文章信息
- 白雪娜, 谷继成, 成军, 师光禄, 王有年
- Bai Xuena, Gu Jicheng, Cheng Jun, Shi Guanglu, Wang Younian
- 瑞香狼毒根的超临界萃取物抑菌活性和成分分析
- Antifungal Activity of Extracts Obtained with Supercritical Carbon Dioxide Extraction from Roots of Stellera chamaejasme and Analysis of Their Constituents Using GC-MS
- 林业科学, 2012, 48(2): 169-174.
- Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(2): 169-174.
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文章历史
- 收稿日期:2010-05-05
- 修回日期:2011-02-20
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作者相关文章
2. 北京农学院植物科学技术学院 北京 102206;
3. 北京农学院生物技术学院 北京 102206;
4. 广东省农业科学院科技情报研究所 广州 510640
2. College of Plant Science and Technology, Beijing University of Agriculture Beijing 102206;
3. College of Biotechnology, Beijing University of Agriculture Beijing 102206;
4. Sci-Tech Information Institiute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences Guangzhou 510640
瑞香狼毒(Stellera chamaejasme)为瑞香科(Thymelaeaceae)植物,广泛分布于我国西北、华北等地(刘欣等,2004)。据《神农百草经》记载,瑞香狼毒与大戟科(Euphorbiaceae)植物狼毒大戟(Euphorbia fischeriana)、月腺大戟(E. ebracteolata)同作狼毒入药,其性味苦平,全草有毒,有逐水祛痰、破积杀虫之功效(张慧文等,2006)。
瑞香狼毒也是一种极具开发潜力的植物源农药。研究发现:瑞香狼毒的氯仿、石油醚、甲醇提取物对山楂叶螨(Tetranychus viennensis)有很好的内吸和触杀活性(曹挥等,2003); 甲醇、石油醚提取物具有抗肿瘤作用(王润田等,2003; 王彬等,2004); 乙醇提取物对菜粉蝶(Pieris sp.)幼虫、亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis)幼虫和桃蚜(Myzus persicae)具有很强的生物活性(Zhang et al., 2002); 瑞香狼毒素、瑞香亭、狼毒色原酮等对菜粉蝶具有杀虫活性(张国洲等,2001); 瑞香狼毒根的乙酸乙酯萃取物对石膏样毛癣菌(Trichophyton mentagrophyte)、桃褐腐病原菌(Sclerotinia laxa)、苹果腐烂病原菌(Cytospora sp.)、小麦赤霉病原菌(Fusahum graminearum)、黄瓜枯萎病原菌(Botrytis cinerea)等多种植物病原真菌具有较强的抑制作用(龚晓霞等,2006; 温哲屹等,2008)。总体来看,对于瑞香狼毒活性成分的研究主要集中于医药抗肿瘤、杀螨和杀虫方面,而在抗菌方面的报道较少。另外,在活性成分的提取方法上,大多采用乙酸乙酯、氯仿、甲醇、丙酮等有机溶剂进行提取。