林业科学  2012, Vol. 48 Issue (2): 162-168   PDF    
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文章信息

尹淑艳, 李波, 郭慧玲, 李会, 李杨, 孙绪艮
Yin Shuyan, Li Bo, Guo Huiling, Li Hui, Li Yang, Sun Xugen
基于mtDNA-COI基因序列的针叶小爪螨种群遗传结构影响因素分析
An Analysis of Factors Affecting Population Genetic Structure of Oligonychus ununguis Based on the Mitochondrial COI Gene Sequences
林业科学, 2012, 48(2): 162-168.
Scientia Silvae Sinicae, 2012, 48(2): 162-168.

文章历史

收稿日期:2010-05-10
修回日期:2010-12-08

作者相关文章

尹淑艳
李波
郭慧玲
李会
李杨
孙绪艮

基于mtDNA-COI基因序列的针叶小爪螨种群遗传结构影响因素分析
尹淑艳1, 李波2, 郭慧玲3, 李会1, 李杨1, 孙绪艮1    
1. 山东农业大学植物保护学院 泰安 271018;
2. 泰安市林业局 泰安 271000;
3. 泰山风景名胜区管理委员会 泰安 271000
关键词:针叶小爪螨    COI    寄主植物    地理隔离    农药胁迫    种群分化    
An Analysis of Factors Affecting Population Genetic Structure of Oligonychus ununguis Based on the Mitochondrial COI Gene Sequences
Yin Shuyan1, Li Bo2, Guo Huiling3, Li Hui1, Li Yang1, Sun Xugen1    
1. College of Plant Protection, Shandong Agricultural University Tai'an 271018;
2. Forestry Bureau of Tai'an Tai'an 271000;
3. Management Committee of Mount Tai Scenic Spots and Historical Relics Tai'an 271000
Abstract: In order to understand effects of host plant, geographical distance and pesticide stress on the genetic structure of the spruce spider mite (Oligonychus ununguis), different populations of the mite were used for analyzing the sequence variation of the mitochondrial cytochrome oxidase I gene (COI) segment. Genetic differentiation was very small in the mites collected from different species of Castanea mollissima, Quercus acutissima, Q. variabilis, Q. dentate, which distributed in a narrow range(3 - 500 m), and in the mites from the same species of host plants that distributed in a larger area(25 km). These populations were clustered in the same branch of the NJ phylogenetic tree and the genetic distance between them was 0 - 0. 001. There was significant genetic differentiation of the mites collected on Q. variabilis from two different districts, Taian district of Shandong Province and Jiaozuo district of Henan Province. The mites from these two provinces were distributed in two different branches of the NJ phylogenetic tree. The population suffered long period pesticide stress had significant genetic differentiation from the population that had not experienced the pesticide stress, although they were collected from the same host species of Q. acutissima away from about 500 m. Genetic distance between the two populations was 0. 015, and they were clustered in the different branch. of the NJ phylogenetic tree. Results showed that geographical isolation and pesticide stress were possibly the important factors affecting population differentiation of O. ununguis.
Key words: Oligonychus ununguis    COI    host plant    geographical isolation    pesticide stress    population differentiation    

寄主植物、地理距离、农药胁迫、生境片段化等是影响种群遗传结构和进化的重要因素(Harrison et al., 1996; Hutchinson et al., 1999; Knutsen et al., 2000;罗育发等,2006; 褚栋等,2008)。

许多有关昆虫与植物间关系的研究发现植食性昆虫具有通过缩小或扩大其寄主范围或转移到新寄主上的进化潜力(Via,1990),这种现象可能使种群间产生完全的生殖隔离进而导致与寄主有关的物种形成。寄主型已在多种植食性节肢动物中有报道(Berlocher et al., 2002)。有些情况下,寄主型间的差异与寄主物候学和交配行为有关,如苹果实蝇(Rhagoletis pomonella) (Filchak et al., 2000)。有研究表明:物种内的差异是由取食偏好造成的(Claridge et al., 1985),专化性的程度影响种的分布和种群结构,可能导致甚至在同域条件下的新物种形成(Jaenike,1990)。螨类中这方面研究较多的是叶螨科(Tetranychidae)、瘿螨科(Eriophyidae),如取食偏好在二斑叶螨(Tetranychus urticae) (Fry,1999; Gotoh et al., 1993; Navajas et al., 2000)、柑橘全爪螨(Panonychus citri) (Osakabe et al., 1996)中已有报道。对取食不同寄主植物的柑橘全爪螨的进一步研究发现了一个新的姊妹种P. osmanthi(Ehara et al., 1996)。基于等位酶变异的二斑叶螨种群遗传结构的研究发现:采集于柑橘(Citrus reticulata)上的二斑叶螨与其他寄主植物上的二斑叶螨之间存在明显差异(Tsagkarakou et al., 1998)。

