SCAR(sequence characterized amplified regions)标记是Paran等(1993)开发的一种新型分子标记。通过对感兴趣的RAPD片段的克隆与测序，并对序列进行分析后设计出一对互补到原RAPD片段两端的24个碱基的引物，用此引物对原来的模板DNA进行PCR扩增，特征序列扩增区域(SCAR)被特异扩增。由于SCAR标记的优点使得其在分子标记辅助选择育种、品种的抗病检测、种质鉴定和种子纯度检验方面有着广泛的应用(Paran et al., 1993；Adam-Blondon et al., 1994；Garcia et al., 1996；Ohmori et al., 1996；Haymes et al., 2000；Kasai et al., 2000；Vidal et al., 2004；刘志勇等, 1999；许勇等，2000；干滟等，2001；刘俊峰等，2003；闫乃红等，2003)。在线虫鉴定方面，Meng等(2004)成功地将南方根结线虫(Meloidogyne incongnita)和爪哇根结线虫(M.javanica)特异的随机扩增多态性DNA片段转化为SCAR标记。用SCAR-PCR引物对可以灵敏地鉴定南方根结线虫、爪哇根结线虫和花生根结线虫(M.arenaria)，并且扩增灵敏度达到1/3条2龄幼虫、雄虫或雌虫。

本文采用松材线虫特异的SCAR片段，设计特异引物，对枯死松树体内分离的大量线虫DNA样本进行标记，并对简易方法提取的单条线虫DNA进行检测，试图探索出有效的松材线虫分子检测技术与方法。

1 材料与方法 1.1 供试线虫株系

线虫主要从我国安徽、广东、云南、重庆、福建、江苏、广西、湖北、浙江等十多个省份的枯死松树上分离得到，少部分线虫来自日本、美国、加拿大、韩国以及中国台湾地区。试验线虫共92个株系，其中松材线虫(B.xylophilus)81个株系，拟松材线虫(B. mucronatus)8个株系，霍夫曼尼伞滑刃线虫(B. hofmanni) 1个株系, 大核滑刃线虫(Aphelenchoides macronucleatus) 1个株系, 长尾属线虫(Seinura sp.)1个株系(表 1)。

1.2 菌株与质粒

大肠杆菌JM 109菌株与质粒载体pGEM^®-T Vector Systems购自Promega公司。

1.3 主要药品与试剂

试剂与药品:Taq DNA聚合酶购自大连宝生物公司；Gel Extraction Mini Kit购自上海华舜生物工程有限公司；IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)，X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)、氨苄青霉素(Ampicillin)购自Promega公司。

培养基:LB(Luria-Bertani)培养基(1 000 mL), 含氨苄青霉素的LB平板, 含Ampicillin/IPTG/X-Gal的LB平板, SOC培养基。

1.4 DNA提取

大量DNA提取:1)取贮存的各线虫群体200 μL于Eppendorf管中，加入200 μL线虫裂解液，混匀；2)在65 ℃水浴中处理1 h，每隔10 min摇荡1次；3)待冷却至室温后，用等体积(400 μL)的酚抽提，4 ℃条件下，12 000 r·min^-1离心20 min，取上清液；4)用等体积(400 μL)的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)抽提，离心；5)用等体积(400 μL)的氯仿：异戊醇(24：1)抽提，离心；6)在上清液中加入1/10体积的3 mol·L^-1的乙酸钠(pH=4.6)和2倍体积的无水乙醇(-20 ℃)，在-80 ℃条件下冷冻20 min；7)12 000 r·min^-1离心20 min，沉淀用70%的乙醇(-20 ℃预冷)洗涤2次室温晾干，沉淀气干1 h；8)待乙醇挥发尽后，加入含有RNA酶的100 μL TE重新悬浮沉淀，RNA酶的浓度为20 μg·mL^-1，贮存于-20 ℃备用。9)取5 μL稀释200倍，用紫外光分光光度计测定DNA的浓度。