这些提取法,不仅易残留有机溶剂、对产物质量有一定的影响,而且提取的过程也对操作者及环境产生很多危害。超临界CO2萃取是基于超临界流体的优良特性发展起来的高效提取分离技术。CO2临界温度和临界压力相对较低,且无毒、价廉,是一种理想的萃取剂。近年来,超临界CO2萃取技术已经在化工、医药、食品、环境保护、生物工程等领域得到广泛应用(Chester et al., 1994; Brunner,2005)。Peng等(2006)和陈梅等(2008)分别采用超临界CO2萃取技术从瑞香狼毒根部成功提取了的瑞香亭、1,5-二苯基-1-戊酮和杀螨活性成分,为该技术应用于瑞香狼毒活性成分研究提供了很好的范例。
本研究以桃褐腐病菌(Monilinia fructicola)为供试菌种,对瑞香狼毒根的超临界CO2萃取产物及各个分离产物进行了抑菌活性试验,并对抑菌成分进行GC-MS分析,为将瑞香狼毒开发为一种植物源杀菌剂提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料瑞香狼毒由农业部都市农业(北方)重点开放实验室于2008年9月采自山西省朔州市金沙滩。供试菌种:桃褐腐病菌由北京农学院植物病理实验室提供。
1.2 仪器与试剂HA221-50-06型超临界CO2萃取设备(江苏南通市华安超临界萃取有限公司); CO2 (≥99. 5%)由北京亥普北分气体工业有限公司提供; HYP-150型破碎机(北京环亚天元机械技术有限公司); Agilent 6890气相色谱仪-5973N质谱仪(Agilent科技有限公司); Milli-Q纯净水制备系统(美国Millipore有限公司)。所用化学试剂购自北京化学试剂公司,均为色谱纯。
1.3 超临界CO2萃取瑞香狼毒根的脂溶性成分将瑞香狼毒根清洗干净、凉干后粉碎,过直径60目筛,成细粉状,贮存于干燥器中备用。称取1 000 g加入超临界CO2反应釜中。参数设置为: CO2流量21 L·h-1、萃取压力30 MPa、萃取温度46 ℃、分离温度45 ℃、分离压力5. 5 MPa、萃取时间100 min,得黄色黏稠膏状的脂溶性成分。
1.4 瑞香狼毒根的超临界CO2萃取物抑菌活性测定中1) 超临界CO2萃取物抑制菌丝生长 采用平板菌丝生长抑制法。用丙酮将瑞香狼毒超临界萃取物稀释成系列浓度,加入到定量的灭菌后的PDA培养基(45 ℃左右)中,加少许吐温-80,摇匀,配成含萃取物终浓度分别为125,250,500,1 000和2 000 μg·mL-1的培养基,然后倒入直径为90 mm培养皿内制成平板。用同样方法制备含等量丙酮的PDA平板作为阴性对照。用打孔器(直径6 mm)从培养5天的桃褐腐病菌菌落的边缘打取菌饼,分别接种于上述各平板中央位置,置25 ℃下培养,3次重复。定期观察菌落形态,并用十字交叉法测量菌落直径,直到阴性对照菌落即将长满平皿为止,计算抑菌率:抑菌率= [(阴性对照纯生长量-处理纯生长量)/阴性对照纯生长量] × 100%。
以浓度对数-抑菌率值求出回归直线方程及50%病菌受抑制的有效浓度(median effective concentration,EC50)、90%病菌受抑制的有效浓度(90% effective concentration,EC90)。每处理设平行样3个,采用SPSS13. 0软件进行Duncan's差异分析(吴振宇等,2009)。
2) 超临界CO2萃取物对桃褐腐病菌MIC值和MFC值的测定 参照吴振宇等(2009)的方法。将瑞香狼毒根的超临界萃取物与PDA培养基混合,加少许吐温-80,摇匀,制成含萃取物最终浓度分别为31. 25,62. 5,125,250,500,1 000,2 000和4 000 μg·mL-1的PDA平板。以含有等量丙酮的PDA平板作为阴性对照。每板接种100 μL的桃褐腐病菌孢子悬浮液(5 × 104个· mL-1),用无菌涂棒涂布均匀。每处理设3个平行样。置于25 ℃恒温培养箱内培养。48 h后取出观察菌的生长情况,以完全无菌生长的最低药物浓度为最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。在MIC测定的基础上,继续培养7天,以完全无菌生长的最低药物浓度为最小杀菌浓度(minimum fungicidal concentration,MFC),3次重复试验后,计算MIC值和MFC值。