有限的扩散能力和生境的片段化会促进种群间的遗传差异。叶螨是一类无翅、体型微小的节肢动物,其扩散方式主要有2种:爬行和随风扩散。短距离的扩散主要靠爬行,远距离的扩散主要靠气流(Osakabe et al., 2005)。因此,地理距离可能成为限制基因交流的主要因素。在温室和田间2种栖境下的二斑叶螨的遗传差异均与地理距离有明显的相关性(Tsagkarakou et al., 1998)。地理距离是影响土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani)种群遗传结构的一个因素(Baily et al., 2004)。有杂草的果园可以为取食多种植物(包括草本和木本)的植食性螨类如二斑叶螨提供连续的生境。采集于50 m2范围内草本和木本植物上的二斑叶螨是随机交配群体,而相隔150 m的群体则不然,由此可见,相邻植物间的扩散主要靠爬行来完成(Tsagkarakou et al., 1997)。然而,对于只取食某一种果树的螨来说,果园的生境是片段化的。与连续的生境相比,片段化的生境可能会限制叶螨的基因交流。柑橘全爪螨的寄主主要是柑橘,在柑橘园中通常每隔几米栽1株。与其他既取食草本又取食木本植物的叶螨相比,柑橘全爪螨在寄主之间的扩散会面临更大的饥饿危险,这样寄主植物间有限的基因交流会导致小范围内种群间差异。Osakabe等(2005)推测柑橘全爪螨不仅在远距离的种群间存在差异,而且在小范围内如一个小树林内也会存在差异,他们的研究也证实了这一点。

除了受到自然因素的影响外,生物的遗传多样性也会受到人为因素如施用农药的影响。农药施用会在较小的地理范围内影响种群遗传组成,迫使种群对局部环境产生适应性变异,以保持其优势种地位(Gurdebeke et al., 2003)。

分析生态因素、人为因素等对植食性节肢动物遗传分化的影响不仅在研究种群遗传结构和生活史特征进化上有重要的理论意义,而且对有害生物的治理也有重要指导作用。针叶小爪螨(Oligonychus ununguis)俗称板栗红蜘蛛、杉木红蜘蛛,属叶螨科小爪螨属(Oligonychus),该螨广泛分布在亚洲、欧洲、澳洲、美洲的众多国家。据已有资料记载,其寄主植物达65种以上,包括松科(Pinaceae)、柏科(Cupressaceae)、杉科(Taxodiaceae)等针叶树和壳斗科(Fagaceae)等阔叶树(Przygoda,2001; Shinkaji,1975;王慧芙,1981; 王源岷等,1989; 孙绪艮等,2000)。该螨在我国北方是板栗(Castanea mollissima)的重要害螨,严重影响板栗的产量及品质(孙绪艮等,1994); 浙江、安徽、江西等地,杉木(Cunninghamia lanceolata)受害较重(张时敏,1983)。目前,有关针叶小爪螨种群遗传结构方面的研究还未见报道。为了了解生境片段化、寄主植物、地理距离、农药胁迫等因素对针叶小爪螨种群遗传结构的影响,本研究分析比较了针叶小爪螨不同种群的mtDNA-COI差异。

1 材料与方法 1.1 材料

样本的采集信息见表 1,其中TSQV与TSQD的采样地点相距约3 m,TSCM与TSQA的采样地点相距约50 m,TSCM,TSQA与TSQV,TSQD的采样地点相距约500 m,CLCM与CLCMA的采样地点相距约500 m,TSCM,CLCM,XJCM的采样地点相距约25 km,TSQV与HNQV的采样地点相距约720 km。TSCM,TSQA,TSQV,TSQD,XJCM,CLCM,HNQV的采样植株连续多年未进行化学防治,CLCMA的采样植株每年都进行常规化学防治。

表 1 针叶小爪螨不同种群的采集信息 Tab.1 Collection data of different populations of O. ununguis

样本采集时,剪取带有针叶小爪螨的枝条,放入聚乙烯塑料袋中带回实验室。远距离采集时,用吸水的脱脂棉包裹枝条基部,可延长枝条的保湿时间,防止叶片失水,叶螨逃逸。带螨枝条带回实验室后,在解剖镜下用小毛笔挑取雌成螨于盛有无水乙醇的试管中,然后置于- 20 ℃冰箱中保存待用。