少量线虫及单条线虫DNA提取。按照每条线虫，加入10 μL预冷线虫裂解液的比例，将线虫与裂解液置于Eppenddorf管中。在PCR仪上，于70 ℃条件下保温处理35 min；在95 ℃条件下保温处理10 min；12 000 r·min^-1离心2 min，上清液用于扩增。

1.5 特异RAPD片段扩增 1.5.1 RAPD引物

随机引物OPM₀₅: 5′-GGGAACGTGT-3′。

1.5.2 RAPD反应扩增体系

反应的混合液总体积为25 μL，其中10×PCR缓冲液(0.5 mol·L^-1的KCl；100 mmol·L^-1 Tris-HCl, PH=9.0；1% Triton X-100)2.5 μL，2.5 mmol·L^-1的dNTP 2 μL，25 mmol·L^-1的MgCl₂ 2 μL，1 U Taq酶，2 mmol·L^-1的引物1 μL，10 ng·mL^-1的模板DNA 1 μL，高压灭菌重蒸水16.5 μL。

扩增仪器为PTC-200 DNA Engine。

1.5.3 RAPD反应程序

反应混合液在94 ℃预变性5 min；进入循环94 ℃变性1 min，36 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共40个循环；最后72 ℃延伸10 min。

1.5.4 RAPD结果检测

反应结束后，取8 μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中100 V电压条件下电泳180 min，用溴化乙锭染色10~15 min，在BIO-RAD凝胶成像系统上观察、拍照。

1.6 特异RAPD片段的回收纯化

制备0.9%的琼脂糖凝胶，使胶尽可能薄些。将RAPD-PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳至目的片段与其他片段分离开后，在紫外灯下用无菌的刀片将目的片段切割下来。用Gel Extraction Mini Kit对目的片段进行回收。

1.7 特异RAPD片段与载体连接、转化 1.7.1 特异RAPD片段与载体链接

将T－载体和对照连接DNA (control insert DNA)作短暂离心。连接前先轻轻涡旋2×连接缓冲液。

1) 在灭菌的0.5 mL的离心管中分别加入下列成分: 2×连接缓冲液5 μL，T-载体(50 ng·μL^-1) 1 μL，PCR回收产物2 μL，T4 DNA连接酶(3 U·μL^-1)1 μL，加去离子水至终体积10 μL。

2) 用微量移液器轻轻混均反应液后，室温连接1 h，也可在4 ℃下连接过夜(4 ℃下连接过夜可产生最大的转化效率)。

1.7.2 连接产物转化

1) 取出贮存于-80 ℃的JM109感受态细胞置于冰上直至融化(约5 min)，轻弹以混合贮存液，小心转移60 μL JM 109感受态细胞到1.5 mL无菌EP管中，加2 μL连接反应液，置于冰上；2)在冰上轻弹混和，冰浴20 min；3)42 ℃热激45~50 s(其间不能摇动)；4)立即冰浴2 min；5)加950 μL室温SOC培养基(也可用LB培养基)，混匀，在37 ℃摇床中150 r·min^-1振荡培养1.5 h。6)将放置于37 ℃ 30 min的Ampicillin/IPTG/X-Gal LB平板加入100 μL振荡培养的菌液，用涂布器均匀涂布，倒置平板于37 ℃恒温箱中培养过夜(16~24 h)，长出蓝/白斑，含有插入片段的转化菌落为白斑，仅含自连载体的转化菌呈现蓝斑。

1.8 质粒DNA的提取

参见Sambrook等(2005)方法。

1.9 插入片段的鉴定

采用顾晓松等(2002)方法。用扩增目的片段的特异引物对转化细胞DNA进行扩增。电泳检测扩增片段大小，并与目的片段、转化细胞DNA进行比较。凡扩增片段长度与转化的特异RAPD片段长度相符，且转化细胞DNA的迁移率慢于扩增片段DNA以及转化特异RAPD片段，则实现了目的克隆。