1.5 瑞香狼毒根的超临界CO2萃取物的分离和抑菌活性测定为进一步了解瑞香狼毒根中的抑菌活性成分,采用大孔吸附树脂对其超临界CO2萃取物进行分离。把经乙醇浸泡处理后的大孔吸附树脂(HP-20)装入长为1. 5 m、孔径4 cm的柱子中。先用4倍柱体积的纯净水淋洗树脂,直至用乙醇针检测无乙醇为止。称取超临界萃取物30 g,用丙酮溶解,配制成质量浓度为30 mg·mL-1的样品溶液,装入上样柱中,之后依次用纯水、水:丙酮(体积比为9: 1,7: 3,5: 5,3: 7,1: 9)、纯丙酮洗脱,洗脱剂的流速为1. 5 mL·min-1,约10 min收集1份。然后用薄层层析检测,根据迁移率Rf值的大小合并相同流分。各个流分经旋转蒸发仪去除丙酮,再经冷冻干燥机去除水分,获得各分离组分。再用丙酮溶解各冷冻干燥后的组分,配成含分离组分浓度为2 000 μg·mL-1的PDA培养基,以桃褐腐病菌为供试菌种,进行抑菌活性测定,计算抑菌率。
1.6 GC-MS鉴定超临界CO2萃取物主要物质成分1) GC-MS分析条件 采用Agilent 6890气相色谱仪-5973N质谱仪; HP-5MS 30 m × 0. 25 mm × 0. 25 μm弹性石英毛细管柱。进样口温度280 ℃,柱初温150 ℃,保持2 min,以2 ℃ · min-1升至180 ℃,保持2 min,以5 ℃ ·min-1升至200 ℃,保持3 min,以8 ℃ ·min-1升至250 ℃,保持10 min。载气为高纯氦气,流速1. 0 mL· min-1,进样方式为不分流,进样量1 μL。质谱条件: GC-MS进样口温度280 ℃,离子源温度230 ℃,四极杆温度150 ℃,电离方式EI源,电离能量70 eV,电子倍增器电压1 718 eV,溶剂延迟8 min,检测方式单粒子扫描(SIM),扫描离子m/z 63,79,210。定性分析:采用NIST08 (national institute of standards and technology,USA)质谱数据库进行自动检索获得初步定性结果。结合标准化合物质谱图进行校对,对所鉴定的化合物加以确认。
2) GC-MS分析鉴定成分 参照抑菌活性测定结果,将抑菌率高的分离组分用环己烷稀释,取1 μL进样,经气质联用机的图谱库,自动检索分析组分的质谱数据,并对检索结果参考有关标准进行核对和补充检索。
2 结果与分析 2.1 超临界CO2萃取物对桃褐腐病菌的抑制作用瑞香狼毒根超临界CO2萃取物对桃褐腐病菌表现出较强的抑制作用,其EC50值和EC90值分别为297. 6,2 701. 4 μg·mL-1 (表 1)。由表 1可见:随着萃取物浓度的提高,抑制作用增强,不同处理浓度之间的抑制作用差异显著(P<0. 05),具有明显的浓度-效应依赖关系。在本研究中,对照丙酮溶剂没有影响桃褐腐病菌菌株的生长。
随着浓度增加,瑞香狼毒根的超临界CO2萃取物对桃褐腐病菌抑制效果逐渐增强,其MIC值和MFC值分别为250,2 000 μg·mL-1 (表 2)。
经大孔吸附树脂对瑞香狼毒超临界CO2萃取物进一步分离后,共得到流分87个。经过薄层层析检测,合并具有相同Rf值的流分,最终得到14个流分。分别对这14个流分进行抑菌活性测定,结果见表 3。各流分对桃褐腐病菌的抑制效果差异明显(P<0. 05),其中抑菌率达到60%以上的有流分2,4,7,12和14,其抑菌率分别为65. 51%,83. 97%,80. 23%,75. 69%和62. 21%。