1.2 DNA提取

从单头雌成螨中提取总DNA,方法参照游中华等(2007),稍加改变:将单头雌成螨浸入蒸馏水中除去酒精,移入TE缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-HCl,1 mmol · L-1 EDTA,pH 8. 0)中浸泡1 h,然后将虫体转移至200 μL提取液(10 mmol· L-1 Tris-HCl,1 mmol· L-1 EDTA,1% SDS,pH 8. 0)中充分研磨; 加入2. 5 μL蛋白酶K (20 mg· mL-1)于研磨后的匀浆液中,混匀后于57 ℃水浴中消化3 h; 加等体积苯酚/氯仿(1: 1)于反应混合液中,混匀,离心10 min (4 ℃,10 000 r·min-1)。吸取上清用等体积氯仿按上法再抽提1次。吸取上清,用1 /10体积3 mol· L-1 NaAc(pH 5. 2)和2倍体积100%冰冻乙醇沉淀1 ~ 3 h后,离心30 min (4 ℃,12 000 r· min-1),弃上清,晾干后用50 μL无菌双蒸水溶解,该DNA溶液保存在-20 ℃,用于PCR扩增。

1.3 PCR扩增

1) 所用引物:   ① 5'-TGATTTTTTGGTCACCCA  GAAG-3';   ②   5'-TACAGCTCCTATAGATAAAAC-3' (Navajas et al., 1998)。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

2) PCR反应体系及条件  采用25 μL标准反应体系,其中含有2 μL DNA溶液、2. 5 μL 10 × PCR聚合酶缓冲液、0. 5 μL(10 mmol· L-1) dNTP混合液、引物(10 μmol · L-1)各0. 5 μL、Taq聚合酶(2. 5 U · μL-1,北京全式金生物技术有限公司) 0. 5 μL、超纯水18. 5 μL。反应条件为: 94 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,45 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,重复35个循环后72 ℃保温10 min。

扩增产物用含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 测序和序列分析

PCR产物的纯化与测序由上海桑尼生物科技有限公司完成。为提高序列的精确度采用正反链双向测序。

序列使用BioEdit (Version 7. 0)软件中的ClustalW进行比对,辅以人工校正。用MEGA4. 0基于Kimura-2-Parameter模型计算遗传距离,以O. afrasiaticus (GenBank登录号: DQ656482)作为外群,采用邻接法(NJ)构建系统树,系统树各分支的置信度(bootstrap)进行1 000次的重复检验。

2 结果与分析 2.1 针叶小爪螨不同种群的mtDNA-COI序列及其差异

测得针叶小爪螨8个种群62个个体的线粒体COI基因中央部分的一个片段,长度均为410 bp。通过与GenBank中Ixodes acutitarsus的mtDNA-COI基因全序列(GenBank登录号: AB105166)进行比较,得知序列的第1个碱基是前1个氨基酸密码子的第2位点,为分析方便,将第1,2个碱基去除,以408 bp长度的序列进行分析。碱基组成上,A,T,C,G的平均含量分别为30. 2%,43. 9%,11. 3%,14. 7%。A + T含量较高,为74. 1%,其中密码子第1位点A + T含量为66. 1%,第2位点A + T含量为64. 7%,第3位点的A + T含量最高,达到91. 2%。第3位点G的含量最低,平均为3. 6%,T的含量为最高,达到59. 5%。这表明密码子的碱基使用频率存在明显的偏向性,与其他叶螨和昆虫的线粒体DNA碱基组成一致(Navajas et al., 1996; Simon et al., 1994)。

经比对,所有序列410个位点中没有插入/缺失,共有11个变异位点,其中包括2个单一多态位点(singleton variable sites)、9个简约信息位点(parsimony informative sites) (图 1)。这11个位点的变异都没有引起任何氨基酸水平的变化,因为所有变异位点都位于密码子第3位点。密码子第3位点的碱基替换绝大部分不会引起所编码氨基酸的变化,因此受到的限制少,变化更自由些,这是所有编码蛋白质基因的一个典型特点(Salomone et al., 1996),已报道于多种生物(Toda et al., 2000)。

图 1 针叶小爪不同种群的COI序列比对 Fig.1 Alignment of COI sequences of different populations of O. ununguis TSCM,TSQA,TSQD,XJCM,CLCM,CLCMA均只有1个单倍型,只列出1条序列,图 2同。 The populations of TSCM,TSQA,TSQD,XJCM,CLCM and CLCMA are all have only one kind of haplotype,so only one sequence is listed respectively. The same for Fig. 2.

