光肩星天牛(Anoplophora glabripennis)(ALB)是我国重要的林木蛀干害虫之一，尤其是对以杨树(Populus spp.)为主体的速生用材林和防护林造成严重破坏(黄竞芳, 1991)，在我国“三北”防护林体系中，光肩星天牛问题越来越突出。光肩星天牛具有生命周期较长，生活史隐蔽，天敌少，食物充足等特点，防治起来比较困难。传统的防治方式主要是化学防治，这使得光肩星天牛抗药性增加，且污染环境，破坏生态平衡和伤害非靶标生物，因而寻找可替代的生物杀虫剂已经刻不容缓。

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)符合成为生物制剂一些基本要求，即对温血动物和植物无害、容易培养、致病性足以使害虫数量减少至许可水平之下等，因而在生物防治中占有特殊地位。利用球孢白僵可防治棉铃虫(Helicoverpa armigera)、玉米螟(Ostrinia furnacalis)、大豆食心虫(Leguminivora glycinivorella)、马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata)、桃小食心虫(Carposina niponensis)等大田和果树害虫, 以及松毛虫(Dendrolimus spp.)等森林害虫(翟锦彬等, 1997)。国内外曾有一些应用白僵菌防治天牛的研究(刘玉军等，2008; 马良进等，2006; 李建庆等，2006; 周嘉熹等, 1991; 许国庆, 1991; Eken, et al., 2006; Dubois et al., 2004a; Dubois et al2004b; Dubois et al2008; Hajek et al., 2006), 但未见有关白僵菌对光肩星天牛幼虫入侵及致病过程的报道。本试验应用扫描电镜对白僵菌在光肩星天牛幼虫体表的发生发展过程进行观察，同时采用石蜡切片对中肠组织的变化进行研究，为了解白僵菌对光肩星天牛的侵染过程及两者之间的相互作用方式提供依据。

1 材料与方法 1.1 供试菌株

供试菌株是2006年从光肩星天牛幼虫上分离的球孢白僵菌菌株BF，现保存于北京林业大学森林保护实验室。在PDA斜面上接种并培养8天后刮下分生孢子, 放入含吐温-80(0.5mL·L^-1)的灭菌蒸馏水中，在磁力搅拌器上搅拌使分生孢子完全分散后，用3层医用纱布过滤菌液，经血球计数器计数，配制成10⁸个·mL^-1的孢子悬浮液。

1.2 供试昆虫

光肩星天牛卵采自北京市大兴区104国道旁旱柳(Salix matsudana林，对卵进行表面消毒并在灭菌人工饲料中饲喂1周后，挑选大小一致的健康幼虫作为供试虫体。具体方法参见邓彩萍等(2008)。

1.3 接种及取样方法

用灭过菌的软毛笔将配制好的孢子悬浮液轻轻刷到60头幼虫体表，以含吐温-80(0.5 ml·L^-1)的灭菌蒸馏水作对照。接种后的幼虫放入底部衬有滤纸的培养皿中，并放入少量新鲜旱柳木屑(旱柳枝经无菌水冲洗3次后，用75%酒精消毒)，培养皿用Parafilm膜封口保湿。将接种虫放在28 ℃培养箱内黑暗饲养。接种后每天观察光肩星天牛幼虫存活情况及感染病虫的外部特征，此外分别于36，48，60，70，84，96，120 h时取接菌幼虫、明显感病幼虫、刚死亡的幼虫、僵硬的幼虫，以及可见白僵菌菌丝穿出幼虫体壁的虫体用于制作扫描电镜样品。

1.4 扫描电镜样品制备及观察

样品经2.5%戊二醛固定过夜，磷酸缓冲液洗4次，每次30 min。30%，50%，70%，80%，90%，100%酒精逐级脱水，每级30 min。乙酸异戊酯置换2次，每次30 min。临界点干燥，粘铜台喷金。在HITACHI S-3400N扫描电镜下观察、拍照。

1.5 球孢白僵菌芽管长度测量及数据分析

在扫描电镜观察过程中，将侵入虫体体壁的芽管长度进行测量。随机选取60个，并测算平均值。

1.6 石蜡切片样品处理及组织切片制备

接菌后3天时取样。采用常规光学切片制作方法，即波恩液固定、乙醇逐级脱水、二甲苯透明，浸蜡、包埋，AO-820旋转式薄片切片机切片，苏木精-伊红复染，并在Leica光学显微镜下观察、拍照。

2 结果与分析 2.1 光肩星天牛幼虫感染球孢白僵菌后感病症状

光肩星天牛幼虫接种白僵菌后，接菌后36 h对触碰的反应、外表与正常幼虫无差别。从2天后开始，幼虫反应迟钝、麻痹，幼虫在接菌3~4天后出现死亡，刚死亡时身体柔软，之后逐渐僵硬，并随时间推移死亡率逐渐增高。死亡的幼虫并非表现一致的死亡症状，有些虫体被紧密生长的白色菌丝覆盖; 有些虫体表面未见菌丝，但在表皮外部有明显的淡紫红色变色现象，且许多虫尸的气门或肛门处有黑色斑点; 将体表未长菌丝的幼虫尸体保湿培养可长出白色菌丝，说明除体表布满白色菌丝外，幼虫变色现象以及产生的黑斑都是白僵菌侵染的症状。

