifolia)的体胚发生和植株再生; 孔冬梅等(2006)以水曲柳(F. mandshurica)未成熟合子胚的子叶和胚轴为外植体通过体胚发生途径获得了再生植株; Capuana等(2007)成功地诱导出欧洲白蜡体胚。但迄今为止,关于花曲柳体胚发生和植株再生尚未见报道。

本文研究了合子胚成熟程度、不同浓度的植物生长调节剂(NAA和BA)的组合对花曲柳体胚诱导的影响,并阐述了花曲柳体胚植株的移栽和驯化培养方法。研究结果可用于花曲柳优良植株的扩大繁殖和种质资源保护。

1 材料与方法 1.1 材料采集与处理 1.1.1 材料采集

未成熟种子于2010年8月2日取自黑龙江省尚志市境内东北林业大学帽儿山实验林场(45°21′N,127°30′E)的野生成年花曲柳植株(图 1-1); 成熟种子于2008年10月上旬采自吉林省红石林业局批洲林场(42°48′N,127°06′E)的野生成年花曲柳植株(图 1-2)。采后于4 ℃保存备用。

图 1 花曲柳体胚发生的形态观察和植株再生培养 Fig.1 Morphological observation on somatic embryogenesis and plantlet regeneration of Fraxinus rhynchophylla 标尺Bars: 1-11. 1 mm; 12-20.1 cm.
1.未成熟种子; 2.成熟种子; 3.刚接种的外植体; 4.接种5天开始萌动的外植体; 5.外植体表面产生的胚性愈伤组织; 6.球形胚; 7.心形胚; 8.鱼雷形胚; 9.子叶形胚; 10.多子叶胚; 11.次生胚;12.子叶期体胚(CE)从外植体上剥离后萌发情况; 13.CE接种见光培养; 14.CE见光后萌发; 15.CE萌发出现胚根; 16, 17.萌发正常体胚苗; 18.移栽基质中保鲜膜覆盖; 19, 20.体胚苗形成完整植株。
1.Immature seeds; 2. Mature seeds; 3. Explant just inoculated; 4. Explant cultured for 5 days; 5. Callus originated on the surface of explant; 6. Globular somatic embryo; 7. Heart somatic embryo; 8. Torpedo somatic embryo; 9. Cotyledon somatic embryo; 10. Somatic embryo with multiple cotyledons; 11. Secondary embryos; 12. Germination of cotyledonary somatic embryos (CE) after separation from explants; 13. CE culturing under light; 14. CE germinated under light; 15. Germinating CE showing root; 16, 17. Germination of CE and plantlet originating from CE; 18. Transplanted to culture vessels covered with plastic wrap; 19, 20. Acclimatized somatic embryo-derived plantlets.
1.1.2 材料处理

1) 未成熟种子处理:剥除外种皮,把种子置于烧杯中,用流水冲洗20 min,用75%酒精灭菌30 s,用2% NaClO消毒10 min,无菌水冲洗6次。2)成熟种子处理:将种子剥除外种皮后置于烧杯中,加入2~3滴吐温,2~3 h换1次水,用搅拌器搅拌72 h,后用流水冲洗1 h,75%酒精灭菌30 s,5%NaClO3消毒15 min,无菌水冲洗6次。将消毒处理后的种子在超净工作台上用无菌解剖刀在种子较宽一端(为胚轴端)切除1/3,挤出种子内的胚,用解剖刀切取单片子叶作为外植体平行接种到诱导培养基上(子叶内侧接触培养基)。

1.2 体胚诱导培养 1.2.1 合子胚成熟程度对体胚发生的影响试验

诱导培养基组成:以MS1/2(MS所有成分均减半)为基本培养基,附加400 mg·L-1水解酪蛋白(CH),70 g·L-1蔗糖,0.25 mg·L-1 6-BA,2 mg·L-1 NAA和6 g·L-1琼脂粉。在灭菌前将培养基pH调节为5.8。每种培养基重复5个培养皿,每皿接种10个外植体。将培养皿放置在培养温度为(24 ± 2)℃,相对湿度为40%~70%下暗培养。在培养过程中每天观察培养物状态和体胚发生情况。培养30天时,记录体胚发生情况,计算体胚诱导率。

1.2.2 生长调节剂对体胚发生的影响试验

分别用0,0.25,0.5,0.75 mg·L-16-BA与0,0.5,1,1.5,2 mg·L-1 NAA组合。其余条件同1.2.1。

1.3 体胚的成熟和萌发培养

将诱导培养30天后外部形态发育完整的子叶形体胚从培养物上剥离后接种到萌发培养基上。每隔30天将培养物转移到新鲜的培养基上进行继代培养。培养基成分和培养条件同初代培养。