在获取的序列中共定义了5个单倍型,单倍型的分布情况如表 2。H1为山东泰安地区的TSCM,TSQA,TSQV,TSQD,XJCM,CLCM所共享。CLCMA和HNQV各自拥有特有的单倍型(H5为CLCMA所特有,H3和H4为HNQV所特有),与其他种群间没有共享单倍型。

表 2 单倍型在针叶小爪螨不同种群中的分布 Tab.2 Distribution of haplotypes in populations of O. ununguis
2.2 寄主植物在针叶小爪螨遗传分化中的作用

如果存在寄主适应,则取食不同寄主植物的种群间的基因交流会受到限制,结果,同一种寄主植物上的种群与不同寄主植物上的种群相比,会表现出更高的遗传相似度(Tsagkarakou et al., 1998)。针叶小爪螨不同种群在基于COI序列构建的NJ树上(图 2)没显示出任何与寄主植物有关的聚类,采自泰安地区不同寄主植物(板栗、麻栎、栓皮栎、槲树)上的螨(未施药)聚在一起。另外从序列比对中也可以看出,采自泰山小范围内(3 ~ 500 m)不同寄主上的针叶小爪螨种群(TSCM,TSQA,TSQV,TSQD)序列几乎完全一致,只有TSQV1有1个碱基不同于其他序列,而这1个碱基的差异也不排除是由测序误差引起的。

图 2 针叶小爪螨不同种群及O. afrasiaticus基于COI序列构建的NJ树 Fig.2 NJ tree of different populations of O. ununguis and O. afrasiaticus based on COI sequences
2.3 地理距离在针叶小爪螨遗传分化中的作用

基于Kimura-2-Parameter模型计算的针叶小爪螨不同种群间的遗传距离见表 3。地理距离在3 m (TSQV与TSQD)、50 m (TSCM与TSQA)、500 m (TSCM,TSQA与TSQV,TSQD)、25 km (TSCM,CLCM,XJCM)的范围内,种群间的遗传差异很小,遗传距离为0 ~ 0. 001 (CLCM与CLCMA例外,见2. 4)。当地理距离达到720 km时,种群间(HNQV与其他种群)的分化程度加大,遗传距离为0. 014 ~ 0. 015。河南栓皮栎种群与山东泰安不同种群间无共享单倍型,另外二者在聚类图上聚在不同的支,由此可见地理隔离可能是导致针叶小爪螨不同种群间遗传分化的重要因素之一。

表 3 针叶小爪螨不同种群间的遗传距离 Tab.3 Genetic distance among different populations of O. ununguis
2.4 农药胁迫在针叶小爪螨遗传分化中的作用

CLCM与CLCMA采自同一种寄主植物-板栗,采样植株相距约500 m,但CLCM的采样植株为路旁散生板栗,多年无人管理,而CLCMA的采集地为集约管理的板栗林,每年都进行常规化学防治。由图 2表 3可见: CLCM和CLCMA之间的遗传差异较大,在NJ树上聚在不同的分支上,二者间的遗传距离为0. 015,远远超过TSCM,TSQA与TSQV,TSQD间的遗传距离(TSCM,TSQA与TSQV,TSQD的采样地点相距约500 m)。这说明,农药胁迫会影响针叶小爪螨的种群遗传结构。

3 讨论

柑橘全爪螨的寄主主要是木本植物柑橘,在柑橘园中,柑橘全爪螨的生境是不连续的。生境片段化影响柑橘全爪螨的种群遗传结构。Osakabe等(2005)基于等位酶、微卫星、mtDNA-COI的研究发现,同一柑橘林内不同树体上的柑橘全爪螨遗传差异明显,且大于不同柑橘林间的差异。针叶小爪螨与柑橘全爪螨相似,其寄主植物全是木本植物,其生境也是不连续的,但本研究却未得到与柑橘全爪螨相似的种群遗传结构。在泰山针阔叶混交林内,从小范围(3 ~ 500 m)不同寄主上采集的针叶小爪螨,其mtDNA COI序列同源性几乎为100%。出现这种不一致的原因,可能与种群密度有关。种群密度增大会促进叶螨的扩散(Hussey et al., 1963),但在叶片严重恶化之前,叶螨通常会继续停留在原叶片上取食、交配(Hinomoto et al., 1995)。Tsagkarakou等(1998)研究发现:二斑叶螨的局部遗传结构与种群密度有关,高密度下,采自小范围(小于100 m)不同寄主植物上的样本无差异; 而在低密度下,样本间存在明显差异。本研究中,样本的采集时间在7月上、中旬,而此时期是一年中针叶小爪螨种群数量最大的时期(孙绪艮等,1992),采样树体上每叶雌螨平均20头以上。针叶小爪螨从4月中下旬越冬卵孵化开始危害起,到7月上、中旬,由于危害时间比较长,加上种群数量的急剧增长,叶片营养恶化,可能加速了针叶小爪螨在不同树体间的主动扩散,造成不同树体上螨的同质化。而Osakabe等(2005)关于柑橘全爪螨的研究中,螨的密度比较低,每叶雌螨平均0. 27 ~ 3. 95头。该螨的爬行扩散能力有限(Osakabe et al., 1999)加之低的种群密度,使得不同树体间螨的基因交流减少,因而出现同一柑橘林内不同树体上螨的遗传差异明显的现象。