1.10 测序

将转化好的细胞DNA送上海博亚生物技术有限公司，采用ABI测序系统，通用引物T7(Promoter TAATA CGACT CACTA TAGGG)和SP6(Promoter CATAC GATTT AGGTG ACACT ATAG)进行测序。

1.11 SCAR引物的设计与合成

根据RAPD特异片段克隆的结果，用Oligo5.0软件设计SCAR引物。设计好的引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

1.12 SCAR标记的PCR验证

反应体系: 2.5 μL 10×PCR缓冲液, 1 μL 2.5 mmol·L^-1的dNTP, 1.5 μL 25 mmol·L^-1的MgCl₂, 1 U Taq酶, 1 μL 2 mmol·L^-1的每种引物, 1 μL 20 ng·mL^-1的模板DNA, 用高压灭菌重蒸水补充体积至25 μL。

反应程序:反应混合液在94 ℃预变性5 min；进入循环94 ℃变性45 s，49 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环；最后72 ℃延伸7 min。

反应产物存于4 ℃，在制胶过程中，加入5%的GOLDVIEW染料(代替溴化乙锭)，1.3%的琼脂糖凝胶电泳，100 V电压条件下电泳60 min，在BIO-RAD凝胶成像系统上观察、拍照。

2 结果与分析 2.1 特异RAPD片段

引物OPM₀₅的扩增见图 1。在松材线虫各株系之间(泳道1~9)均扩增出1条长约2 100 bp左右的明亮清晰条带，而拟松材线虫各株系(泳道10~16)之间均无此条谱带。因此，认为随机引物OPM₀₅为松材线虫的特异随机引物，扩增出松材线虫的特异RAPD谱带记为OPM₀₅-X₂₁₀₀。

2.2 特异RAPD片段分离、回收纯化与克隆

将RAPD特异片段OPM₀₅-X₂₁₀₀进行分离、回收, 与载体pGEM^®-T Vector连接，转化大肠杆菌，放入含氨苄青霉素、IPTG、X-Gal的培养基中培养。进行蓝白斑筛选(图 2)。在蓝白斑筛选的基础上，进一步用PCR法检验重组子质粒。如图 3所示：重组子质粒PCR(泳道3)大小与OPM₀₅-X₂₁₀₀(泳道2)大小一致。pGEMR-T Vector大小为3 000 bp, 其与特异片段OPM₀₅-X₂₁₀₀之和(泳道4)即重组子质粒DNA，迁移率要慢于泳道2和泳道3，表明目的片段已插入载体，实现了目的克隆。

2.3 松材线虫特异片段序列

将片段的重组子质粒DNA送上海博亚生物技术有限公司测序。图 3为OPM₀₅-X₂₁₀₀的序列。该片段预计大小为2 100 bp, 测序片段长为2 092 bp，在序列5′端方框内黑体部分为随机引物OPM₀₅的碱基序列，在3′端方框内斜体部分为随机引物OPM₀₅碱基序列的反向互补序列。在OPM₀₅的碱基序列与反向互补序列之间长度为2 016 bp。

2.4 SCAR标记的建立

根据OPM₀₅-X₂₁₀₀序列, 设计1条正向引物和1条反向引物，组成引物对。正向引物为M₀₅F₂: 5′-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3′，位于OPM₀₅-X₂₁₀₀序列的548~570 bp处，见图 4黑体部分；反向引物为M₀₅R₁: 5′-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3′，位于OPM₀₅-X₂₁₀₀序列的1 124~1 147 bp处，见图 4斜体部分。由于反向引物在随机引物OPM₀₅序列的互补序列内侧，因此引物对M₀₅F₂/R的扩增片段长度小于OPM₀₅-X₂₁₀₀序列的长度。引物对M₀₅F₂/R₁的预期扩增片段长度为600 bp。引物对M₀₅F₂/R₁的退火温度为49 ℃。扩增结果见图 5。