根据抑菌活性测定结果(表 3),选择对桃褐腐病菌表现出较强抑制作用(抑菌率>75%)的流分4,7和12,进行GC-MS分析鉴定,其离子流图见图 1,2和3。GC-MS鉴定结果列于表 4。从抑菌活性最高的流分4中,检测到了多种酯类物质、烯酸、谷甾醇和豆甾醇等; 从流分7和12中,分别检测到大量的3,5 -二烯豆甾烷和角鲨烯。
超临界CO2萃取是一种高效的提取技术,目前已广泛应用于天然产物的分离提取过程。超临界CO2萃取的优势在于可以提取出较多的大分子质量极性组分,从而更加真实、全面地反映药材的化学组分(凌建亚等,2006)。本研究采用这种技术,从瑞香狼毒根中提取得到了对桃褐腐病菌具有较高抑制作用的活性成分,在其浓度为2 000 μg·mL-1时,抑菌率可达88. 71%;经毒力回归方程计算,EC50值和EC90值分别为295,2 713 μg·mL-1 (表 1); MIC值和MFC值分别达到250,2 000 μg· mL-1 (表 2)。经大孔吸附树脂对超临界CO2萃取物分离后,流分4,7和12在浓度为2 000 μg·mL-1时,抑菌活性最强,其抑菌率分别达到83. 97%,80. 23%和75. 69%。桃褐腐病是桃(Amygdalus persica)、李(Prunus salicina)、杏(Amygdalus vulgaris)等核果类果实的主要病害,常引起贮藏、运输和销售中的大量烂果,损失严重(王连荣,2000)。为了能有效地减少桃果实腐烂引起的损失,长期以来生产中多以化学防治为主,而采后大多采用低温、气调、减压等物理措施并配合使用化学农药来进行褐腐病的防治(李喜宏等,2000)。化学药剂的频繁使用导致病原菌产生了抗药性,从而降低了防治效果(Holmes et al., 1999),而且长期使用高毒、高残留的农药不但会危害人体健康,还容易造成环境污染。本研究是以瑞香狼毒为原料研制开发桃褐腐病植物源杀菌剂工作的良好的开端。
为了进一步研究瑞香狼毒根超临界CO2萃取物中的活性成分,笔者用大孔树脂(macroporous resin)柱对超临界CO2萃取物进行了分离。大孔树脂是一类有机高聚物吸附剂,近年来广泛应用于天然产物的分离(Zhang et al., 2008)。大孔树脂具有优良的吸附能力以及高效、无害、价格便宜、易再生使用等特性,因此非常适于工业化大规模地分离活性成分。本研究中,利用大孔树脂分离到具有抑菌活性的化学成分,说明用这种分离方法能够应用于从瑞香狼毒根中大规模地分离抗菌物质。
瑞香狼毒的根含有大量的活性成分,主要是黄酮类、香豆素类、二萜类、木脂素及苯丙烯醇苷类等,具有抗癌、抗病毒、免疫调节、抗有丝分裂等活性(张慧文等,2006; 于保青等,2008)。本研究通过GC /MS分析鉴定了抑菌活性较强的4,7和12等3个流分,发现它们主要含有己二酸二(2 -乙基己基)酯、谷甾醇、7 -甲基- 8 - Z -十六碳烯酸、9 -十六碳烯酸十六酯、邻苯二甲酸二异辛基酯、豆甾醇、3,5 -二烯豆甾烷、角鲨烯等成分(表 4)。从流份7与12中主要检测到了3,5 -二烯豆甾烷和角鲨烯这2种化学成分。角鲨烯具有较强的生物活性,广泛应用于医药、美容、化妆品等各个领域(赵振东等,2004)。3,5 -二烯豆甾烷是一种植物甾醇,具有溶解纤维蛋白和抗炎活性(张咏梅,2008)。植物甾醇是以环戊烷全氢菲为骨架的一类重要的天然甾醇资源,也是非常重要的天然活性物质,主要含有β -谷甾醇、菜油甾醇、菜籽甾醇、豆甾醇等多种成份(肖友国,2006)。它们具有良好的抗氧化性,在医药、化妆品、动物生长剂、纸张加工、印刷、纺织、食品等领域有着广泛用途(Blair,2000; Kevin et al., 2001)。3,5 -二烯豆甾烷曾在苜蓿的乙酸乙酯层析物和翅果油树中检测到(安媛等,2006; 张咏梅,2008),而在瑞香狼毒中则是首次报道。从抑菌活性最强的流分4中检测到了谷甾醇、豆甾醇及多种酯类和烯酸类等活性物质,反映了这些化学成分是流分4抑菌活性的物质基础。
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