寄主型是指由于适应某一特定寄主而与同一种中其他种群间产生部分生殖隔离的种群(Diehl et al., 1984),已在多种昆虫中有报道(Via,1990; 2001)。由于寄主型的形成,同域物种形成会出现于多种多食性昆虫中。因此,估计不同寄主植物上同域种群间的基因交流大小对理解同域物种的形成是非常重要的。Nishimura等(2005)研究发现:绣球(Hydrangea macrophylla)上的神泽氏叶螨(Tetranychu kanzawai)与同域其他寄主植物上的神泽氏叶螨间的基因流非常有限,而木通(Akebia quinata)和海州常山(Clerodendrum trichotomum )上的神泽氏叶螨却几乎是一个随机交配群体,作者认为神泽氏叶螨种群间的遗传差异是由寄主植物而不是种群间的地理距离造成的,该螨可能产生了同域寄主型。针叶小爪螨是多食性害螨,其寄主植物包括多种针、阔叶树种,针、阔叶树种群(浙江杉木种群和山东板栗种群)之间存在很大程度的遗传分化(另文发表),但二者之间的分化是由寄主还是地理隔离造成的,还在进一步研究之中。本研究中采自4种不同阔叶树寄主(板栗、麻栎、栓皮栎、槲树)上的针叶小爪螨种群在NJ树上没显示出任何与寄主植物有关的聚类,可能因为板栗、麻栎、栓皮栎、槲树属于同一个科,亲缘关系比较近,对针叶小爪螨的适合度比较一致。但与取食其他3种寄主植物的针叶小爪螨相比,取食槲树的针叶小爪螨从幼螨发育到成螨的历期最长,雌成螨寿命最短,平均单雌产卵量最少(尹淑艳等,2002),这可能与槲树叶片的物理结构及化学组成有关(尹淑艳等,2002; 刘学辉等,2007) :槲树叶片密被褐色星状毛,对针叶小爪螨的取食会产生一定阻碍作用,与其他3种寄主植物相比,槲树叶片中抗虫物质单宁的含量最高,而游离氨基酸的总量、全氮含量、可溶性总糖的含量最低。但通过mtDNA-COI基因的研究表明:槲树叶片的理化性状对针叶小爪螨的影响还未造成该螨槲树种群与其他寄主种群间的遗传差异。

地理隔离是种群分化和物种形成的重要影响因素,本研究中,分5个等级(3 m,50 m,500 m,25 km,720 km)分析了地理距离对针叶小爪螨种群遗传结构的影响,发现在25 km范围内,种群间差异很小,而地理距离相隔720 km的泰安地区各种群(未施药)与河南栓皮栎种群间却出现了较明显的差异,二者在聚类图上明显地聚为不同的支,说明地理隔离可能是导致针叶小爪螨不同种群间遗传分化的重要因素。

孙继英等(2007)研究表明:长期农药胁迫导致狼蛛优势种群遗传多样性降低。拟水狼蛛(Pirata subpiraticus)和拟环纹豹蛛(Pardosa pseudoannulata)在长期农药胁迫下,12S rRNA基因第3结构域序列发生了明显改变(罗育发等,2006)。农药使用影响黄曲条跳甲(Phyllotreta striolata)地理种群的分化(傅建炜等,2008)。室内环境下噻虫嗪在导致B型烟粉虱(Bemisia tabac)种群产生抗药性的同时,还改变了其群体遗传结构,化学农药的施用可能是B型烟粉虱群体遗传结构的重要影响因素之一(褚栋等,2008)。目前生产上对针叶小爪螨的防治主要依赖于化学防治。本研究结果表明:长期农药胁迫会影响针叶小爪螨在较小地理范围内(500 m)的种群遗传组成。

总之,本研究结果表明地理隔离、农药胁迫可能是针叶小爪螨种群分化的重要影响因素。但针叶小爪螨在国内分布较广,寄主植物种类较多,所处生境多样,而本研究取样范围有限,因此结果还不足以准确判断针叶小爪螨在全国内的遗传分化情况。下一步将扩大取样范围,结合其他的分子标记,以期较为全面地了解针叶小爪螨的种群遗传结构。

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