由图 5可见，松材线虫样本(泳道2~10)都能够扩增出1条长为600 bp的条带，且各样本的条带都非常清晰、明亮，而拟松材线虫样本(泳道11~18)均无此带。因此，OPM₀₅-X₂₁₀₀通过引物对M₀₅F₂/R₁可转化为SCAR-X₆₀₀, 为松材线虫特异片段，记为SCAR-M₀₅-X₆₀₀。

2.5 大样本大量线虫扩增结果

从大量线虫中提取DNA，再经引物对M₀₅F₂/R₁扩增，其图谱如图 6所示。引物对M₀₅F₂/R₁在各松材线虫株系间(泳道1~81)均有一明亮、清晰的600 bp条带，而拟松材线虫8个株系(泳道82~89)均无任何条带，霍夫曼尼伞滑刃线虫(泳道90)、大核滑刃线虫(泳道91)、长尾属线虫(泳道92)也未出现600 bp条带。因此，引物组合A在大量样品检测时表现出很高的特异性。2对引物组合均能够准确地将松材线虫与拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫区别开来。因此，可以分别用2对引物组合构建松材线虫检测试剂盒。

2.6 单条线虫检验结果

样品1~6是经过简易方法粗提取的单条线虫DNA，用引物组合M₀₅F₂/R₁扩增，其结果分别见图 7。引物组合同样在3个松材线虫株系间(泳道1~3)均有一明亮、清晰的条带，而拟松材线虫3个株系(泳道4~6)均无任何条带。表明引物组合M₀₅F₂/R₁能够检测出单条松材线虫。线虫不必经过复杂的程序提取DNA，也不需在显微镜进行切割，可直接用裂解液裂解后进行扩增，操作简便，适合生产上应用。

3 结论与讨论

松材线虫RAPD特异片段OPM₀₅-X₂₁₀₀通过引物组合M₀₅F₂/R₁成功转化为SCAR标记(SCAR-M₀₅-X₆₀₀)。正向引物为M₀₅F₂(5′-CGGGT CATGG CTGGA GGTAT CGT-3′)，反向引物为M₀₅R₁(5′-TGGCT CAATG GCAAA TCCTT CGTA-3′)。

通过对枯死松树体内分离的92份线虫样品进行SCAR-PCR检测，松材线虫的检验结果与形态结果完全一致。引物组合在松材线虫株系间均表现有一条600 bp的清晰明亮条带，引物对拟松材线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、长尾属线虫的扩增产物均无该条带产生。由于SCAR-PCR检测结果是判读检测标记的有无，因此，引物对的特异性很强，检测结果便于判读。

采用该标记方法还可以在较短时间内对线虫进行鉴定。提取DNA的时间约50 min；PCR扩增约1 h(如采用快速扩增PCR仪Mastercycler ep，则扩增时间会进一步缩短)；电泳检测时间约30 min。整个检测过程不超过2.5 h, 实现了对松材线虫的快速检测目标。

采用SCAR-PCR尽管可以对单条线虫进行准确鉴定，但在生产上往往需要搞清楚枯死松树是否因松材线虫危害而致死，或是松木包装物内是否含有松材线虫等问题。而枯死松木内或松木包装物内往往有一种线虫或是几种线虫，因此，必须对枯死松树内的线虫或是松木包装物内的线虫进行全面鉴定。如果仅仅对其中的几条线虫进行检测，则有可能导致漏检。当分离线虫量很少时，建议将少量线虫全部裂解检测。当分离线虫量多时，建议随机抽取线虫裂解检测。

从RAPD特异条带筛选、SCAR转化到本试验的线虫检验，所选用样本有来自美国、日本、加拿大以及我国主要病区的松材线虫，还有来自日本、韩国以及我国部分地区的拟松材线虫，来自于我国主要松林分布区内枯死松树上的3种其他线虫，样本具有一定的代表性。从试验结果来看，松材线虫的检测准确率达100%，结果准确、可靠。尽管如此，作为一种检测试剂盒，还需要通过更多的线虫样本进行验证。