萌发培养基:以MS1/2为基本培养基,不添加任何激素,附加70 g·L-1蔗糖、6 g·L-1琼脂,灭菌前将培养基pH调为5.8。于25 ℃光下培养。光照强度为40 μmol·m-2s-1,光周期16 h光照/8 h黑暗,相对湿度为40%~70%。

1.4 体胚苗的移栽和驯化

当瓶内的体胚苗生长至3~4 cm高、根长4~5 cm且根系发达、具备2~4片充分展开叶片时,进行体胚苗移栽和驯化培养。具体步骤如下: 1)将瓶的封口膜敞开,炼苗3~4天,使小苗适应培养瓶外的室内环境。2)配制栽培基质。栽培基质为草炭土:蛭石:珍珠岩以5:4:1的体积比混合。用无菌水浇透基质(含水量约为60%~80%),用于体胚苗的移栽。3)用镊子将体胚苗小心地从瓶中取出,用无菌水洗净体胚苗根部的琼脂,尽量使根系舒展开放入基质中,然后用手将体胚苗茎基部的基质压实,再在培养钵上覆盖一层保鲜膜(起保湿作用)。4)将体胚苗置于培养室培养,从光照培养的第7天开始逐步掀开保鲜膜,使幼苗适应温室内的环境,至移栽的第15天完全去除保鲜膜,使体胚苗暴露在温室内生长,以后转移到田间栽培。培养期间随时观察并记录体胚苗生长状况。

1.5 统计分析

应用Excel 2003软件进行数据处理,应用SPSS17.0软件对数据进行方差分析和多重比较。表格和图中数据均为各重复处理的平均数±标准差。标准差是由每个试验的5个重复处理计算出来的。采用方差分析评价试验中各影响因素的作用,并在P=0.05水平上进行显著性检验。平均数间统计学差异用邓肯多重比较法在P=0.01或0.05显著性水平上检验。计算公式如下:

愈伤组织诱导率(%)=产生愈伤组织的外植体个数×100/接种存活外植体总数;

体胚诱导率(%)=产生体胚的外植体个数×100/接种存活外植体总数;

体胚萌发率(%)=胚根、茎芽均伸长的体胚个数×100/接种体胚总数;

体胚苗再生率(%)=发育成完整植株的体胚个数×100 /试验用体胚总数;

体胚苗移栽成活率(%)=移栽成活株数×100/移栽总株数。

2 结果与分析 2.1 体胚诱导培养 2.1.1 合子胚成熟程度对体胚诱导的影响

花曲柳成熟或未成熟的合子胚的单片子叶接种到诱导培养中(图 1-3),在接种3天后观察,子叶开始萌动,子叶的尖端和切口处朝向培养基生长,成小半圆弧形; 5天后,白色子叶逐渐转为微黄色,且略有膨胀(图 1-4); 未成熟合子胚的子叶在培养10天左右(成熟胚的子叶为培养15天左右),子叶开始出现轻微褐化,并且在外植体表面出现少量晶莹的愈伤组织,外植体表面呈现淡黄色(图 1-5); 未成熟合子胚的子叶在培养20天时(成熟合子胚为培养27天)时,在外植体表面观察到球形胚(图 1-6)和心形胚(图 1-7); 此后,体胚发育经历鱼雷形体胚(图 1-8)、子叶形胚阶段(图 1-9),同时观察到多子叶的畸形胚(图 1-10)和次生体胚(图 1-11)存在。

合子胚成熟程度对花曲柳愈伤组织诱导率和体胚诱导率的影响见表 1。在MS1/2+0.25 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 NAA中,未成熟子叶期合子胚启动的时期较成熟合子胚早,且产生体细胞胚的诱导率高(诱导率为34.7%,成熟种子的是4.0%)。成熟合子胚的子叶启动明显较慢且只有少量褐化的子叶在外植体表面或切口处产生体胚,但每个外植体上体胚数量明显多于未成熟合子胚(未成熟种子为6.2个,而成熟种子为10.5个)。相同诱导条件下,当培养基中含有0.25 mg·L-1 6-BA和1.5 mg·L-1 NAA时,未成熟合子胚的体胚诱导率最高(34.7%); 当添加0.25 mg·L-16-BA和2 mg·L-1 NAA时,成熟合子胚的体胚诱导率最高(10.0%)。

表 1 合子胚成熟程度对花曲柳愈伤组织和体胚诱导的影响 Tab.1 Effects of zygotic embryo maturity on induction of callus and somatic embryo of Fraxinus rhynchophylla
2.1.2 生长调节剂组合对体胚诱导的影响