2.2 感染白僵菌后寄主体壁的电镜观察

从扫描电镜观察，白僵菌侵染光肩星天牛幼虫，可由分生孢子萌发的芽管直接侵入表皮，也可以产生附着胞后再侵入。接种后36 h，球孢白僵菌的大量孢子成功附着于体壁不同区域，气孔内侧、刚毛窝，刚毛上也有孢子附着，极个别孢子已经萌发，在孢子一端出现芽状突起，并向体壁穿透(图 1-A)。接种后48 h，大部分孢子已经萌发，多数以芽管形式直接穿透体壁，部分产生附着胞结构，紧贴在体壁上，末端已经侵入体表，在2种侵入结构的末端均能清楚看到与体壁接触位置附近有阴暗物质存在，在附着胞或芽管周围有粘液状物质产生，使得菌体表面凹凸不平(图 1-B，C)。本菌株芽管长度为0.42~6.3 μm，平均长度3.08 μm时即可穿透表皮。接种60 h后，孢子萌发率进一步提高，更多的芽管穿透天牛幼虫体壁，进入体腔中，体表芽管生长迅速，并形成菌丝在寄主体表蔓延(图 1-D)。在70 h时发现有些菌丝有消解现象(图 1-E)，同时在孢子或菌丝之间有丝状物产生(图 1-F)。接种84 h后，可见萌发孢子在寄主体表形成的大量长菌丝相互缠绕(图 1-G)。接种96 h后，菌丝上已开始萌生分生孢子梗和新的分生孢子(图 1-H)。120 h时菌丝体上已密集地萌生出很多分生孢子梗的小突起(图 1-I)，并且在菌丝间形成网状结构，将菌丝连起来(图 1-J)。白僵菌分生孢子的附着、萌发以及侵入等过程并不十分统一，有的孢子萌发快有的而几天后仍未萌发，这与孢子所处的位置有关。电镜观察显示：在孢子聚集较多的地方，往往与昆虫体壁直接接触的孢子首先萌发，而没有直接接触体壁的孢子则萌发较慢，在幼虫头壳区，表皮硬化度比较高，孢子萌发也相对缓慢。粘附于刚毛等部位的孢子萌发也比较慢。

2.3 寄主感染球孢白僵菌后中肠的组织病理变化

天牛幼虫的中肠与其他昆虫不同，其身体横切面显示出3个中肠截面，这是因为天牛幼虫阶段是取食的主要虫期，幼虫的消化道一般很长，可达体长的2倍以上，中肠一般占消化道总长的3/5以上，在体腔内折转2次(蒋书楠, 1989)。图 2-A是健康天牛幼虫中肠组织的石蜡切片图，中肠呈圆形或椭圆形，中肠环肌组织紧密排列、结构整齐，围食膜清晰可见，内部包含着食物。肠腔内，脂肪体结构紧密，边缘清晰、圆滑，能清楚看到脂肪体内的细胞核，游离于体腔中的马氏管饱满，呈圆形或椭圆形。接菌3天后观察到中肠已扭曲变形，中肠环肌解离，排列紊乱，肌肉层向内皱褶，围食膜被分解消失。腹部体腔中脂肪体组织结构变松散，边缘变得模糊，细胞核也变得不明显，一些肌肉组织出现空泡。马氏管呈现空泡并变形(图 2-B, C)。

3 结论与讨论

本试验采用扫描电镜和组织切片法研究了球孢白僵菌对光肩星天牛幼虫的侵染过程及感病虫体的组织病理变化。电镜观察显示：球孢白僵菌在接种48 h后就可以通过孢子萌发形成芽管，当平均长度达到3.08 μm时即可侵入幼虫体表，开始对天牛幼虫产生致病作用。李会平(2007)研究发现白僵菌孢子侵染桑天牛(Apriona germari)幼虫体表大多以附着胞形式侵入，也有芽管和菌丝侵入。马新颖等(2000)在研究粉虱拟青霉(Paecillomyces sp.)对黑刺粉虱(Aleurocanthus spiniferus)的侵染时，未发现有附着胞的形成，而是以菌丝直接穿透表皮。本试验观察到球孢白僵菌分生孢子多数以芽管方式入侵体壁，部分以附着胞形式侵入，未曾看到以菌丝侵入表皮的现象，与上述报道结果稍有不同，这可能与菌株和寄主表皮的营养成分有关。当寄主表皮的营养成分有利于虫生真菌的生长时，孢子萌发形成芽管或菌丝就可穿透表皮，当营养不足时，芽管末端形成附着胞(Clarkson et al., 1996)。大多数孢子以芽管形式入侵天牛幼虫体表，说明该白僵菌菌株能较好地利用天牛幼虫的表皮成分，因此致死作用也比较迅速集中。

前人对球孢白僵菌侵染寄主过程的研究一般只观察到白僵菌萌发侵入的形式，对于虫生真菌在寄主体表怎样完成一个生长循环的观察少有报道。本文旨在填补这方面的空白。观察中发现在70 h之后菌丝之间产生了丝状物，分析这可能与菌丝、孢子分泌各种酶液有关，酶液粘稠形成这种现象。网状结构出现在接种后120 h，可能是菌丝生长后期的一种现象，亦可能是本菌株的特性，以上2种现象在国内外均未见报道，具体形成原因还有待研究。

从组织切片来看，光肩星天牛幼虫感染球孢白僵菌后，幼虫体内发生了很明显的病变，中肠、马氏管遭到破坏，肌肉组织、脂肪体等产生空泡、变形、崩溃、解离。这些变化在一些文献中也有类似报道(张奂等，2007; 王音等，2004; 黄冬如等，2005)。体内各组织器官的破坏，使得幼虫无法进行正常的生理活动而死亡，但也不排除白僵菌分泌毒素导致光肩星天牛幼虫死亡的可能性。