1) NAA和6-BA组合对未成熟合子胚的体胚诱导的影响植物生长调节剂对花曲柳未成熟合子胚愈伤组织和体胚诱导的影响 见图 2。单独使用6-BA时,培养基中添加不同浓度的6-BA均未诱导出体胚,但均诱导产生了愈伤组织。6-BA浓度对花曲柳愈伤组织诱导的影响显著(P=0.001)。随着6-BA浓度的增加,愈伤组织诱导率先增加后降低; 当6-BA浓度为0.5 mg·L-1时,达到最大愈伤组织诱导率75.0%;但当6-BA浓度达到0.75 mg·L-1时,愈伤组织诱导率下降为2.0%(图 2A)。

图 2 不同浓度植物生长调节剂组合对花曲柳未成熟合子胚愈伤组织和体胚诱导的影响 Fig.2 Effect of NAA and 6-BA on induction of callus and somatic embryos from cotyledons of immature zygotic embryos of Fraxinus rhynchophylla 不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Different letters in each column indicate significance according to LSD (P<0.05).

单独使用NAA时,NAA浓度对花曲柳体胚诱导的影响不显著(P=0.435),但对愈伤组织诱导的影响显著(P=0.000)。随着NAA浓度的增加,愈伤组织诱导率增加,在NAA为0.5,2 mg·L-1时,愈伤组织诱导率为100%。当NAA为0,0.5,1,1.5 mg·L-1时,体胚诱导率均为0;只有NAA为2 mg·L-1,体胚诱导率为5.0%。

不同浓度的6-BA与NAA组合处理对花曲柳体胚诱导率和愈伤组织诱导率的影响均极显著(P=0.002; P=0.000)。当6-BA为0.5 mg·L-1时,NAA浓度为1 mg·L-1时愈伤组织诱导率达到最大(100%),其次是NAA 2 mg·L-1时,愈伤组织诱导率为96.0%。当NAA浓度为0.5 mg·L-1时,随着6-BA浓度增加,体胚诱导率增加; 而当NAA浓度为1,1.5,2 mg·L-1时,随着6-BA浓度增加,体胚诱导率先下降后增加。当1.5 mg·L-1NAA和0.25 mg·L-16-BA组合时,体胚诱导率最大(34.7%); 当2 mg·L-1NAA和0.25 mg·L-16-BA组合时,体胚诱导率位居第2(33.9%)(图 2B)。

2)NAA和6-BA组合对成熟合子胚体胚诱导的影响 植物生长调节剂对花曲柳成熟合子胚愈伤组织和体胚诱导的影响见图 3。在花曲柳成熟种子体胚诱导中发现,在MS1/2培养基中单独添加不同浓度的6-BA或NAA的,均未产生体胚和愈伤组织。不同浓度的6-BA与NAA结合处理对体胚及愈伤组织诱导率的影响均显著(P=0.010; P=0.000)。当6-BA 0.25 mg·L-1时体胚诱导率随着NAA浓度增加而增大,当NAA为2 mg·L-1时体胚诱导率达到最大(图 3A); 当6-BA 0.5 mg·L-1时,体胚诱导率随着NAA浓度增加先增大后减小; 当6-BA浓度为0.75 mg·L-1时,只有与1.5 mg·L-1NAA组合才能诱导出体胚。当NAA浓度为2 mg·L-1时,体胚诱导率随着6-BA浓度的增加而减小。当2.0 mg·L-1NAA和0.25 mg·L-16-BA组合时,体胚诱导率达到最大(10.0%); 其次是1 mg·L-1NAA和0.5 mg·L-16-BA的组合(体胚诱导率为6.0%)(图 3B)。

图 3 不同浓度植物生长调节剂组合对花曲柳成熟合子胚愈伤组织诱导和体胚诱导的影响 Fig.3 Effect of NAA and 6-BA on induction of callus and somatic embryos from cotyledons of mature zygotic embryos of Fraxinus rhynchophylla 不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。Different letters in each column indicate significance according to LSD (P < 0.05).
2.2 体胚的成熟和萌发培养

子叶形体胚在不加植物生长调节剂的MS1/2培养基上成熟培养30天后,转移到MS1/2 +蔗糖70 g·L-1+琼脂6 g·L-1的萌发培养基上。15天左右,子叶形体胚萌发,表现为子叶转绿,胚根伸长,体胚萌发率为87.6%(图 1-12~15)。将萌发状态较好的植株转移到相同培养基上(MS1/2 +蔗糖70 g·L-1+琼脂6 g·L-1)继续培养,培养20天时统计,植株再生率为12.8%(图 1-16)。在相同培养基和培养条件下,培养基中添加NAA 0.01 mg·L-1,即MS1/2 +NAA 0.01 mg·L-1 +蔗糖70 g·L-1 +琼脂6 g·L-1,可以促进植株生根,植株的再生率得到显著提高(45.5%)(图 1-17)。

2.3 体胚苗的移栽和驯化

再生小植株移栽到草炭土:蛭石:珍珠岩=5:4:1 (VVV)的栽培基质中,用塑料薄膜遮盖,每天定时补充水分,待叶片转为深绿,逐渐掀去塑料薄膜,使幼苗适应温室内的环境,至移栽的第15天完全去除保鲜膜,使体胚苗暴露在温室内生长。移栽培养30天统计体胚苗移栽成活率为75.0%(图 1-18~20)。

3 结论与讨论

在植物发育的不同阶段,外植体因生理状态不同在相同的培养条件而会产生不一样的反应。一般说来,合子胚是体胚诱导的最适外植体(Preece et al., 1992)。现有的报道中,白蜡树属植物体胚发生均以合子胚为外植体(孔冬梅等,2003)。像其他大多数植物一样,合子胚的发育阶段对白蜡树体胚诱导非常关键。细叶白蜡(F. angustifolia)体胚诱导过程中,选择胚乳为液体而子叶刚形成时的合子胚才能诱导出体胚(Tonon et al., 2001); Capuana等(2007)的研究结果表明,选择子叶刚形成、胚乳刚开始固化的欧洲白蜡合子胚为外植体,可以诱导体胚并形成再生植株。但Preece等(1992)在研究中发现美国白蜡的最适外植体为成熟的合子胚。本研究中分别以未成熟合子胚(子叶形成、胚乳固化的时期)和成熟脱水后的合子胚为外植体,进行了花曲柳体胚诱导试验,发现这2种合子胚发育时期均可以产生体胚,这与Tonon等(2001)Capuana等(2007)的研究结果相似。本研究中发现花曲柳成熟合子胚的愈伤组织诱导率明显高于未成熟合子胚,这与Kunitake等(1993)的研究结果一致,他们在试验中发现,成熟合子胚比未成熟合子胚的胚性愈伤组织诱导率高出6倍。本研究结果中,花曲柳未成熟合子胚较成熟合子胚更适合诱导出体胚,体胚诱导率显著高于成熟合子胚。这个结果与Kim等(2003)的研究结果一致,他们发现未成熟的合子胚有较高的体胚诱导率。成熟合子胚体胚产生频率不高的原因可能是由于合子胚从发育到成熟过程中内源物质含量以及生理状态不同(张鹏等,2006),导致不同发育时期的合子胚在诱导体胚试验中所需要的激素种类或浓度不同。外部因素(例如培养基组成,光照、温度和培养基中诱导物的存在)对试管内细胞和组织的发育有显著的影响(Pinto et al., 2008)。目前已经知道某些因素在木本植物体胚形成过程中有促进作用,例如在诱导培养基中增加碳水化合物含量可以促进现代月季(Rosa hybrida)体胚的产生(Blanc et al., 1999)。在今后的研究中,可以尝试对外植体材料进行预处理(如渗透胁迫、冷处理)或在培养基中加入活性炭等添加物质、改变继代周期、提高培养基中蔗糖浓度以及改变培养条件等方法来提高花曲柳体胚诱导率。

体胚发生研究中,培养基的选取一直是研究的重要内容。在外植体一定的情况下,基本培养基选择的合适与否直接影响组织培养的效果(Lemmetyinen et al., 1998)。在本文的前期研究中,选择了B5和MS1/2两种培养基供试,结果在B5培养基上不能诱导出体胚,而在MS1/2培养基上成熟种子的体胚诱导率为10.0%,说明MS1/2培养基较B5更适合作花曲柳体胚诱导的培养基。该研究结果与孔冬梅等(2006)的研究结果相似,水曲柳在B5培养基上体胚的诱导率为2.0%,而在MS1/2培养基上体胚诱导率可达18.0%。

花曲柳体胚发生通过间接发生途径产生,经历球形胚、心形胚、鱼雷形胚到子叶形胚这4个典型发育过程,最后到发育成熟,这与大多数植物体胚发生过程相同(沈海龙,2005; 顾玉红等,2004; 冯大领等,2004; 王义等,2008)。在植物体胚发生和植株再生研究中,体胚诱导的同步性非常重要(张宇等,2007)。作者对花曲柳体胚发生的同步性进行了分析,结果表明花曲柳体胚发生同步性较好。以未成熟合子胚为外植体时,平均每个外植体上子叶形体胚的同步化比率可达71.5%;以成熟合子胚为外植体时,平均每个外植体上子叶形体胚的同步化比率可达85.0%。

本文首次报道了由花曲柳合子胚途径成功诱导出体胚并获得了再生植株。这个有效的植株再生过程可以应用于花曲柳珍贵遗传资源的扩大繁殖和种质资源保存程序中。

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